黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用。该基因为序列表中SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列。本发明提供的抗病基因Foc-4具有重要的应用价值，可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种效率；另外，本发明的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4还可以用于选育黄瓜黑星病抗病品种。
【专利说明】黄瓜枯委病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因序列和应用领域，具体涉及黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用。
【背景技术】
[0002]黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、
总产量最高的国家。
[0003]黄瓜枯萎病(Fusarium Wilt)，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一种由土壤传染，从根或根颈部侵入，在维管束内寄生的系统性病害(导管型枯萎病)，是黄瓜生产上较难防治的三大病害之一，常造成较大损失，是目前世界各地黄瓜，特别是温室和其他保护地黄瓜的主要土传病害，该病菌在土壤、病株残体及未腐熟的农家肥中或附着在种子上越冬，成为翌年初侵染源，可借助雨水、灌溉水等进行远距离传播，一般年份可使黄瓜产量损失25%-35%，严重发病时可使黄瓜绝产。枯萎病采用化学防治效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接虽常用于防控但增添技术困难和劳动成本。因此选育抗病品种是解决枯萎病危害的最佳途径。
[0004]黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen.),属半知菌类真菌。病菌产生大小两种类型分生孢子,大型分生孢子纺锤形或镰刀形，无色透明，顶细胞圆锥形，有的微 呈钩状，基部倒圆锥截形或足细胞，具隔膜I~3个。小型分生孢子多生于气生菌丝中，椭圆形或腊肠形，无色透明，无隔膜。厚垣孢子表面光滑，黄褐色。因各地菌株间致病性不同，可以区分出不同生理小种，国外有生理小种I号、2号和3号，我国黄瓜枯萎病菌的致病性与国外不同，命名为生理小种4号。
[0005]克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一。图位克隆(Map-based cloning)是利用分子遗传图谱，把目标性状和分子标记通过遗传连锁作图联系起来，把目标基因定位在与之连锁非常紧密的侧翼标记之间；也可以用群体分离分析法(BSA法)或近等基因系法得到与目标基因连锁的分子标记，然后利用作图群体把该分子标记定位到图谱上。从而由这些标记去筛选大片段DNA文库，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步移(Chromosome walking)形式获得含有目的基因的克隆片段,最终再辅之以转化和互补测验加以验证(王永飞，2001)。目前，运用基于图位克隆技术已分离到了大量的植物基因，尤其是与抗病有关的基因(Zeng ZB，1994 ;易小麦，1998)，但未见有关黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因被成功分离克隆的报道。
【发明内容】
[0006]针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4。
[0007]本发明的目的之二在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记。
[0008]本发明的目的之三在于提供用于扩增上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物。
[0009]本发明的目的之四在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列。
[0010]本发明的目的之五在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白。
[0011]本发明的目的之六在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及遗传标记的应用。
[0012]为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0013]黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4，(a)为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，(b)为与序列表中SEQ ID NO:1所示序列90%以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列相同功能的核苷酸序列。
[0014]本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4是利用抗感遗传群体进行精细定位克隆获得的。本发明选择经典抗病材料WF2757和重要骨干亲本感病材料津研二号，构建RILs-F8^F2:3和F2遗传群体，对抗病基因进行初步定位和精细定位，抗枯萎病基因精细定位在2号染色体的25kb区间范围内，该区间仅存在2个基因，经过NCBI Blast在线比对分析(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/),第 I 个基因为 TIR NB-ARC 抗病基因，第 2 个基因为bHLH96-like的转录因子相关基因。众所周知，TIR NB-ARC基因具有保守结构域是典型的NBS-LRR类抗病基因，因此推测该TIR NB-ARC基因是抗枯萎病的重要候选基因Foc_4，其DNA序列是通过对精细定位区间内的基因序列进行测序获得的。
[0015]上述SEQ ID NO:1所示的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记，感病基因的第3530位的碱基G突变为碱基A。
[0016]用于扩增上述S EQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物，分别具有序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0017]本发明根据已公布的黄瓜基因组9930和GY14序列信息，结合利用Softberry在线预测软件FGENESH(http://sunl.softberry.com/)预测基因结构，并根据预测结果的起始和终止编码序列，设计基因全长扩增引物一对分别为:序列表中SEQ ID NO:7和SEQ IDN0:8所示的核苷酸序列，分别利用抗/感材料基因组DNA进行PCR扩增，获得抗/感材料中基因Foc-4的DNA全长序列SEQ ID NO:1 (抗病材料)和SEQ ID NO: 2 (感病材料)，全长4677bp，并对抗感材料中的两个基因DNA序列进行对比和分析，Foc_4DNA序列在抗/感材料中存在一个SNP位点，即在该基因的第3530位，感病材料的碱基为G，抗病材料的碱基为A，其可以应用于开发抗枯萎病分子标记。
