专利名称：一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总dna提取方法
技术领域：
本发明属于农业微生物与生物技术领域，具体涉及一种用于研究醋糟无土栽培基质中微生物群落结构的总DNA提取方法。
背景技术：
微生物是无土栽培基质中非常重要的组成部分，因而对无土栽培基质中微生物的研究是无土栽培基质研究领域内一个重要的方向，对于促进无土基质栽培的发展具有十分重要的意义。常用的用于微生物群落研究的方法有培养分离法、磷脂脂肪酸法和BIOLOG板法等，但是上述方法都有各自的缺陷。培养分离法只适合可培养微生物的研究，由于环境中的微生物99%以上都是不可培养的，因而传统培养分离法大大限制了对微生物资源的研究。磷脂脂肪酸法所依赖的针对个别脂肪酸标识物的细致描述也是源于少数可被分离的微生物的纯培养。因此，在研究无法培养的菌群占绝大多数的微生物群落时，磷脂脂肪酸法也存在一定的局限性。另外，由于不同菌种相同脂肪酸的相互叠加，磷脂脂肪酸法也难于在种水平上辩明微生物群落的确切组成。不同的微生物对同一 C源的利用能力不同，微生物对不同单一 C源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，BIOLOG板法也不能准确的反应出环境中的微生物群落结构的差异。随着分子生物学的发展，利用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技术，研究者可以在不对微生物进行纯培养的情况下对环境中的微生物进行全面的研究，包括微生物的分离鉴定、群落结构和功能的分析。而利用分子生物学的手段对环境中的微生物进行研究，获得高产量和高质量的DNA是应 用16S (18S) rRNA/rDNA序列分析技术进行环境微生物分子生态学研究的基础，常用的用于土壤和堆肥DNA提取的方法有液氮研磨法，SDS-反复冻融法、玻璃珠吸附法等。醋糟基质是以制醋过程中产生的残渣醋糟为原料，通过堆制发酵形成的新型园艺有机基质，作为草炭的替代基质，醋糟基质在育苗和栽培中已经得到广泛使用，并投入了商品化生产。但目前对醋糟无土栽培基质中微生物群落结构的变化尚不清楚。利用16S (18S)rRNA/rDNA序列分析技术可解决这方面的问题。醋糟基质作为一种堆肥产品，在堆制发酵的过程中会产生大量的腐殖酸，这些腐殖酸会对DNA的提取及PCR扩增产生强烈的影响。对腐殖酸的去除，常用的方法有硫酸铝捕获腐殖酸法、氯化铯密度梯度离心法，高效分子量排阻层析，试剂盒纯化法。这些纯化处理方法增加了复杂性，且费时费力。因而寻求一种有效的获取高质量的DNA提取方法是利用分子生物学手段研究醋糟基质栽培过程中微生物群落结构变化所急需解决的问题。
发明内容
本发明针对醋糟基质含有大量腐殖酸这一特点，对传统的土壤微生物基因组DNA提取方法进行了改进，通过在DNA提取buffer中添加O. 5%的β -巯基乙醇和O. 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对醋糟基质中的腐殖酸和酚类物质进行了初步去除。用氯仿异戊醇(24: 1/v: V)抽提蛋白后，用2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对DNA中的腐殖酸和酚类物质再次进行去除。从而建立了一种高效、快速的可用于16S (18S) rDNA PCR扩增的高质量的醋糟基质总DNA提取方法。为利用分子生物学的手段研究醋糟基质中微生物的群落结构奠定了基础。本发明的技术方案如下
一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总DNA提取方法，其特征在于按照下述步骤进行
(1)先在醋糟基质中加入DNA提取缓冲液和蛋白酶K，振摇，使醋糟基质中的微生物充分悬浮在DNA提取缓冲液中，优选DNA提取缓冲液的配方为10 mM Tris-Hcl (pH 8. O)，100mM Sodium EDTA(pH 8·O)，100 mM Sodium phosphate (pH 8.0)，1. 5 M Nacl，1% CTAB,
0.5% β-巯基乙醇和0.5% PVP，优选蛋白酶K用量为蛋白酶K的浓度为20 mg/ ml，加入量为 12. 5 μ I ；
(2)将步骤(I)制得的悬浮液用十二烷基磺酸钠裂解醋糟基质中的微生物，离心后取上清，优选十二烷基磺酸钠的质量分数为20% ；
(3)加入与步骤(2)取得的上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿异戊醇体积比=24:1，离心后取上清；
(4)加入与步骤(3)取得的上清液等体积的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚类物质，离心后取上清，优选聚乙烯聚吡咯烷酮的质量分数为2% ；
