专利名称：一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米材料生物学领域。本发明涉及一种SiRNA基因载体及其制备方法，具体涉及一种纳米材料与蛋白质相结合的基因载体及其制备方法。
背景技术：
RNA干扰(RNAi)是一种存在于植物和哺乳动物细胞中的基因沉默的自然机制。 microRNA就是人们近年来刚刚发现的一类内源的具有RNA干扰活性的小RNA。这样的小 RNA被通称为小干扰RNA。将大小在21-25bpd左右的外源双链RNA (double strand RNA, dsRNA)导入细胞即可被加工成为单链的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA),与单链siRNA互补的mRNA即可被降解并抑制其翻译表达即导致基因沉默。RNAi具有较好的特异性，RNAi技术的应用将为人类疾病的基因治疗开辟一个革命性的领域，对生命科学的影响将不亚于PCR技术。目前有3种方法可以触发RNA干扰在靶细胞中引入可转录产生干扰RNA的DNA质粒；引入干扰RNA前体分子；在靶细胞中引入合成的小分子干扰RNA( siRNA)。其中，第三种方法因合成siRNA的化学反应步骤比较简单、非特异性不良反应小而引起了广泛关注。
siRNA不稳定，易被酶降解，难以被细胞吞噬，高效的转染载体对于其应用的发挥至关重要。目前利用重组病毒作为siRNA体内传递载体虽然传递效率高，但是潜在的生物安全性问题限制了其应用。非病毒型siRNA载体通常包括阳离子脂质体和阳离子聚合物两大类，阳离子脂质体转染效率高，但是其生物相容性差、细胞毒性大。阳离子聚合物虽然对质粒转染效率较高，但是对于小分子量的siRNA，其转染能力较弱。因此选择合适的siRNA 传递载体，制备安全、稳定、高效的载体/siRNA复合粒子具有重要意义。
纳米金刚石是一种碳纳米材料，生物相容性好，细胞毒性小，它与PEI等高分子相互作用，被用作基因载体。但是纳米金刚石与蛋白质相互作用 作为siRNA进入细胞的载体， 迄今为止，尚未见报告。
发明内容
本发明的目的是提供一种以纳米金刚石和鱼精蛋白硫酸盐相互作用形成的纳米颗粒作为siRNA传递载体，该载体制备过程快捷，生物安全性良好，细胞毒性较低，基因沉默效果良好，该载体与siRNA分子在水中通过静电相互作用，得到搭载了 siRNA的纳米输送载体。
本发明提供一种siRNA输送载体，其活性成分为纳米金刚石与鱼精蛋白硫酸盐通过极性相互作用形成的纳米颗粒。
一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法，其特征在于，
将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115-117nm，表面 zeta 电位为 31-34. lmv。
进一步，所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
将siRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1:3混合得到 siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂。
SiRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂在生物学领域的应用。
所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼，水溶性的鱼精蛋白硫酸盐通过氢键、表面电荷作用，吸附于纳米金刚石表面。
其中，纳米金刚石的单个粒径为4-6nm，水溶液中动力学尺寸为40_60nm，表面 zeta电位为15-17mv。纳米金刚石经过表面氧化处理，并通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，动力学尺寸为115_117nm,表面zeta电位为31-34. lmv。
从分子结构上分析，本发明提供的siRNA载体由鱼精蛋白硫酸盐和纳米金刚石通过极性相互作用而成，鱼精蛋白吸附于纳米金刚石表面。鱼精蛋白是一种水溶性的强阳离子蛋白质，能够与核酸的磷酸基团带的阴性电荷中和，产生强大的核酸亲和力。但是单独的鱼精蛋白因为分子量大，转染分子量较小的siRNA能力较弱，而纳米金刚石是一种碳纳米材料，与其它碳纳米材料相比，如碳纳米管，其毒性小，生物相容性较好，其表面富集大量的羟基、羧基、羰基等，易与鱼精蛋白中的氨基酸通过氢键和电荷作用相互吸引，形成鱼精蛋白包裹纳米金刚石的纳米颗粒，其表面带有强正电荷，易吸附siRNA形成基因转染载体。
