专利名称：一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，特别涉及解除含有铁离子的中水对酶解木质纤维素抑制的方法，属于纤维素利用技术领域。
背景技术：
随着不可再生的石化原料的日益枯竭，以及对环境的危害，特别是燃烧排放的温室气体导致的全球变暖问题越来越受到人类的关注。以可再生的资源为原料，经过对环境无危害的过程来替代石化原料，已成为全世界都在积极探索的方向。目前，以木质纤维素生物质，例如，玉米秸杆(玉米芯)、麦秸、稻壳、谷物、芦苇、木材等原料进行可循环能源开发便成为了未来生物能源的发展方向之一，受到了全世界的普遍关注。在可在生能源产业化过 程中，纤维素酶的酶解过程在C循环和能量转换中发挥了非常大的作用。然而，纤维素酶酶解过程所面临的主要问题是酶解效率低，特别是随着国家工业化步伐的加快，环境污染问题越来越严重，特别是地下水的重金属污染。这就造成了在实际工业化中所用的中水或者原水是含有各种重金属离子的水。而纤维素酶的活性和木质纤维素都很容易受到重金属离子的干扰，导致纤维素酶在木质纤维素水解过程中不能发挥最大作用，或者木质纤维素原料受到中水或原水中金属离子作用导致酶解效率降低。中国专利文献CN101092447A (申请号20061009013L 9)公开了用如下方法制备的来源于植物秸杆料的纤维素酶解助剂将植物秸杆粉料进行水清洗、过滤得细胞壁滤渣；按配比加入含20-50MM抗坏血酸VC、质量百分比O. 1-0. 5%巯基乙醇、1-5MM PMSF、5_10MMEDTA的O. 1-0. 5M0L/L NAOH溶液；30-70°C温度下保温10-30小时，并每隔3-5小时添加一次PMSF至终浓度为1-5MM进行提取；提取完成后，离心并收集上清液；将上清液用盐酸调PH，并加入酒精充分摇匀，经放置再离心获沉淀物，再进行低温真空干燥，得占秸杆细胞壁干重10%的纤维素酶解助剂。该专利文献并未涉及到中水或原水水质对纤维素底物的影响或者对纤维素酶酶解效果的影响。中国专利文献CN101899488A (申请号201010228581. 6)公开了一种木质纤维素酶水解与膜分离单元耦合生产高浓度还原糖的方法。该方法利用微滤和超滤分离酶解液中的木质纤维素底物、水解酶和酶解产物还原糖，实现底物和酶的反复使用，并通过纳滤浓缩酶解液，制得高浓度的还原糖溶液。虽然该方法实现了纤维素水解生产还原糖的工业化，但耗水量较大，且对水质的要求较高，工业处理后的中水或原水通过上述方法无法获得还原糖，并没有涉及到中水对木质纤维素酶解的抑制作用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法术语说明本发明所述中水是指遭受金属重度污染的工业用水经处理后的再生水，水质符合GB/TT18920-2002标准,其中铁离子浓度为3 10mM。本发明的技术方案如下一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下(I)将待降解木质纤维素原料在40 50°C条件下于中水中浸泡20 28h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为2 IOmM的二硫苏糖醇(DTT)溶液中，在40 50°C条件下浸泡20 28h，然后经水或缓冲液冲洗至pH到4. 5 5. 5，烘干制得木质纤维素原料；
(3)按糖化体系重量百分比3 8%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为20 40mg/g,在40 60°C条件下进行糖化,糖化80 IOOh,制得水解液。根据本发明优选的，所述步骤(I)中待降解木质纤维素原料为微晶纤维素、玉米秸杆、麦稻、稻壳、谷物、芦華、木材、麸皮、木糖洛和/或脱木素洛。根据本发明优选的，所述步骤(2)中水为自来水或纯化水。根据本发明优选的，所述步骤(2)中缓冲液为由自来水或纯化水或由其配制的浓度O. ΟΓΟ. 05Μ, pH4. 5^5. 5的柠檬酸盐、磷酸盐或醋酸盐缓冲液。根据本发明优选的，所述步骤(3)中木质纤维素原料添加量为糖化体系重量百分比的5%。所述步骤(3)中纤维素酶酶液可采用市售纤维素酶按比例配制，优选购自宁夏夏盛实业集团有限公司的纤维素酶，该纤维素酶源于斜卧青霉(Penicillum decumbens)。有益效果经研究发现，中水中Fe离子对水解木质纤维素的抑制作用是通过对底物还原端的氧化和与酶结合两方面，目前常用的还原剂Vc或金属螯合剂EDTA只能从一方面解除Fe离子对水解木质纤维素的抑制作用；本发明通过将经中水预处理后的木质纤维素经二硫苏糖醇(DTT)浸泡，二硫苏糖醇既可以消除Fe离子对底物的氧化作用，又可以消除Fe离子对酶活的影响，大幅提高了酶的用量，降低了工业化成本，从而为利用中水水解木质纤维素奠定了基础。
图1是微晶纤维在不同处理条件下水解实验柱状结果比对图。图2是木糖渣在不同处理条件下与经过水洗后烘干水解实验柱状结果对比图。图3是木糖渣添加DTT后不经过处理后直接水解柱状结果比较图。
具体实施例方式下面通过具体实例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。原料来源微晶纤维素购自国药集团化学试剂有限公司；木糖渣来自山东龙力生物有限公司。