(5)将装有步骤(4)中取得 的上清液的离心管上下轻微的摇动，直至离心管中可见絮状物质，将离心管置于-20 °C沉淀20 min ；
(6)用体积分数为75%的乙醇沉淀DNA后，用去离子无菌水溶解DNA，并用RNA酶去除DNA中的RNA。上述用于研究醋糟无土栽培基质中微生物群落结构的总DNA提取方法优选技术方案如下
(I)称取0.5 g醋糟基质于10 ml无菌的离心管中，在离心管中加入2. 5 ml提取缓冲液，优选配方为10 mM Tris-Hcl pH 8. 0,100 mM Sodium EDTA pH 8. 0,100 mM Sodiumphosphate pH 8. 0，1. 5 M Nac1,1% CTAB,0. 5% β-巯基乙醇，0.5% PVP, 12. 5 μ I 蛋白酶K(20 mg/ ml)。(2)将上述离心管于37°C, 225 rpm的摇床摇30 min。(3)将从摇床取出的离心管中加入250 μ I质量分数为20%的十二烷基磺酸钠(SDS)，用涡旋仪涡旋10 s后，将离心管于65°C水浴lh，期间每15-20 min摇动一次。水浴后将离心管于4°C、10 000 g的离心机中离心10 min，取上清于新的离心管中。(4)向沉淀中加入1. 25 ml提取缓冲液及125 μ I质量分数为20%的十二烷基磺酸钠(SDS)，用涡旋仪涡旋10 s,65 °C水浴30 min后，4 V、10 000 g离心10 min，取上清于步骤(3)的新管中。将两次提取的上清液混合到一起。(5)在混合后的上清液中加入等体积的氯仿异戊醇(24: l/ν: V)，用涡旋仪涡旋30 s充分混匀后，4 0CUO 000 g离心10 min。取上清于新管。(6)重复步骤(5) I次。
(7)在步骤(6)取得的上清液中加入等体积的质量分数为2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP), 4 °C > 10 000 g离心10 min,取上清于新管。(8)在上清液中加入等体积预冷的异丙醇，将离心管轻微的上下摇动，直至离心管中可见絮状物质，将离心管置于-20 °C沉淀10 min。(9)取出离心管后12 000 g离心10 min，弃上清，在离心管中加入体积分数为75%的乙醇I ml,洗漆10 min后，12 000 g离心10 min,弃上清,得到DNA沉淀。(10)重复步骤(9) I次。(11)将沉淀冷冻干燥30 min后，加入120 μ I去离子无菌水和20 μ I核糖核酸酶(RNA酶)溶解DNA沉淀。本发明的优点
本发明在DNA提取过程中，不需用液氮研磨样品，不需对样品进行反复冻融，缩短了DNA提取时间。在提取过程中，DNA提取buffer中添加O. 5%的β -巯基乙醇和O. 5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对醋糟基质中的腐殖酸和酚类物质进行了初步去除。在DNA用氯仿异戊醇(24: 1/ν: V)抽提蛋白后，用2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对DNA中的腐殖酸和酚类物质再次进行了去除，从而获得了高质量的，无需再用DNA试剂盒进行纯化的，可直接用于16S (18S) rRNA/rDNA序列分析的DNA。建立了一套可用于醋糟基质中微生物分子生态学研究的快速、高质的DNA提取方法。
图1本发明方法提取醋糟基质总DNA电泳图，其中1-6为醋糟样品，M为Markerλ DNA/Hind III。图2以本发明方法提取醋糟基质总DNA为模板进行16S rDNA PCR扩增电泳图，其中 1-24 为醋糟 16S rDNA PCR 扩增的 PCR 产物，M 为 Marker DL 2000。图3以本发明方法提取醋糟基质总DNA为模板进行18S rDNA PCR扩增电泳图，其中 1-24 为醋糟 18S rDNA PCR 扩增的 PCR 产物，M 为 Marker DL 2000。
具体实施例方式以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1、醋糟基质中总DNA的提取
(I)称取O. 5 g醋糟基质于10 ml无菌的离心管中，在离心管中加入2. 5 ml提取buffer再加12. 5 4 1蛋白酶1((20 mg/ ml)。其中DNA提取buffer的配方为10 mMTris-Hcl(pH 8. O), 100 mM Sodium EDTA( pH 8. O), 100 mM Sodium phosphate (pH 8.0),1.5 M Nacl，1% CTAB，0. 5% β -巯基乙醇，0. 5% PVP。(2)将上述离心管于37°C, 225 rpm的摇床摇30 min。