[0018]上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc_4的cDNA序列为序列表中SEQID N0:3所示的核苷酸序列。
[0019]本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因F0C-4CDNA(mRNA)序列是利用全长引物SEQ IDNO: 7和SEQ ID NO: 8作为上下游引物以抗/感材料的总RNA反转录后第一链作为模板进行PCR扩增获得的抗/感材料中的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA，在抗/感材料中的基因 Foc-4 的 cDNA (mRNA)序列全长分别为 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4，利用 Softberry 在线预测Foc-4序列，获得cDNA结构，并绘制Foc-4基因的结构示意图(参见图1)。通过SEQID NO: 3和SEQ ID NO:4序列的对比,黄瓜抗枯萎病基因Foc_4的cDNA (mRNA)在抗/感材料中存在可变剪切差异，导致F oc-4的cDNA在感病材料中的第5外显子比在抗病材料中大270bp，推测由于该可变剪切的存在导致基因重要结构域发生改变，从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。
[0020]上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc_4的编码蛋白为序列表中的SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
[0021]本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因氨基酸序列是利用Foc-4基因在抗/感材料中的cDNA (mRNA)序列SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:4,分别经过softberry在线预测软件翻译获得抗/感材料中F0C-4氨基酸(蛋白)序列SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6，并对抗/感材料中的F0C-4氨基酸序列进行比对分析，F0C-4在抗/感病材料中存在90aa的差异，推测该差异导致抗病结构域发生改变，从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。
[0022]上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
[0023]上述遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
[0024]上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
[0025]上述遗传标记在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
[0026]本发明具有如下有益效果:
[0027]本发明利用图位克隆和正向遗传学方法，对黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4进行精细定位和克隆，获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4，并研究该基因在抗/感病材料中的核酸序列和氨基酸序列进行分析和比对，获得黄瓜抗枯萎病基因Foc-4在抗/感病材料中差异和多态性分 析，并验证了该枯萎病抗病基因Foc-4的功能。本发明提供的抗病基因Foc-4具有重要的应用价值，可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，包括但不限于SNP (单核苷酸多态)、InDel (插入缺失多态)、RFLP (限制性内切酶长度多态)、CAP (切割扩增片段多态)，用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种效率；另外，本发明的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4还可以用于选育黄瓜黑星病抗病品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是黄瓜枯萎病基因精细定位区间基因Foc-4结构示意图。图1 (A)和图1(B)分别为抗/感材料中基因Foc-4的结构示意图，抗病Foc-4基因在抗/感材料中的第5外显子的大小存在差异。(Foc-4基因在染色体基因组上是反向插入的，因此图中显示的第3外显子实际为Foc-4基因的第5外显子)。
[0029]图2是黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4定位连锁图谱，其中左图为黄瓜枯萎病基因初定位不意图，中图为枯委病抗病基因精细定位不意图，右图为25kb区间范围内基因分布情况及基因注释。
[0030]图3是Foc-4基因SNP分子标记酶切验证结果示意图。
【具体实施方式】
[0031]下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。
[0032]实施例1:黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的获得
[0033]一、黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4初步定位和精细定位
[0034]具体的定位方法包括以下步骤:
[0035]A、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究亲本及遗传群体:[0036]分别选择WF2757 (父本)和津研二号(母本)为抗感亲本，构建90个RIL-F8株系，130株的F2:3群体和超过2000株的F2大群体。其中，父本WF2757和母本津研二号购自北京市农作物种质资源库。
[0037]B、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究病情指数调查:
[0038]将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28°C恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。
