专利名称：一种应用于红霉素发酵的糖醇混合补料新方法
一种应用于红霉素发酵的糖醇混合补料新方法技术领域
本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及一种应用于红霉素发酵的糖醇混合补料新方法。
背景技术：
红霉素是由红色糖多孢菌经过次级代谢合成的十四元大环内酯类抗生素，主要应用于治疗革兰氏阳性细菌感染。其作用机理为通过与细菌核蛋白体50S亚基核糖体结合抑制转肽作用和信使核糖核酸(mRNA)移位杀死致病细菌。红霉素是全球销量居前的抗感染药物，全球销售额达到上百亿美元。随着以红霉素为原料的新型半合成红霉素药物如罗红霉素、阿奇霉素和克拉霉素等销售额的连年猛增，带动了红霉素需求的不断增加，红霉素原料药的生产和销售日趋活跃。
目前大多数生产厂家采用黄豆饼粉和淀粉作为主要的培养基成份。在此配方的基础上添加少量的速效氮源能够促进红色糖多孢菌菌体的前期生长并有效地提高红霉素的发酵水平。在发酵过程中随着淀粉的消耗，菌体会被迫水解利用黄豆饼粉。黄豆饼粉的脱氨基作用引起PH的升高。为了控制发酵过程的pH值，可以采用补加酸碱的方法控制发酵过程 pH。随着工艺的逐渐完善，在红霉素发酵工业中，普遍采用在发酵进入菌体生长稳定期后开始采用流加葡萄糖控制PH值的发酵工艺，结果显示该方法不仅优于单纯补加酸碱控制pH 值的方法，而且比依据发酵液中残糖的葡萄糖补加工艺更能提高最终红霉素发酵水平。
除了在发酵过程中补加葡萄糖外，豆油和正丙醇作为红霉素合成前体的重要来源，也是过程补料的重要内容。然而，一直以来尚未形成统一的豆油和正丙醇的补加方法。 一些厂家完全根据多年的生产经验来进行豆油和正丙醇的补料工艺。这些方法缺少一定的理论依据，在实施中多依靠有经验的技术人员的分析判断。
因此，本领域迫切需要深入研究红霉素的发酵机制，优化红霉素的发酵工艺，有效提闻红霉素的广量。发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于红霉素发酵的糖醇混合补料新方法。
在本发明的第一方面，提供一种采用pH值反馈控制法进行红霉素发酵的方法，所述方法包括设定PH预设值6. 95-7. 1(如6. 95,7.0,7. 05,7. I)，进行三阶段发酵
第一阶段培养红色糖多胞菌至菌体生长稳定期，当发酵液pH值高于预设值时， 开始第二阶段；
第二阶段当发酵液pH值高于预设值时，通过补加葡萄糖产生有机酸来控制pH值在预设值；同时补加正丙醇，使加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量满足菌体生产所需； 当正丙醇补加速率低于0.07-0. OSgL-1IT1 (如O. OTegL-1^1)时，开始第三阶段；
第三阶段维持正丙醇补加速率0.07-0. OSgL^r1 (如O. (^egL—V1);补加葡萄糖使发酵液pH值在预设值。
在本发明的一个优选例中，所述方法的第二阶段中，加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量以每12小时补加碳原子绝对量来计算，在O. 25-0. 35mol/L。在本发明的另一优选例中，加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量以每12小时补加碳原子绝对量来计算，由第二阶段起始时的O. 26mol/L增加到O. 31mol/L,之后下降(较佳地,下降至O. 24mol/L)。在本发明的另一优选例中，所述的pH预设值为7. 0-7. 05。在本发明的另一优选例中，所述方法的第二阶段中，每一时间点加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量等于以下发酵方法a相应(或相同)时间点发酵液中葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量
当发酵液pH值高于6. 9时补加葡萄糖，平均葡萄糖补加速率O. liOg-rV1 ;同时补加正丙醇，平均正丙醇补加速率O. 058g · T1IT1至发酵结束。在本发明的另一优选例中，所述的方法中，正丙醇补加速率=(发酵方法a葡萄糖补加速率X6+发酵方法a正丙醇补加速率X3)-葡萄糖补加速率X6]+3。在本发明的另一优选例中，发酵的温度在34±1°C。在本发明的另一优选例中，发酵的溶氧30±5%。在本发明的另一优选例中，发酵的初始培养基包括淀粉35±5g/L，糊精5±lg/L，黄豆饼粉 33 ± 5g/L，玉米浆 18 ± 2g/L，NaCl2 ±O. 4g/L，CaC037 ± I. 5g/L，豆油 5 ± lmL/L。