本发明的siRNA输送载体具有良好的生物相容性，细胞毒性较小，能通过自组装方式形成纳米颗粒，具有合适的理化性质，较好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，同时拥有良好的siRNA负载能力，作为纳米载体既可以保护siRNA免受降解，又具有纳米材料特有的尺寸效应，是一种良好的siRNA基因载体。
本发明中，随着siRNA与纳米载体质量比的变化，siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白复合物平均粒径和表面zeta电位变化随之变化。在质量比siRNA:纳米金刚石/鱼精蛋白 =1:3的情况下，纳米金刚石/鱼精蛋白复合物能够与siRNA结合形成稳定的纳米复合物。
图1为ND和ND/PR0的粒径大小；
图2为ND和ND/PR0的表面zeta电位；
图3为不同质 量比下ND/PRO/siRA复合物的粒径大小；
图4为不同质量比下ND/PRO/siRNA复合物的表面zeta电位；
图5为不同比例的ND/PRO/siRNA的琼脂糖甲醛变性胶电泳图。其中A泳道为单纯的siRNA, H泳道为单纯的ND/PR0复合物，B-G泳道分别为质量比siRNA:ND/PR0=l :1,1:2, 1: 3，1: 5，1:10，1:20 的 ND/PRO/siRNA 复合物；
图6为激光共聚焦显微镜下观察到的ND/PR0负载的Cy3标记的针对EGFP的siRNA 进入EC109细胞情况。A图为白光视野；B图为364nm激发波长，454nm发射波长下蓝光视野；C图为550nm激发波长，615nm发射波长下红光视野；D图为将A、B、C三组融合得到的图像；
图7为荧光显微镜下观察到的ND/PRO/siRNA对EGFP蛋白表达的抑制情况，激发波长为488nm，400倍放大倍数。A图为ND/PRO/siRNA ( + )组，B图为加入ND/PROsiRNA (-) 组；
图8为ND/PRO/siRNA对EGFP蛋白表达的抑制效率。其中Notreat组为ND/PR0/ siRNA (-)，Naked siRNA 组为 siRNA ( + )，siRNA/NP 组为 ND/PRO/siRNA ( + )；
图9为CCK-8法测定的ND/PR0与lipofectamine 2000细胞毒性的比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
1、纳米金刚石的制备
将浓度为150mg/ml纳米金刚石(Nanodiamond, ND,以下简称ND)水凝胶(产品目录号386-8567, Tokida, Ueda, Nagano)用去离子水稀释成ND浓度为lmg/ml的水溶液,取 2ml用KQ-100DB超声清洗机(昆山市超声仪器有限公司)在IOOW功率下超声2h，得到ND浓度为lmg/ml的水溶液。
2、纳米金刚石表面氧化
将质量分数为98%硝酸和质量分数为98%硫酸按质量比硝酸硫酸=3:1混合，在 140° C下，将I中得到的ND浓度为lmg/ml的水溶液置于上述硝酸和硫酸的混合液中反应 12h，将反应产物离心，得到的沉淀用去离子水清洗并离心，重复3遍，得到的沉淀最后溶解于去离子水中并置于真空干燥箱中60° C干燥过夜，称量干燥后的产物，称量后将产物溶于去离子水中，制成ND浓度为lmg/ml的水溶液。
3、纳米金刚石-鱼精蛋白纳米复合载体的制备
取40mg鱼精蛋白硫酸盐(产品目录号PS4020,Sigma Adrich公司),溶于4ml去离子水中，超声10分钟，加速溶解，制成10mg/ml的鱼精蛋白溶液。为了制备鱼精蛋白_纳米金刚石复合物(以下简称ND/PR0)，按溶质质量比纳米金刚石鱼精蛋白=1:20，即2ml lmg/ ml的ND溶液与4ml 10mg/ml的鱼精蛋白溶液混合,镟润混合器(Scientific Industries Inc)涡旋2分钟，使鱼精蛋白与ND充分相互作用，将得到的混合溶液以13000 rpm的离心速度离心15min，去除上清液，得到离心沉淀物，并再次用去离子水重悬，离心得到沉淀，重复3次。将最终得到的离心产物冻干、称量，称量后将产物溶于去离子水中，制成ND/PR0浓度为0.6mg/ml的溶液。
4、ND、ND/PR0复合物粒径大小和表面zeta电位的检测
将3中得到的ND/PR0溶液稀释成制成0. 06mg/ml的浓度,通过Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, U. K.)测试ND/PR0的粒径和表面zeta电位。测试粒径的参数为25° C，173°散射角。表面电位的测定是基于纳米粒子在溶液中的电泳迁移率，在自动模式下测定。使用同样的方法测定未经过表面氧化处理的ND的粒径大小和表面zeta 电位，比较ND、 ND/PR0两者的粒径大小和表面zeta电位。
