一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌及其应用，菌株为Bacillussp.RS-1，2013年01月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCCNo.7170。将该生防芽孢杆菌用于土传病害病原菌如烟草赤星病菌、黄瓜枯萎病菌、甜瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核菌、石斛黑腐病菌和石斛枯萎病菌的抑制。还可将该生防芽孢杆菌在土壤植物根际和烤烟叶面有效定殖。本发明的生防芽孢杆菌RS-1不仅对多种土传病害病原菌具有较好的拮抗效果，而且还能在根际和叶面有效定殖。
【专利说明】一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌及其应用【技术领域】[0001]本发明涉及一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌及其应用，属农业生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]近年来，随着农药、化肥的大量施用及土地的高复种指数，连作障碍和土传病害的爆发等诸多问题对土壤的可持续供给、农产品的产量、质量和安全性造成了威胁。目前，我国存在连作现象的植物种类多且广，粮食作物、经济作物、蔬菜、林木及园艺作物都存在不同程度的连作障碍和“茬口”问题。有关连作障碍机理的研究虽已取得很大进展，但是结论不一。归纳起来主要有:(I)土壤理化性质恶化。由于同一作物对土壤单一养分的消耗，造成土壤养分供应比例失调，土壤理化性状恶化，土壤酶活性变化。有研究发现，连作可使土壤中磷酸酶和脲酶活性降低，脲酶与磷酸酶活性的降低导致尿素水解反应及有机磷化合物分解反应减弱，为作物提供有效氮、磷养分减少。(2)植物化感自毒作用。即由根系分泌物和残茬分解物等引起的自毒作用。(3) 土壤微生物区系的变化。连作扰乱了土壤微生态平衡，有益微生物种类和数量的减少，如农药的使用会抑制土壤中的固氮微生物、根瘤菌以及有机质降解菌等的生长繁殖，引起微生物选择性富集，细菌总体数量减少，真菌总体数量显著上升，特别是病原菌数量急剧增大，土壤微生物由细菌主导型转为真菌主导型，病原菌更容易侵染植物并引发植物各种病害。上述三大因素均与土壤存在密切关系，土壤内部的变化又是一个复杂而紧密相联系的过程，土壤微生物在此过程中扮演着重要的角色，解决连作障碍和土传病害问题的关键就是维持土壤中病原菌和有益生物的平衡。目前针对连作障碍和土传病害问题，向土壤中施入可拮抗并控制土壤有害病原菌，维持土壤微生态平衡，促进作物生长的植物根系促生菌是一种绿色、可行、有效的手段和途径。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对目前化学肥料和农药的大量施用从而导致土壤微生态失衡、 土传病害爆发等问题，从自然环境中筛选出一株能在根际和叶际有效定殖并兼具防治多种土传病害病原菌和促生作用的生防芽孢杆菌。本发明还提供这种生防芽孢杆菌的应用。[0004]本发明的目的通过如下技术方案实现:一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌，菌株为feci77心sp.RS-1，2013年01 月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC N0.7170。[0005]本发明所述生防芽孢杆菌菌株sp.RS-1是从云南本土栽培的烤烟叶表分离所得。所述生防芽孢杆菌RS-1在LB培养基上培养24h后的菌落特征为乳白色，边缘不规则，表面干燥，革兰氏染色阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生，不膨大；所述LB培养基为蛋白胨 10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、琼脂 18g、H2OlOOOmL, pH 7.0o[0006]本发明所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌的应用，可用于土传病害病原菌如烟草赤星病菌al terna ta (Fries) Λ?9Υ.5576?