二硫苏糖醇购自北京鼎国生物技术有限责任公司。实施例1 3中纤维素酶酶液按如下方法制备以购自宁夏夏盛实业集团有限公司的纤维素酶，该纤维素酶是斜卧青霉经发酵后获得，糖化时酶加量为20mg-40mg/g。实施例4中纤维素酶酶液是将购自于枣庄市杰诺生物酶有限公司的酸性纤维素酶溶于醋酸钠缓冲液里，离心去除杂质后得到的。上述酸性纤维素酶的作用pH范围为4. 5 6. 2，最适作用pH4. 8 ;温度范围50 65°C，最适作用温度60°C。实施例1中的中水是符合GB/TT18920-2002标准的处理水，其中铁离子浓度在3mM0实施例2中的中水是符合GB/TT18920-2002标准的处理水，其中铁离子浓度在 5mM。实施例3、4中的中水是符合GB/TT18920-2002标准的处理水，其中铁离子浓度在10mM。实施例1一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下(I)将微晶纤维素在45°C条件下于中水中浸泡24h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为6mM的二硫苏糖醇(DTT)溶液中，在45°C条件下浸泡20h，然后经醋酸钠缓冲液冲洗至pH4. 8，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比3%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在45°C条件下进行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为11. lg/L。实施例2一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下( I)将木糖渣在40°C条件下于中水中浸泡20h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为2mM的二硫苏糖醇(DTT)溶液中，在50°C条件下浸泡28h，然后经自来水冲洗至pH到5. 0，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比5%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为20mg/g，在40°C条件下进行糖化，糖化72h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为8. lg/L。实施例3—种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下(I)将木糖渣在45°C条件下于中水中浸泡26h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为6mM的二硫苏糖醇(DTT)溶液中，在45°C条件下浸泡24h，然后经自来水冲洗至pH到4. 8，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比5%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在60°C条件下进行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为9. 8g/L。实施例4
一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下(I)将木糖渣在50°C条件下于中水中浸泡22h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为IOmM的二硫苏糖醇(DTT)溶液中，在40°C条件下浸泡24h，然后经柠檬酸缓冲液冲洗至pH到4. 5，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比8%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为30mg/g，在50°C条件下进行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为10. 4g/L。
对比例I将微晶纤维素在45°C条件下于自来水中浸泡24h，然后按糖化体系重量百分比3%的比例浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在45°C条件下进行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为11. 9g/L。对比例2处理步骤如下(I)将微晶纤维素在45°C条件下于中水中浸泡24h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素经醋酸钠缓冲液冲洗至pH4. 8，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比3%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在45°C条件下进行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为9. 4g/L。对比例3处理步骤如下(I)将微晶纤维在45°C条件下于自来水中浸泡24h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素添加ImM DTT40°C浸泡20h，烘干制得木质纤维素原料。(3)按糖化体系重量百分比5%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在45°C条件下进行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为12. lg/L。对比例4处理步骤如下(I)将微晶纤维素在45°C条件下于中水中浸泡24h，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为6mM的Vc溶液中，在45°C条件下浸泡20h，然后经醋酸钠缓冲液冲洗至pH4. 8，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比5%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在45°C条件下进行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为9. Og/L。对比例5处理步骤如下