(3)将从摇床取出的离心管中加入250 μ I质量分数为20%的SDS，用涡旋仪涡旋10 S混匀后，将离心管于65°C水浴lh，期间每15-20 min摇动一次。水浴后将离心管于4°C, 10 000 g离心10 min,取上清于新的离心管中。(4)向沉淀中再加入1. 25 ml提取buffer及125 μ I质量分数为20%的SDS。用涡旋仪涡旋10 s混匀，65°C水浴30 min后，4 °C, 10 000 g离心10 min，取上清于步骤
(3)的新管中。将两次提取的上清液混合到一起。(5)在混合后的上清液中加入等体积的氯仿异戊醇(24: Ι/v: V)，用涡旋仪涡旋30 s充分混匀后，于4°C, 10 000 g离心10 min。取上清于新管。(6)重复步骤(5) I次。(7)在步骤(6)取得的上清液中加入等体积的质量分数为2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP),4 °C, 10 000 g离心10 min,取上清于新管。(8)在上清液中加入等体积预冷的异丙醇，将离心管轻微的上下摇动，直至离心管中出现絮状物质，将离心管置于-20 °C沉淀20 min。(9) 12000 g离心10 min，弃上清，在离心管中加入体积分数为75%的乙醇I ml，洗漆10 min后，12000 g离心10 min,弃上清,得到DNA沉淀。(10)重复步骤(9) I次。(11)将沉淀冷冻干燥30 min后，加入120 μ I去离子无菌水和20 μ I核糖核酸酶(RNA酶)溶解沉淀。实施例2、DNA的电泳检测和PCR扩增
将实施例1得到的总DNA，用质量分数为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，所用的分子量标记(Marker )为λ DNA/Hind III，电泳缓冲液为I X TAE，所用电压为10 V/cm，电泳30min后，将琼脂糖凝胶在凝聚成像系统中拍照，得到DNA的电泳图(如图1所示)。DNA条带
单一，没有拖尾。用细菌的16S rDNA和真菌的18S rDNA进行PCR扩增和产物检测。其具体步骤如下
(I)选择细菌 16S rDNA 扩增的常用引物对 F341 :5’- CCT ACG GGA GGC AGC AG -3’(SEQ ID No. 1)，907R :5，-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3，(SEQ ID No. 2)，作为扩增引物。
50μ I PCR 反应体系为10 X PCR Buffer (含 mg2+ )溶液 5 μ l,dNTP 10 mM Ιμ ，上游引物10 PM I μ 1，下游引物10 PM I “1，了&9酶5~4 1 O. 5 yl，DNA模板I μ ，无菌/K 40. 5 μ I。PCR 运行程序预变性94 °C，5 min ;变性94 °C,45 s ;退火56 °C,40 S，延伸72 °C,40 s ;共35个循环；总延伸72 V, 7 min。将扩增的PCR产物用质量分数为2%的琼脂糖凝胶进行电泳，所用的分子量标记(Marker)为DL2000，电泳缓冲液为I X TAE，所用电压为10 V/cm， 电泳30 min后，将琼脂糖凝胶在凝聚成像系统中拍照，得到PCR产物电泳图如图2所示。(2)选择真菌 18S rDNA 扩增的常用引物对 NSl :5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCTC-3’ (SEQ ID No. 3), FUNG 5' -ATT CCC CGT TAC CCG TTG -3’ (SEQ ID No. 4)，作为扩增的引物。50 μ I 的反应体系10 X PCR Buffer (含mg2+)溶液5 μ l,dNTP 10 mM 1μ I,上游引物10 ρΜ I μ 1，下游引物10 ρΜ I “1，了&9酶5~4 1 O. 5 yl，DNA模板I μ ，无菌水 40. 5 μ I。PCR 运行程序预变性94 °C，5 min ;变性94 °C, 30 s ;退火57 °C,60S，;延伸72 °C,60 S，共 35 个循环；总延伸72 °C, 10 min。将扩增出的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，所用的分子量标记(Marker)为DL2000，电泳缓冲液为1XTAE，所用电压为10 V/cm,电泳30 min后，将琼脂糖凝胶在凝聚成像系统中拍照，得到PCR产物电泳图如图3所示。从图2和图3可见，用16S rDNA和18S rDNA均能成功的从醋糟基质中提取的DNA中扩增出各自的目的条带，且条带明亮、单一，扩增特异性强，条带长度分别为500多bp和300多bp。这充分说明本发明非常适合用于从醋糟基质中获得高质量的DNA，可供研究者用分子生物学手段研究醋糟基质中的微生物群落 结构。序列表