τ)、黄瓜枯萎病菌 iFusarium oxy sporum f.sp.cucumerinum ) > Stflif iFusarium oxysporum (Schl.)f.sp.me I on is (Leach et Curr enee) Snyder et Hansen ) > 西瓜 ?古萎病 1^iFusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.nweum CE.F.Smith) Snyder et Hansen)> 油菜菌核菌(sclerotiorum (Lib.) de ife/y)、石斛黑腐病菌 palmivora取Pythium w7ii皿》)和石斛枯萎病菌的抑制。还可在土壤植物根际和烤烟叶面有效定殖。可采用在烤烟叶面喷施方式防治烟草白粉病。还可采用灌根方式促生烤烟和油麦菜。[0007] 与现有技术相比，本发明的积极效果是:1、本发明的生防芽孢杆菌RS-1不仅对多种土传病害病原菌具有较好的拮抗效果，而且还能在根际和叶面有效定殖；2、本发明的生防芽孢杆菌RS-1通过灌根方式对烤烟和油麦菜具有明显的促生效果；3、本发明的生防芽孢杆菌RS-1通过叶面喷施方式对白粉病的防治效果可达60.54%。【专利附图】
【附图说明】[0008]图1A)是本发明生防芽孢杆菌RS-1的菌落图；图1B)是本发明生防芽孢杆菌RS-1的菌体特征图；图2是本发明生防芽孢杆菌RS-1的生长曲线图；图3A广H)分别是菌株RS-1对黄瓜枯萎病菌ifusarium oxy sporum f.sp.cucumerinum)、舌甘瓜才古萎病菌 iFusarium oxysporum (Schl.) f.sp.me I on is (Leach et Currenee)Snyder et Hansen )>HfiFusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.nweum (E.F.Smith) Snyder et Hansen)、土豆立才古病菌 solani烟草赤星病菌 047 temaria a I terna ta (Fries)石斛黑腐病菌{Phytophthora palmivora 热 Pythium-口^'角斗_古,_胃oxysporum)平板拮抗效果图。[0009]图4是菌株RS-1在烤烟根际的定殖情况图；图5是菌株RS-1在烤烟叶表的定殖情况图。【具体实施方式】[0010]在下面的实施例中， 申请人:研究了生防芽孢杆菌RS-1的菌落和菌体特征、生长曲线、对多种土传病害病原菌的平板对峙效果、在烤烟根际和叶表的定殖效果、通过叶面喷施方式对烟草白粉病的防治效果及通过灌根方式对烤烟和油麦菜的促生效果，确定该生防芽孢杆菌RS-1的抗病和促生效果。[0011]以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。[0012]生防芽孢杆菌RS-1的分离筛选:本发明的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌sp.RS-1分离自云南本土栽培的烤烟叶表所得。该菌株已于2013年01 月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC N0.7170。本发明提供的生防芽孢杆菌菌株RS-1在LB培养基上培养24h后的菌落特征为乳白色，边缘不规则，表面干燥，革兰氏染色阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生，不膨大；所述LB培养基为蛋白胨log、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂18g、H2O 1000mL, pH 7.0。图ΙΑ)、图1B) 分别显示了生防芽孢杆菌菌株Bacillus sp.RS-1的菌落和菌体特征，图2显示了生防芽孢杆菌菌株RS-1的生长曲线。