(I)将木糖渣用自来水洗净至pH5. O后烘干，制得预处理木质纤维素；(2)按糖化体系重量百分比5%的比例将步骤(I)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为40mg/g，在45°C条件下进行糖化，糖化96h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为7. 2g/L。对比例6处理步骤如下(I)将木糖渣在50°C用自来水洗净至pH5. O后烘干，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为6mM的二硫苏糖醇(DTT)溶 液中，在40°C条件下浸泡24h，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比8%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为30mg/g，在50°C条件下进行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为8. 8g/L。对比例7处理步骤如下(I)将木糖渣用自来水洗净至pH5. O后烘干，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为6mM的Vc溶液中，在40°C条件下浸泡24h，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比8%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为30mg/g，在50°C条件下进行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为8. Og/L。对比例8处理步骤如下(I)将木糖渣用自来水洗净至pH5. O后烘干，制得预处理木质纤维素；(2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为6mM的Vc溶液中，在40°C条件下浸泡24h，然后经自来水冲洗至pH到4. 8，烘干制得木质纤维素原料；(3)按糖化体系重量百分比8%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为30mg/g，在50°C条件下进行糖化，糖化80h，制得水解液。采用HPLC测定葡萄糖浓度，水解液中葡萄糖含量为6. 9g/L。结果分析由实施例1和对比例1、2、3、4可以看出，实施例1的水解液中葡萄糖含量为11. lg/L，对比例I的水解液中葡萄糖含量为11. 9g/L，对比例2水解液中葡萄糖含量为
9.4g/L，对比例3中的葡萄糖含量为12. lg. L，对比例4的水解液中葡萄糖含量为9. Og/L,因此，可以看出通过中水处理，可以将底物水解效率降低20%，DTT处理微晶纤维素和处理后将DTT洗净或用低浓度DTT处理后不经过洗涤水解效率提高至中水处理前，并优于中水处理前，充分说明了 DTT对底物的还原作用，同时还有助于提高酶的水解效率而Vc组效果略差(图1)。由实施例2 4和对比例5可以看出，实施例2 4的水解液中葡萄糖含量分别为8. lg/L、9. 8g/L、10. 4g/L，对比例5的水解液中葡萄糖含量为7. 2g/L，因此，采用DTT处理木糖渣对底物的还原作用，该方式提高水解效果为12. 5%, 36%, 44% (图2)。
有实施例3和对比例6、7、8中水解液中葡萄糖含量为9. 8g/L，8. 8g/L，8. Og/ L, 6. 9g/L可以看出，木糖渣底物经6mM或IOmM的二硫苏糖醇(DTT)溶液浸泡后，如果不经水或缓冲液冲洗，直接采用纤维素酶处理，会较为明显的影响纤维素酶对纤维素的降解效果，并且Vc组经过不洗与洗效果都不佳(图3)。
权利要求
1.一种利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下 (1)将待降解木质纤维素原料在40 50°C条件下于中水中浸泡20 28h，制得预处理木质纤维素； (2)将步骤(I)制得的预处理木质纤维素浸入浓度为2 IOmM的二硫苏糖醇溶液中，在40 50°C条件下浸泡20 28h，然后经水或缓冲液冲洗至pH到4. 5 5. 5，烘干制得木质纤维素原料； (3)按糖化体系重量百分比3 8%的比例将步骤(2)制得的木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，酶浓度为20 40mg/g,在40 60°C条件下进行糖化,糖化80 IOOh,制得水解液。
2.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步骤(I)中待降解木质纤维素原料为微晶纤维素、玉米秸杆、麦秸、稻壳、谷物、芦苇、木材、麸皮、木糖渣和/或脱木素渣。
3.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步骤(2)中水为自来水或纯化水。
4.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步骤(2)中缓冲液为由自来水或纯化水或由其配制的浓度O. 0Γ0. 05Μ，ρΗ4. 5^5. 5的柠檬酸盐、磷酸盐或醋酸盐缓冲液。
5.如权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述步骤(3)中木质纤维素原料添加量为糖化体系重量百分比的3 8%。
全文摘要
本发明涉及一种利用利用还原剂解除中水对酶解木质纤维素抑制的方法，步骤如下(1)将待降解木质纤维素原料在中水中浸泡，制得预处理木质纤维素；(2)将预处理木质纤维素浸入二硫苏糖醇溶液中然后经水或缓冲液冲洗，烘干制得木质纤维素原料；(3)将木质纤维素原料浸入纤维素酶酶液中，进行糖化，制得水解液。本发明通过将经中水预处理后的木质纤维素经二硫苏糖醇(DTT)浸泡，二硫苏糖醇既可以消除Fe离子对底物的氧化作用，又可以消除Fe离子对酶活的影响，大幅提高了酶的用量，降低了工业化成本，从而为利用中水水解木质纤维素奠定了基础。
文档编号C12P19/14GK103014098SQ20121057126
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者方诩, 穆子铭, 夏蕊蕊, 王明钰, 李玲, 肖林, 程少博, 覃树林 申请人:山东大学, 山东龙力生物科技股份有限公司