Organization Applicant
Street :江苏镇江市京口区学府路301号
City :镇江市
State :江苏省
Country :中国
PostalCode : 212013
PhoneNumber : 0511-88795397
FaxNumber :
EmailAddress :
<110> OrganizationName :江苏大学
Application Project
〈120〉Title : 一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总DNA提取方法〈130〉AppFileReference :
<140> CurrentA ppNumber :
<141> CurrentFilingDate :
Sequence
〈210〉SEQ ID No.1〈213 > OrganismName :
<400> PreSequenceString :
CCT ACG GGA GGC AGC AG〈212〉 Type : DNA〈211〉 Length : 17
SequenceName: F341 SequenceDescription :
Sequence
〈210〉SEQ ID No. 2〈213 > OrganismName :
<400> PreSequenceString :
CCGTCAATTCCTTTGAGTTT〈212〉 Type : DNA
权利要求
1.一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总DNA提取方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)先在醋糟基质中加入DNA提取缓冲液，并加入蛋白酶K，振摇，使醋糟基质中的微生物充分悬浮在DNA提取缓冲液中；(2)将步骤(I)制得的悬浮液用十二烷基磺酸钠裂解醋糟基质中的微生物，离心后取上清；(3)加入与步骤(2)取得的上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液抽提蛋白，其中氯仿 异戊醇体积比为24: 1，离心后取上清；(4)加入与步骤(3)取得的上清液等体积的聚乙烯吡咯烷酮水溶液，去除腐殖酸和酚类物质，离心后取上清；(5)将装有步骤(4)中取得的上清液的离心管上下轻微的摇动，直至离心管中可见絮状物质，将离心管置于-20 °C沉淀20 min ；(6)用体积分数为75%的乙醇沉淀DNA后，用去离子无菌水溶解DNA，并用RNA酶去除DNA中的RNA。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述DNA提取缓冲液的配方为10 mM Tris-Hcl (pH 8.0),100 mM Sodium EDTA(pH 8.0),100 mM Sodium phosphate (pH8.0)，1. 5 M Nacl，1% CTAB，0. 5% β -巯基乙醇和 0. 5% PVP。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述蛋白酶K的浓度为20mg/ ml, 加入量为12. 5 μ I。
4.根据权利要求1所述的提取方，其特征在于所述十二烷基磺酸钠的质量分数为20%。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述聚乙烯聚吡咯烷酮的质量分数为2%。
全文摘要
本发明涉及到一种用于研究醋糟基质中微生物群落结构的总DNA提取方法。本发明先在醋糟基质中加入含有0.5%的β-巯基乙醇和0.5%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的DNA提取缓冲液，并加入蛋白酶K，放置37℃摇床摇30min，使基质中的微生物充分溶解在DNA提取缓冲液中后，用质量分数为20%的十二烷基磺酸钠(SDS)溶液裂解醋糟基质中的微生物细胞，用氯仿:异戊醇(24:1)抽提去除蛋白，用质量分数为2%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)去除腐殖酸、酚类物质后，用预冷的异丙醇沉淀，最后得到高质量的可直接用于PCR扩增的DNA。
文档编号C12N15/10GK103045585SQ20121057128
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者李萍萍, 林英, 赵青松, 杜道林, 王纪章 申请人:江苏大学