[0013]将本发明的生防芽孢杆菌菌株RS-1在LB液体培养基(LB液体培养基为蛋白胨 10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、H2O 1000mL, pH 7.0)、37°C、200rpm 条件下培养 8h，接种量为0.5%,分别在 0、l、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、42、48、54、72h 进行取样， 然后测定OD6c?值。结果发现0-7h为迟滞期，8-20h为对数生长期，20-42h为稳定期，42_72h 为衰退期，在22h时95%以上的菌体均形成了芽孢，并且在24h时菌体数量达到6.77X IO8 cfu /mT,η[0014]本发明的生防芽孢杆菌RS-1对多种土传病害病原菌的平板对峙效果如下:先将多种土传病害病原菌在PDA平板(PDA平板为采用去皮土豆200g切块100°C煮沸30min后过滤得到的滤液、蔗糖20g、琼脂18g、H20 1000mL)上进行活化，然后用打孔器打孔同心圆琼脂饼接种于新的PDA平板上，每种土传病害病原菌共设3个重复，28°C培养箱倒置培养2-3d 直至病原菌直径为2-3cm，然后在该PDA平板上接种活化后的菌株RS-1，28°C培养箱继续倒置培养3-5d，然后观察菌株RS-1对各种土传病害病原菌的对峙效果，室内平板对峙试验显示,菌株RS-1对多种土传病害病原菌如烟草赤星病菌al terna ta (Fries) Keissler)、黄瓜枯萎病菌 Q7Usarium oxy sporum f.sp.cucumerinum)、舌甘瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum (Schl.) f.sp.me1nis (Leach et Currenee)Snyder et Hansen )、西瓜?古萎病菌應 oxysporum Schlech tendahl ex Fries f.sp.nweum (E.F.Smith) Snyder et Hansen)、油菜菌核菌sclerotiorum (Lib.) de Bary)> 石斛黑腐病菌palmi vora 取 Pythium和石斛枯萎病菌 oxysporum)等均具有较好的抑制效果。[0015]本发明生防芽孢杆菌RS-1在烤烟根际的定殖效果如下:将活化后的生防芽孢杆菌RS-1接种至液体LB培养基中37°C、200rpm培养24h，5000rpm离心lOmin，沉淀用同体积的0.9%生理盐水重悬，测定菌体浓度后待用(测定结果为重悬液的菌体浓度为2.93X 108cfu/mL)o本试验所用土壤为红壤掺混10%有机肥(有机肥由云南瑞升埃比特生物科技有限公司提供，总养分为6.0%)。本试验共24盆，其中菌液处理12盆，空白对照12 盆，每盆土重 1.0kg,基肥分别按 N 0.15 g/kg 土、P2O5 0.15 g/kg 土、K2O 0.15 g/kg 土施入。选择长势、叶数基本一致的烤烟烟苗进行移栽，每盆移栽一棵烟苗，烟苗移栽后第2d，菌液处理灌入每盆IOmL重悬后菌液，空白处理灌入IOmL无菌水，在整个试验阶段每天定量浇水管理。然后分别于灌根后0d、10d、20d、30d分别采集菌液处理和空白处理的3盆烟苗的根际土样进行测定土壤中芽孢杆菌的数量，根据菌株RS-1的菌落形态特征及空白对照中的芽孢杆菌数量，最终确定菌液处理中的菌株RS-1在烤烟根际的定殖情况。结果显示，在 30d内，菌液处理的RS-1菌体数量基本维持在107cfu/g 土，详见图 4。[0016]本发明生防芽孢杆菌RS-1在烤烟叶面的定殖效果如下:将活化后的菌株RS-1接种至液体LB培养基中37°C、200rpm培养24h，5000rpm离心lOmin，沉淀用同体积的0.9%生理盐水重悬，测定菌体浓度(测定结果为重悬液的RS-1菌体浓度为3.25X 108cfu/mL)。分别在无菌水、RS-1菌液浓度107cfu/mL、RS-l菌液浓度106cfu/mL、RS_l菌液浓度105cfu/mL 加入吐温20使得加入吐温20的终浓度为0.1%，待用。本试验所用土壤为红壤掺混10%有机肥(有机肥由云南瑞升埃比特生物科技有限公司提供，总养分为6.0%)。选择长势、叶数基本一致的烤烟烟苗进行移栽，每盆移栽一棵烟苗，待烟苗长至7-8片真叶，将所有烟苗的真叶数修剪为一致，然后进行试验处理。