在本发明的另一优选例中，发酵的初始培养基还包括消泡剂。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I、红色糖多胞菌的接种-发酵流程。图2、高低补糖下对红霉素发酵的影响。▼线表示模式a补糖曲线(预设pH=6.9),▽线表示模式b (预设pH=7. 3)下的补糖曲线， 线表示模式a下红霉素合成曲线，〇线表示预设PH=7. 3下的红霉素合成曲线。图3、在高低补糖下溶氧曲线比较。图4、在图2-3的基础上设计的四种总碳原子相等原则的补料模式，显示了补糖和补醇速率的变化，即在不同阶段控制葡萄糖和正丙醇的比例。图5、根据模式I-模式4工艺下获得的过程发酵参数。图6、不同补加模式下的摄氧速率OUR和呼吸商RQ。图7、葡萄糖和正丙醇在代谢中的去向考察。
具体实施例方式为了解决现有技术中红霉素发酵过程中补糖补醇以经验为主、缺乏理论依据的问题，本发明从葡萄糖和正丙醇之间的相互利用间的关联性为出发点，揭示了一种糖醇混合补料新方法。与传统补加工艺相比，本发明的补料方法通过控制不同发酵阶段的补糖速率来控制正丙醇的利用效率，同时依据葡萄糖补加速率对正丙醇补加速率进行调控，可以很好地控制菌体处于适于红霉素合成的最佳生理状态。
本发明的方法基于以下原理通过在一定范围内调控发酵过程中的pH设定值，能够有效地改变葡萄糖的补加速率，当葡萄糖补加速率降低时，正丙醇的利用速率会增加。正丙醇是红霉素合成前体的重要来源，其利用率增加则使得红霉素产量增加。基于此，研究了改变PH设定值调控补糖速率以及依据葡萄糖补加速率控制正丙醇补加速率的新型混合补料模式，实现了红霉素发酵水平的提高。
葡萄糖和正丙醇在代谢中的去向如图7所示，葡萄糖可以合成红霉素前体，正丙醇也可以合成红霉素前体。葡萄糖代谢要经过EMP、TCA等代谢途径，在这些途径中，使得大部分葡萄糖以二氧化碳的形式释放掉，并没有很好的合成红霉素。而正丙醇代谢与红霉素合成更直接相关，正丙醇可被菌株利用的利用率高。因此，本发明人本着提供足够的总碳原子量且提高正丙醇的加料、葡萄糖的加入仅满足控制PH的原则，开发了本发明的高效产红霉素的方法。
如本文所用，所述的“菌体生长稳定期”是指微生物经过一段时间的生长，由于培养基中营养物质已不多，只能维持菌体基本新陈代谢和合成次级代谢产物的需要，因此菌体的比生长速度基本为零，菌体浓度基本上处于恒定。
作为本发明的优选方式，本发明人依据葡萄糖和正丙醇的碳原子总和不变原则提高正丙醇补加速率。在碳原子总和不变原则下，葡萄糖平均补加速率降低，正丙醇平均补加速率提高，红霉素产量大幅增加。与传统的单纯依据PH补糖和恒速补醇策略相比，该方法充分考虑到葡萄糖和正丙醇的利用关系，保证了菌体持续快速的合成红霉素产物。
本发明的方法采取三阶段发酵法，首先培养红色糖多孢基因工程菌，在发酵液中葡萄糖浓度降低到接近零时，发酵液的PH值会开始升高，当发酵液pH值高于预设值时，开始第二阶段补加葡萄糖以控制PH值。
之后，进行第二阶段，补加葡萄糖的同时启动正丙醇补加程序，根据方程计算出正丙醇的补加速率。方程为，正丙醇补加速率=(原工艺葡萄糖补加速率X 6 +原工艺正丙醇补加速率X3)-葡萄糖补加速率X6]+3，补加速率单位为mmol L^Vl0
之后，进行第三阶段，在较低的正丙醇补加速率下，补加葡萄糖控制pH值在预设值。
与传统的糖醇补料工艺相比，本发明的新型糖醇混合补料方法具有在菌体代谢活跃期补糖速率低、补醇速率高和在菌体代谢衰亡期补糖速率高、补醇速率低的特点。该特点使菌体处于一个适合于合成红霉素的生理状态，即菌体代谢活跃期降低补糖速率刺激正丙醇的利用，从而提高来源于正丙醇的红霉素前体的浓度，而在菌体代谢衰亡期提高补糖速率来减缓菌体的衰亡，同时降低补醇速率，从而降低了正丙醇对菌体的伤害作用。
在本发明的实施实例中，采用新型补加策略进行红霉素发酵，结果表明新型补料方法可以实现不同发酵阶段的葡萄糖补加速率和正丙醇补加速率的联动效应。降低葡萄糖补加速率能够显著提高正丙醇的利用速率。采用新型糖醇混合补料方法，可以实现菌体持续快速的合成红霉素，大幅度提高了最终红霉素水平。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例I、葡萄糖-正丙醇(糖醇)混合补料新方法提高红霉素发酵水平
I、培养方法和参数检测方法
菌种红色糖多胞基因工程菌ZL1004(Saccharopolyapora erythraea ZL1004) (基因型为 permK*-K-K-G+permE*-K+permA*-G)。
一级种子罐培养基淀粉 30g/L，糊精 40g/L，豆粉 20g/L，CaC035g/L, NaC13g/L, (NH4)2S042g/L。