结果如图1、图2所示，ND在水溶液中动力学尺寸为40_60nm，表面zeta电位为 15-17mv。通过表面氧化，通过极性相互左右吸附鱼精蛋白硫酸盐后，形成的ND/PR0的在水溶液中的动力学尺寸为115-117nm,表面zeta电位为31-34. lmv。
5、siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂的制备
将40 μ g 针对增强型绿色突光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的siRNA (产品目录号siP05815122144_l，广州锐博生物技术公司)溶于500 μ I无 RNA酶的水中，制成浓度为80 μ g/ml的siRNA工作液。将冻干得到的ND/PR0溶于无RNA 酶的水中，制成浓度为0.6mg/ml的溶液，取20 μ I ND/PRO溶液(即1. 2 μ g)稀释于500 μ I 无RNase的水中，制成浓度为2. 4 μ g/ml的工作液。取10 μ I siRNA (即0.4 μ g)工作液, 按溶质质量比siRNA:ND/RP0分别为1: 1，1: 2，1: 3，1: 5，1:10，1:20取对应量的ND/PR0水溶液，将siRNA工作液加入ND/PR0工作液中，加入的过程中使用涡旋振荡仪震荡混匀，混合完毕后25。C孵育20min，制成溶质质量比siRNA:ND/RP0分别为1:1,1:2,1:3,1:5,1:10, 1:20的siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白复合物(以下简称ND/PRO/siRNA)。
6、ND/PRO/siRNA复合物粒径大小和表面zeta电位的检测
以加入的ND/RP0的质量为基准，将得到的溶质质量比siRNA:ND/RP0分别为 1:1，1:2，1:3，1:5，1:10，1:20 的 ND/PRO/siRNA 分别稀释成浓度 60 μ g/ml 的浓度，通过 Zetasizer Nano ZS (Malvern, Worcestershire, U. K.)测试复合物的粒径和表面 zeta 电位。测试粒径的参数为25° C，173°散射角。表面电位的测定是基于纳米粒子在溶液中的电泳迁移率，在自动模式下测定。
结果如图3、图4所示，表明随着ND/PRO/siRNA中ND/PR0所占比例的增加，形成的颗粒粒径大小逐渐增大，粒径大小在质量比siRNA:ND/RP0=l:5时达到最大，随后又逐渐减小。而形成的颗粒的表面zeta电位在质量比siRNA:ND/RP0=l:l时颗粒表面电荷为正电荷，然后随着ND/PRO/siRNA中ND/PR0所占比例的增加，逐渐变成负电荷，并在质量比 siRNA:ND/RP0=l:10时，再次变成正电荷。
7、纳米金刚石-鱼精蛋白负载siRNA的能力的检测
(I)、琼脂糖电泳
制备琼脂糖甲醛变性胶(琼脂糖浓度12mg/ml，100ml)，将1. 2g琼脂糖和87ml无 RNA酶水混合，加热融化，加入IOml 10 X TAE缓冲液，待胶冷却至60° C，加入3ml去离子甲醛和10 μ I 10000Χ GelRed (产品目录号41003，Biotium公司)染料，混匀后倒胶，凝固半小时后使用。
取15μ I 不同质量比(siRNA: ND/PR0 分别为 1: 1，1: 2，1: 3，1: 5，1:10，1:20)的 ND/ PRO/siRNA水溶液与5 μ I甘油混合，以纯的siRNA为对照，，于制备好的琼脂糖甲醛变性胶进行电泳，电泳条件为恒压110V，15min，观察，拍照。
结果如图5所示， 表明随着ND/PR0的量的增加，其对siRNA的负载能力越来越强， 并且在质量比siRNA:ND/PR0=l:5时候达到了临界值，所有的siRNA均被吸附在ND/PR0材料上，与此同时，当质量比siRNA:ND/PR0=l:3时，ND/PR0负载siRNA的能力也较强，结合 ND/PRO/siRNA颗粒粒径大小和表面zeta电位的随着质量比比例变化而变化的趋势，本发明选择当质量比siRNA:ND/PR0=l:3时制备出来的ND/RP0/siRNA作为评价ND/PRO/siRNA 在细胞水平上生物效应的实验对象。
(2)细胞摄取ND/PRO/siRNA复合物能力检测
1、细胞培养及接种
本发明使用食管鳞癌细胞系EC109做为细胞实验对象，EC109细胞由中国疾控中心病毒所提供，使用10% (v/v，ml/ml)胎牛血清，1% (v/v，ml/ml)谷氨酰胺的RPM 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640,产品目录号 22400089, Invitrogen 公司)培养基，于37° C，5% C02 (v/v), 70% (v/v)湿度的培养箱(赛默飞世尔科技公司)中培养。将2X IO5个EC109细胞接种于直径20mm，玻片厚度O. 13-0. 17mm的Confocal专用培养皿(产品目录号801001，无锡耐思生物科技有限公司)中，使用10% (v/v, ml/ml)胎牛血清、1% (v/v, ml/ml)谷氨酰胺、无抗生素RPM 1640培养，过夜贴壁。