[0039]供试菌种黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小种4号是通过黄仲生等的中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治文献(中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治，华北农学报，1994，9 (4):81-86)中记载的方法分离获得。采用翁祖信等(黄瓜枯萎病抗病性鉴定方法研究一胚根接种法，中国蔬菜，1985年02期)的方法制备黄瓜枯萎病菌液，血球计数板测定孢子浓度。采用浸根接种法:当黄瓜幼苗子叶展平时，拔出幼苗，用水洗净根部，在I X IO6~5 X IO6个孢子/mL的接种液中浸根，然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(规格6.5cmX 6.5cm)中，在温室中培养。白天维持在24~28°C，夜间在16~20°C。3次重复，每次重复30株。
[0040]按上述方法接种后7~IOd进行病情调查。病情分级标准为:0级:无症状；1级:I片子叶黄化；2级:2片子叶黄化或萎蔫；3级:1片真叶轻度萎蔫；4级:1~2片真叶明显萎蔫；5级:全株严重萎蔫或枯死。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。
[0041]对亲本及各群体的病情进行精确统计。
[0042]C、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的初步定位:
[0043]利用 Cavagnaro 等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber, BMC Genomics, 2010)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息,结合90个RIL-F8株系和130株的F2:3群体病情指数的精确统计，对亲本和RIL群体进行分子标记分析，编码采集亲本及RILs群体各单株`基因型数据。母本基因型记为A，父本的基因型记为B，F1杂合基因型记为H，模糊或缺失数据记为U。用x2test对数据进行比例适合性检验分析，采用JoinMap4.0软件(Staml993 ；Van 0oijen2001)构建连锁图谱(参见图2)，设置软件LOD阀值为4.0以及选取Kosambi公式(Kosambi 1944)，将黄瓜抗枯萎病基因初步定位在2号染色体的分子标记UW017820和UW084909之间的160kb区间内(参见图2)，根据Li等(RNA-Seq improves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome, BMCgenomics, 2011)对黄瓜基因组的注释并通过Softberry在线软件进行预测,该区间存在一个由多个NBS-LRR抗病基因组成的NBS-LRR串联抗病基因(NBS-LRR为抗病基因保守结构域)，难以预测和选择候选基因，所以需要进一步扩大群体进行精细定位研究。
[0044]D、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的精细定位:
[0045]经过构建超过2000株的F2大群体继续对抗枯萎病基因进行精细定位，同时,本实验室对所用抗感亲本进行了基因组重测序，经过生物信息比对分析，在双亲间开发了 79560个Indel和108727个SNP分子标记，在初定位区间的160kb范围内选择设计了 14对Indel分子标记(参见表1)进行群体分析，经过验证后利用这14对Indel标记对抗枯萎病基因进行了精细定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，同样利用JoinMap4.0软件进行遗传连锁作图分析，最终在2000株的F2大群体将抗枯萎病基因精细定位到分子标记UW017805和Indel2027634的25kb的范围内，在精细定位区间内近2300株的试验材料中存在1个交换单株。
[0046]釆用上述14对Indel分子标记进行精细定位时的各PCR反应体系(10 μ L)如下:25ng 模板 DNA，0.5μΜ 上游引物，0.5μΜ 下游引物，0.2mM 的 dNTP mix ；0.5U Taq DNA 聚合酶，1×PCR Buffer (Fermentas) 2 μ L，ddH20 补足到 10 μ L。
[0047]PCR 反应程序为:阶段 1:95 °C 预变性 3min ;阶段 2:94 °C 30s，60 °C lmin，72°C lmin，退火温度每个循环降1°C，共8个循环；阶段3:94°C 30s，53°C 30s，72°C lmin,共32个循环；阶段4:72 °C延伸5min;阶段5:4°C保存；其中，PCR仪为购自AppliedBiosystems 公司的 Veriti96well Thermal Cycler。
[0048]表1用于精细定位的14对Indel分子标记引物信息
[0049]
【权利要求】
1.黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4，(a)为序列表中SEQID NO:1所示的核苷酸序列，(b)具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列90%以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列相同功能的核苷酸序列。
2.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记，感病基因的第3530位的碱基G突变为碱基A。
3.用于扩增权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物，分别为序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
4.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列，为序列表中SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。
5.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白，为序列表中的SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
6.权利要求1所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4或者权利要求4所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
7.权利要求2所述的遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
8.权利要求1所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
9.权利要求2所述的遗 传标记在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
【文档编号】C12N15/29GK103882032SQ201410114320
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月25日 优先权日:2014年3月25日
【发明者】温常龙, 许勇, 于拴仓, 毛爱军, 王永健, 张丽蓉, 赵泓, 董从娟 申请人:北京市农林科学院