本试验共设4个处理，处理1:每盆喷施5mL无菌水， 处理2:每盆喷施5mL107cfu/mL的RS-1菌液浓度,处理3:每盆喷施5mL106cfu/mL的RS-1 菌液浓度，处理4:每盆喷施5mL 105cfu/mL的RS-1菌液浓度，每个处理共设3个重复。喷施后15d，取每处理3个重复的相同部位的2片烟叶，用直径Icm的打孔器共取60个小圆片，称重后置于加有少量石英砂和IOmL无菌水的研钵中进行充分匀浆，取匀浆液进行稀释涂布测定每克叶片芽孢杆菌数量，根据菌株RS-1的菌落形态特征及空白对照中的芽孢杆菌数量，最终确定各稀释浓度的RS-1在烤烟叶表的定殖情况。结果显示，随着稀释浓度的增加，叶表的RS-1菌体数量不断下降，其中喷施菌液浓度107cfu/mL处理15d后的定殖结果为 3.22 X IO6 cfu/mL，详见图 5。[0017]本发明生防芽孢杆菌RS-1在烤烟白粉病的防治效果如下:将活化后的菌株 RS-1接种至液体LB培养基中37°C、200rpm培养24h，5000rpm离心lOmin，沉淀用同体积的0.9%生理盐水重悬，测定菌体浓度后待用(测定结果为重悬液的RS-1菌体浓度分别为3.73X 108cfu/mL)o重悬后分别按10倍、100倍稀释后连同对照样即无菌生理盐水一起分别加入吐温20使得加入吐温20的终浓度为0.1%，待用。本试验共设4个处理:处理1，喷施无菌水；处理2，喷施RS-1 108cfu/mL菌液；处理3，喷施RS-1 107cfu/mL菌液；处理4， 喷施RS-1 106cfu/mL菌液。本试验所用土壤为红壤掺混10%有机肥(有机肥由云南瑞升埃比特生物科技有限公司提供，总养分为6.0%)。每处理设20盆重复，每盆土重5kg，基肥分别按 N 0.15 g/kg 土、P2O5 0.15 g/kg 土、K2O 0.15 g/kg 土施入。选择长势、叶数基本一致的烤烟烟苗进行移栽，每盆移栽一棵烟苗。从发病的白粉病烟株上收集白粉病分生孢子于0.9%的生理盐水中，并调整分生孢子浓度为IO5个/mL，并于烟苗移栽后IOd均匀喷施于烟苗叶表，喷施7d后烟苗开始出现白粉病症状，然后开始喷施菌液处理，处理2、3和4每盆喷施5mL，对照喷施每盆喷施5mL无菌生理盐水，15d后按照烟草白粉病病害分级及调查方法进行调查每个处理所有重复的白粉病发病情况。[0018]烟草白粉病病害分级及调查方法如下:以叶片为单位分级调查，O级为全叶无病，I级为病斑面积占叶片面积的5%以下，3级为病斑面积占叶片面积的6%~10%，5级为病斑面积占叶片面积的11%~20%，7级为病斑面积占叶片面积的21%~40%，9级为病斑面积占叶片面积的41%以上。[0019]病情指数=Σ〔各级病叶数X该病级值〕/ (调查总叶数X最高级值)X100。[0020]防治效果=(对照发病指数一处理发病指数)/对照发病指数X 100%。[0021]各处理的白粉病病情指数和防治效果见表1，喷施.RS-1 108cfu/mL处理的防治效果达到60.54%ο[0022]表1.菌株RS`-1对烟草白粉病的防治效果处理名称I发病指数I防治效果(％)—CK_57.25 -_RS-1 IO8Cfu/mL ~22.57 —60.54 RS-1107cfu/mL — 35.81 — 37.40 RS-1106cfu/mL 丨45.59 丨20.30本发明生防芽孢杆菌RS-1在烤烟上的促生效果如下:将活化后的菌株RS-1接种至液体LB培养基中37°C、200rpm培养24h，5000rpm离心lOmin，沉淀用同体积的0.9%生理盐水重悬，测定菌体浓度后待用(测定结果为重悬液的RS-1菌体浓度分别为3.53X 108cfu/mL)o 本试验共设4个处理:处理1，0.9%无菌生理盐水；处理2，RS-1菌液浓度108cfu/mL ;处理 3，RS-1菌液浓度10\血/1^;处理4，1?-1菌液浓度106cfu/mL。本试验所用土壤为云南红壤掺混10%云南瑞升埃比特生物科技有限公司的有机肥(有机肥总养分为6.0%)。每处理设 5 盆重复，每盆土重 5kg，基肥分别按 N 0.15 g/kg 土、P2O50.15 g/kg 土、K2O 0.15 g/kg 土施入。选择长势、叶数基本一致的烤烟烟苗进行移栽，每盆移栽一棵烟苗。