2、ND/PRO/siRNA 复合物制备
按质量比siRNA : ND/PR0= 1:3的比例制备ND/PRO/siRNA复合物。本发明使用 Cy3标记的针对增强型绿色突光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)的 siRNA (产品目录号siP05815122144-l，广州锐博生物技术公司)。将40 μ g针对EGFP的 siRNA溶于Iml无RNA酶的水中，制成浓度为40 μ g/ml的工作液。将1. 2 μ g ND/PR0溶于 2ml I无RNA酶的水中，制成浓度为0. 6 μ g/ml的工作液。取40 μ I siRNA (即1. 6 μ g)工作液，加入8μ I (即4.8yg) ND/PR0溶液中，加入的过程中使用涡旋振荡仪充分混匀，混匀后25。C孵育20min。
3、ND/RP0/siRNA加入培养基及观察
将上述2中得到的ND/PRO/siRNA与Iml无血清RPM 1640培养基于1. 5ml无RNA 酶的道夫管中混匀，加入铺有EC109的Confocal培养皿中，使得siRNA的终浓度为ΙΟΟηΜ， 以只加入加入ND/PR0为阴性对照，置于37° C，5% CO2 (v/v), 70%(v/v)湿度的培养箱中培养，6h后将培养基换成10% (v/v)胎牛血清、1% (v/v)谷氨酰胺、无抗生素RPIM 1640完全培养基，于37° C，5% CO2 (v/v)，70%(v/v)湿度的条件培养24h后，去除旧培养基，PBS 洗漆细胞3遍,每个培养皿加入Iml 4% (v/v)多聚甲醒固定液,固定20min,去除固定液, PBS洗涤3遍，每个培养皿加入Iml DAPI染色液(产品目录号C1005，碧云天生物技术研究所)，染色lOmin，去除DAPI染色液，PBS洗涤3遍，每次2min。激光共聚焦显微镜(德国莱卡公司)观察siRNA在EC109细胞内的分布情况。
结果如图6所示，表明使用ND/PR0材料能够将标记了 Cy3的siRNA输送至细胞内。
ND/RP0/siRNA敲除增强型绿色荧光蛋白能力检测
本发明使用的抑制EGFP的siRNA购自于广州锐博生物技术公司，产品目录号 siP05815122144-l。
1、pEGFP-C3 质粒和 EGFP-siRNA 共转染
将6X IO4 个 EC 109 细胞接种于 24 孔板(Greiner Bio-one 公司)，使用 10%(v/v) 胎牛血清、1% (v/v)谷氨酰胺、无抗生素的RPM 1640培养基，过夜贴壁后细胞汇合度达到 70%-80%。
将lipofectamine 2000 (产品目录号11668-019, Life Technologies 公司)与表达增强型绿色荧光蛋白的质粒PEGFP-C3 (Clontech公司)质粒混合，形成pEGFP_C3/ lipofectamine 2000复合物后与ND/PRO/siRNA同时加入无血清RPM 1640培养基中， 进行细胞转染。具体步骤如下(1)、取400ng的pEGFP-C3质粒，加入50μ I Opt1-MEMs 减血清培养基(产品目录号31985070, Life Technologies公司)中；(2)、取1. 5μ I lipofectamine 2000转染试剂，加入50 μ I Opt1-MEM 减血清培养基中，室温孵育 5min ; (3)、将稀释在Opt1-MEMs减血清培养基中的pEGFP_C3质粒和lipofectamine 2000 混匀，25° C 孵育 20min ;(4)、按质量比 siRNA : ND/PR0= 1:3 的比例制备 ND/PR0/ siRNA复合物，使得siRNA终浓度为IOOnM ; (5)、将ND/PRO/siRNA复合物和pEGFP_C3/ lipofectamine 2000复合物同时加入Iml无血清、1%(ν/ν)谷氨酰胺、无抗生素的RPIM 1640培养基中，充分混匀；(6 )、去除24孔板中的旧培养基，加入(5 )中含有pEGFP_C3 和ND/PRO/ s i RNA的培养基，同时设置对照组，最后的分组情况为A :阴性对照为使用 lipofectamine *2000 只转染 pEGFP_C3，B :阳性对照为使用 lipofectamine *2000 共转染 PEGFP-C3 和 siRNA，C 组直接将纯的 siRNA 加入培养基中。37° C，5% CO2 (v/v)，70%(v/ v)湿度培养6h后换成10%(v/v)胎牛血清、1% (v/v)谷氨酰胺、无抗生素的RPM 1640培养基，继续培养24h ； (7)、24h后使用荧光显微镜(德国蔡司有限公司)于激发波长为488nm 处观察EGFP的表达情况，拍照。
