一种防黄瓜枯萎病生物制剂的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种防黄瓜枯萎病生物制剂的制备方法，属于生物制剂领域。
【背景技术】
[0002]黄瓜枯萎病是黄瓜连作栽培中的主要病害之一，在全国都有发生，若以死株率计算，常年损失大约在10?30%左右，严重的甚至可达85%以上。黄瓜枯萎病主要病原菌是真菌中的尖孢镰刀菌，在分类中属于半知菌亚门，尖孢镰刀菌属，而作物的多种病害如根腐、猝倒、萎蔫等都是由尖孢镰刀菌引起的植物组织腐烂，严重影响其黄瓜的产量。
[0003]土壤微生物区系的失衡是导致土壤常年连作障碍的主要因素。植物连作使得土壤理化性质发生改变，还有受到同一类植株根系分泌物的影响，土壤微生物群落发生选择性富集，使得土壤微生物数量发生明显改变，进而导致土壤微生物群系的结构发生明显的变化。随着设施蔬菜连作年限的逐年增加，土壤微生物中的细菌、放线菌和有益真菌的种类和数量逐渐减少，病原真菌数量逐年增加，使得作物病害的发生加重。采用生物学的方法防治蔬菜作物病害始于20世纪80年代，利用遗传育种和基因工程相结合的技术培育新的抗病作物品种，是一项克服蔬菜类连作障碍的有效方法。近些年来研究发现，通过向土壤中添加有益生防微生物，可抑制土传病原真菌生长与繁殖，从而可修复土壤微生物区系的群落结构和功能，这点是缓解或控制瓜类蔬菜连作障碍防治的重要技术措施。通过接种有益微生物，使它与某些特定的植物病原菌共同争夺养分，可显著减少土壤微生物病原菌的数量，减轻植物病害的发生，而这些有益微生物包括土传病原真菌的拮抗菌和一些细菌、放线菌、真菌等有益菌群。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前黄瓜连作年限的增加，土壤微生物中的细菌、放线菌和有益真菌的种类和数量逐渐减少，病原真菌数量逐年增加，使黄瓜枯萎病在蔬菜种植上危害严重的问题，提供了一种防黄瓜枯萎病生物制剂的制备方法，本发明先将土豆泥、葡萄糖和琼脂为原料制成活化培养基，再将枯草芽孢杆菌和放线菌分别接种到培养基中进行培养，将活化的菌种转移至液体培养基中进行培养，将培养后的菌丝放入发酵罐加入醋糟等物质一起发酵，发酵后过滤，将过滤液进行离心分离取上清液，将其和蛋黄、蓖麻油制得的粘稠混合液进行混合，进行超声分散，即可得一种防黄瓜枯萎病生物制剂，本发明先培养和筛选出具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌和放线菌，其相互协同作用可以有效促进土壤微生物菌群结构健康生长，还可提高土壤酶活性，有效降低黄瓜枯萎病的发病率90%以上。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
1.(1)称取200?300g 土豆泥，20?30g葡萄糖和15?18g琼脂放入培养皿中加入800?1000mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，再用质量浓度为9%的盐酸溶液调节pH至6?7，之后移入灭菌罐，在110?120°C下高温灭菌20?30min，制得活化培养基； 2.(2)将3?5g枯草芽孢杆菌和4?6g放线菌分别接种在两个活化培养基中，之后移入恒温培养箱，在25?35°C下培养5?7天，将活化后的菌种按2?5%的接种量分别转移接种至LB和PDA液体培养基中，于30?38°C下摇床振荡36?48h，之后放入恒温箱，在25?35°C下培养1?2周；
3.(3)用消毒棉签分别刮取3?5g两个培养基中最茂盛的菌丝放入发酵罐，再称取5?10g醋糟、3?5g葡萄糖，配以300?500mL蒸馈水一起倒入发酵罐，搅拌均勾后，用保鲜膜密封罐口，于25?35°C下发酵2?3天；
4.(4)发酵完成后过滤，将发酵液移入卧式高速离心机，设置离心转速为7000?8000r/min进行离心处理10?20min，之后分离得到上清液；
5.(5)取5?10个新鲜鸡蛋，用注射剂吸出蛋清，得到蛋黄放入500mL烧杯中，用磁力搅拌机以300?400r/min的转速搅拌10?20min，之后降低转速至100?200r/min并在搅拌状态下加入50?100mL蓖麻油，继续搅拌10?20min，得粘稠混合液；
6.(6)将上述粘稠混合液和离心得到的菌液按体积比为2:3进行混合，放置在超声振荡仪中超声分散20?30min，使两者混合均匀，超声频率为25?35kHz，超声功率为100?200W，之后装瓶即得一种防黄瓜枯萎病生物制剂。