移栽后l-2d待烟苗成活后，处理2、3、4的每盆分别进行相应浓度菌液进行灌根(为了使灌根的菌液能够与根充分接触IOmL兑入90mL水中进行灌根)。期间分别于移栽后15d和30d进行追肥，每盆追施复合肥(复合肥的重量配比为N =P2O5 =K2O=IO:10:25)lg，整个试验期间，所有处理每天定量浇水管理。移栽后60d调查有效叶片数、茎高、茎围直径、最大叶宽、最大叶长、节距、 地上部分干重和地下部分干重。详细数据结果见表2，从表2可知，菌株RS-1通过灌根方式能够促进烤烟的生长，主要体现在地上部分各种农艺性状和根系的干重方面，其中菌株 RS-1 108cfu/mL的促生效果最明显，与对照样相比，各部分涨幅为:茎高增长8.26%，最大叶长增长8.97%，最大叶宽增长7.97%，节距增长13.23%，总生物量增长11.80% (其中地上部分和地下部分生物量涨幅分别为11.29%和14.01%)ο
[0023]表2.菌株RS-1在烤烟上的促生情况
【权利要求】
1.一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌，其特征在于，菌株为sp.RS-1, 2013年Ol月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为 CGMCC N0.7170。
2.如权利要求1所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌，其特征在于，所述生防芽孢杆菌菌株sp.RS-1是从云南本土栽培的烤烟叶表分离所得。
3.如权利要求1所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌，其特征在于，所述生防芽孢杆菌RS-1在LB培养基上培养24h后的菌落特征为乳白色，边缘不规则，表面干燥，革兰氏染色阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生，不膨大；所述LB培养基为蛋白胨10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、琼脂 18g、H2OlOOOmL, pH 7.0。
4.如权利要求1或2或3所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌的应用，其特征在于，将该生防芽孢杆菌用于土传病害病原菌如烟草赤星病菌 (Alternaria a I terna ta (Fries) ifeissyer )、黄瓜才古萎病菌(Fusarium oxy sporum f.sp.cucumerinum)、舌甘瓜 ?古萎病菌 QFusarium oxysporum (Schl.) f.sp.me I on is (Leach et Currenee)Snyder et Hansen)>HfiFusarium oxysporum Schlechtendahl ex Fries f.sp.nweum (E.F.Smith) Snyder et油菜菌核菌 sclerotiorum (Lib.) de Bary、、石斛黑腐病菌 iPhytophthora palmivora 和 Pythium ul timum )和石斛枯萎病菌iFusarium oxysporum )的抑制。
5.如权利要求1或2或3所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌的应用，其特征在于，将该生防芽孢杆菌在土壤植物根际和烤烟叶面有效定殖。
6.如权利要求5所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌的应用，其特征在于，将该生防芽孢杆菌采用在烤烟叶面喷施方式防治烟草白粉病。
7.如权利要求5所述的一株兼具抗病和促生效果的生防芽孢杆菌的应用，其特征在于，将该生防芽孢杆菌采用灌根方式促生烤烟和油麦菜。
【文档编号】C12N1/20GK103555609SQ201310434741
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】胡晓峰, 岳宁, 盘文政, 陈晓华, 陈俊秋, 弓新国, 肖渝 申请人:云南瑞升埃比特生物科技有限公司