二级种子罐培养基淀粉30g/L，糊精30g/L，豆粉30g/L，玉米浆10g/L，CaC035g/ L，消泡剂10mL/L。
发酵培养基淀粉35g/L，糊精5g/L，黄豆饼粉33g/L，玉米浆18g/L，NaC12g/L, CaC037g/L，豆油5mL/L，消泡剂(有机硅类消泡剂，购自宜兴市高时化工有限公司)56mL/L。
培养方法
采用三级发酵方式，挖取新鲜斜面菌种(IcmXlcm)接种到装有50mL培养基的 500mL种子摇瓶中，220r/min转速下34°C培养40h，之后转入15L种子罐，二级种子培养过程维持溶氧40%以上，34°C培养40h。将二级种子培养液移入50L发酵罐，34°C培养191h， 过程维持溶氧30%以上。主要流程如图I。
不同pH值设定值的研究(模式a_模式b)
发酵起始第1-34小时，随溶氧降低逐渐提高转速和通气维持溶氧在30%以上，菌体通过利用培养基提供的成分生长和繁殖。第35小时起至发酵结束，采取表I的方式设定 pH及补料。
表I
权利要求
1.一种采用pH值反馈控制法进行红霉素发酵的方法，其特征在于，所述设定pH预设值6.95-7. I，进行三阶段发酵第一阶段培养红色糖多胞菌至菌体生长稳定期，当发酵液PH值高于预设值时，开始第二阶段；第二阶段当发酵液PH值高于预设值时，通过补加葡萄糖产生有机酸来控制pH值在预设值；同时补加正丙醇，使加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量满足菌体生产所需；当正丙醇补加速率低于O. 07-0. OSgL-1IT1时，开始第三阶段；第三阶段维持正丙醇补加速率O. 07-0. OSgL^r1 ;补加葡萄糖使发酵液pH值在预设值。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，第二阶段中，加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量以每12小时补加碳原子绝对量来计算，在O. 25-0. 35mol/L。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量以每12小时补加碳原子绝对量来计算，由第二阶段起始时的O. 26mol/L增加到O. 31mol/L，之后下降。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的pH预设值为7.0-7. 05。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，第二阶段中，每一时间点加入的葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量等于以下发酵方法a相应时间点发酵液中葡萄糖和正丙醇的总碳原子的量当发酵液PH值高于6.9时补加葡萄糖，平均葡萄糖补加速率O. liOg-rV1 ;同时补加正丙醇，平均正丙醇补加速率O. 058g · T1IT1至发酵结束。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，正丙醇补加速率=(发酵方法a葡萄糖补加速率X6+发酵方法a正丙醇补加速率X 3)-所述方法葡萄糖补加速率X6]+3。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵的温度在34±1°C。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵的溶氧30±5%。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵的初始培养基包括淀粉35±5g/L，糊精 5±lg/L，黄豆饼粉 33±5g/L，玉米浆 18±2g/L，NaC12±0. 4g/L，CaC037± I. 5g/L，豆油 5±lmL/L。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵的初始培养基还包括消泡剂。
全文摘要
本发明涉及一种应用于红霉素发酵的糖醇混合补料新方法。本发明的补料方法通过控制不同发酵阶段的补糖速率来控制正丙醇的利用效率，同时依据葡萄糖补加速率对正丙醇补加速率进行调控，可以很好地控制菌体处于适于红霉素合成的最佳生理状态。
文档编号C12R1/645GK102978266SQ20121057173
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者储炬, 陈勇, 庄英萍, 张嗣良, 谭俊, 于晓光 申请人:华东理工大学