[0006]LB液体培养基的组成为10?15g蛋白胨，5?10g酵母提取物，10?15g氯化钠和18?23g琼脂以及1000?1200mL蒸馏水。
[0007]PDA液体培养基的组成为200?250g 土豆，20?25g葡萄糖，18?23g琼脂和1000?1200mL蒸馏水。
[0008]本发明的应用方法:将本发明制得的生物制剂采用盆栽进行试验，选取两个盆，每个盆里选用4?5kg黄瓜连作3年的土壤，进行种植黄瓜幼苗，一个盆里在苗期施加20?30g生物制剂在土壤中，花期施入30?40g生物制剂在土壤中，瓜期施入10?20g生物制剂在土壤中，同时另一个盆里不施加生物制剂，两个盆栽对比，施加生物制剂的盆栽黄瓜枯萎病的发病率降低了 90?92%。
[0009]本发明的有益效果是:
(1)本发明先培养和筛选出具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌和放线菌，其相互协同作用可以有效促进土壤微生物菌群结构健康生长，还可提高土壤酶活性；
(2)本发明制备出的生物制剂可以有效降低黄瓜枯萎病的发病率90%以上，而且工艺简单，绿色环保。
【具体实施方式】
[0010]首先称取200?300g 土豆泥，20?30g葡萄糖和15?18g琼脂放入培养皿中加入800?1000mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，再用质量浓度为9%的盐酸溶液调节pH至6?7，之后移入灭菌罐，在110?120°C下高温灭菌20?30min，制得活化培养基；将3?5g枯草芽孢杆菌和4?6g放线菌分别接种在两个活化培养基中，之后移入恒温培养箱，在25?35°C下培养5?7天，将活化后的菌种按2?5%的接种量分别转移接种至LB和PDA液体培养基中，于30?38°C下摇床振荡36?48h，之后放入恒温箱，在25?35°C下培养1?2周；用消毒棉签分别刮取3?5g两个培养基中最茂盛的菌丝放入发酵罐，再称取5?10g醋糟、3?5g葡萄糖，配以300?500mL蒸馏水一起倒入发酵罐，搅拌均匀后，用保鲜膜密封罐口，于25?35°C下发酵2?3天；发酵完成后过滤，将发酵液移入卧式高速离心机，设置离心转速为7000?8000r/min进行离心处理10?20min，之后分离得到上清液；
10.取5?10个新鲜鸡蛋，用注射剂吸出蛋清，得到蛋黄放入500mL烧杯中，用磁力搅拌机以300?400r/min的转速搅拌10?20min，之后降低转速至100?200r/min并在搅拌状态下加入50?100mL蓖麻油，继续搅拌10?20min，得粘稠混合液；将上述粘稠混合液和离心得到的菌液按体积比为2:3进行混合，放置在超声振荡仪中超声分散20?30min，使两者混合均匀，超声频率为25?35kHz，超声功率为100?200W，之后装瓶即得一种防黄瓜枯萎病生物制剂。
[0011]LB液体培养基的组成为10?15g蛋白胨，5?10g酵母提取物，10?15g氯化钠和18?23g琼脂以及1000?1200mL蒸馏水。
[0012]PDA液体培养基的组成为200?250g 土豆，20?25g葡萄糖，18?23g琼脂和1000?1200mL蒸馏水。
[0013]实例1
13.首先称取200g 土豆泥，20g葡萄糖和15g琼脂放入培养皿中加入800mL蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，再用质量浓度为9%的盐酸溶液调节pH至6，之后移入灭菌罐，在110°C下高温灭菌20min，制得活化培养基；将3g枯草芽孢杆菌和4g放线菌分别接种在两个活化培养基中，之后移入恒温培养箱，在25°C下培养5天，将活化后的菌种按2%的接种量分别转移接种至LB和PDA液体培养基中，于30°C下摇床振荡36h，之后放入恒温箱，在25°C下培养1周；用消毒棉签分别刮取3g两个培养基中最茂盛的菌丝放入发酵罐，再称取5g醋糟、3g葡萄糖，配以300mL蒸馏水一起倒入发酵罐，搅拌均匀后，用保鲜膜密封罐口，于25°C下发酵2天；发酵完成后过滤，将发酵液移入卧式高速离心机，设置离心转速为7000r/min进行离心处理lOmin，之后分离得到上清液；取5个新鲜鸡蛋，用注射剂吸出蛋清，得到蛋黄放入500mL烧杯中，用磁力搅拌机以300r/min的转速搅拌lOmin，之后降低转速