结果如图7所示，从图中可明显看出ND/PR0负载的针对EGFP的siRNA能够抑制一部分EGFP蛋白的表达，进一步的说明了 ND/PR0能够有效的将siRNA输送至细胞内，并且输送至细胞内的siRNA能够有效的发挥抑制相应基因表达的作用。
2、EGFP在蛋白水平表达量的检测
为定量检测ND/PRO/siRNA对EGFP的抑制效率，提取上述I中各个实验组的总蛋白，在488nm激发波长，528nm发射波长下检测EGFP在蛋白水平的表达量，具体步骤如下(I)、配制细胞裂解液使用细胞裂解液位RIPA裂解液(强K产品目录号P0013B，碧云天生物技术研究所)裂解细胞，使用前数分钟加入PMSF (产品目录号ST506，碧云天生物技术研究所)，使得PMSF的终浓度为ImM ; (2)、去除各个孔中的培养基，PBS洗涤3遍，每个孔中加入200 μ I配置好的RIPA裂解液(强)。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触，冰上孵育 5min ;(3)、总蛋白定量使用BCA蛋白定量试剂盒(产品目录号PA115，天根生化科技有限公司)进行蛋白定量，具体步骤如下①、制备标准品使用配置好的RIPA裂解液(强)按下表对BSA标准品进行稀释②、配制BCA工作液将试剂A充分混匀，然后按照体积比试剂 A:试剂B=50:1配制IOml工作液；(D、吸取25 μ I按表I新鲜配制的标准品和提取的各实验组的总蛋白，加入96孔板(Gre iner Bio-one公司),每组5个复孔；(D、每孔中加入200 μ I BCA工作液，并充分混匀； 、加盖，37° C孵育30min后冷却至室温； 、在多功能微孔板检测仪(美国珀金埃尔默公司)于562nm处检测吸光值；⑦、由标准品制出标准曲线，并根据标准曲线计算各实验组中的蛋白含量；(4)、EGFP蛋白表达量检测取100 μ I各实验组的总蛋白，使用多功能微孔板检测仪，检测EGFP蛋白的表达量，检测条件为激发波长488nm，发射波长528nm
表I BSA标准浓度配制表
权利要求
1.一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法，其特征在于，将纳米金刚石经过表面氧化处理，得到纳米金刚石溶液；纳米金刚石溶液和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115-117nm,表面zeta 电位为 31-34.1mv。
2.根据权利要求1所述一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法，其特征在于 所述的鱼精蛋白硫酸盐来源于鲑鱼。
3.根据权利要求1所述方法制备的复合材料的应用，其特征在于将siRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1:3混合得到siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂。
4.根据权利要求1所述方法制备的复合材料的应用，其特征在于siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂在生物学领域的应用。
全文摘要
一种鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的制备方法及其应用属于纳米材料生物学领域。将纳米金刚石经过表面氧化处理后和鱼精蛋白硫酸盐溶液混合得到混合溶液；将得到的混合溶液离心后得到沉淀物，将得到的沉淀物溶解在去离子水中形成鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料，纳米金刚石通过极性相互作用吸附鱼精蛋白硫酸盐后，鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料的动力学尺寸为115-117nm，表面zeta电位为31-34.1mv。将siRNA与鱼精蛋白-纳米金刚石复合材料按照溶质质量比1:3混合得到siRNA-纳米金刚石-鱼精蛋白转染试剂。将所述染试剂在生物学应用。本发明复合材料具有良好的生物相容性，细胞毒性较小，具有合适的理化性质，稳定性好，有良好的siRNA负载能力。
文档编号C12N5/10GK103060379SQ20121057138
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者盛望, 曹敏军, 邓雄威, 曾毅, 肖向茜, 张芳 申请人:北京工业大学