利用人的抗逆基因HsGST提高植物的抗逆性的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及作物遗传育种领域，具体地说，利用农杆菌将人谷胱甘肽S-转移酶基 因转化到植物中，使之能在植物中高效表达，提高植物的抗逆性。
【背景技术】
[0002] 自然界中，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各 种逆境，植物常在不利的环境条件下生长，如干旱、水涝、盐害、低温、高温、病虫害等。对农 业生产来说，各种逆境是影响作物产量和品质最直接、最重要的因素。因此，加强植物抗性 生理的研宄，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，培育具有抵抗不良环境 性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。
[0003]谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferase，简称GST，EC2. 5. 1. 18)是广 泛分布于动物、植物、鸟类、昆虫及微生物体内的一组多功能同工酶，其主要功能是催化各 种亲电子化合物(如各种环境致癌物、污染物、药物等）与还原型谷胱甘肽的巯基偶联，增加 其疏水性而易于穿越细胞膜，分解后排出体外，从而达到解毒的作用。GST有多种亚型，其 中GSTA是人肝脏中主要的亚型，包括GSTA1，GSTA2,GSTA3,GSTA4,GSTA5五种亚型，占肝脏 GST的65% - 80%，具有重要的解毒功能。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种人谷胱甘肽S-转移酶基因的新用途，将该基因转入植 物中，可提高植物对盐、干旱的耐受性。
[0005] 所说的人抗逆相关基因，是HsGSTA3,它具有SEQIDNol的序列。
[0006] 上述基因编码的蛋白质，它具有SEQIDN〇2的氨基酸序列。
[0007] 上述基因HsGSTA3能用于植物遗传转化，在制备抗逆的转基因植物中的应用。
[0008] 上述所说的人抗逆相关基因HSGSTA3,是通过以下方法得到： 1.PTDS方法获得人抗逆相关基因HsGSTA3 PTDS方法参照Xiong AS等[Xiong AS, Yao QH, Peng RH, Li X，Fan HQ, Cheng ZM, Li Y (2004) A simple, rapid, high-fidelity and cost-effective PCR-based two-step DNA synthesis method for long gene sequence. Nucleic Acids. Res 32， e98]〇
[0009] 该方法共设计16对引物用于基因的合成。在50沿反应体系中，内侧引物 (P2-P31)的添加量为10ng，外侧引物（P1，P32)添加量为100ng，扩增条件为：94 °C预 热 10min;94 °C，30s;54 °C，30s;72 °C，40s;35 个循环；最后 72 °C延伸 10min。使 用的TaqDNA聚合酶为K0DFXtaq酶（Toyobo公司日本）扩增目的基因。经过1. 0%的琼 脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约700bp的片段。
[0010] 2?引物的设计与合成 本发明设计16对引物，外侧引物两端分别引入和feci的酶切位点。引物顺序 为5，一3，。
[0011] PI: AAGGATCCATGGCAGGGAAGCCCAAGCTTCACTACTTCAATGGACGGGGCAGAATGGAGCCCATC CGG P2: CCAGCTGCAGCCAAGAGCCACCGGATGGGCTCCATTCTGCCCCGTCCATTGAAGTAGTGA P3: GCAGAATGGAGCCCATCCGGTGGCTCTTGGCTGCAGCTGGAGTGGAGTTTGAAGAGAAAT P4: ATCTTCTGCAGATCCTATAAATTTCTCTTCAAACTCCACTCCAGCTGCAGCCAAGAGCCA P5: AGTGGAGTTTGAAGAGAAATTTATAGGATCTGCAGAAGATTTGGGAAAGTTAAGAAATGA P6: GCTGGAACATCAAACTCCCATCATTTCTTAACTTTCCCAAATCTTCTGCAGATCCTATAA P7: TTGGGAAAGTTAAGAAATGATGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATT P8: TGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTTGCTGGAACATCAAACTCCCA P9: TGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATTGATGGGATGAAGTTGGTACA P10: AGTTGAGAATGGCTCTGGTCTGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTT P11: GATGGGATGAAGTTGGTACAGACCAGAGCCATTCTCAACTACATTGCCAGCAAATACAAC P12: TTTATGTCTTTCCCGTAGAGGTTGTATTTGCTGGCAATGTAGTTGAGAATGGCTCTGGTC P13: ACATTGCCAGCAAATACAACCTCTACGGGAAAGACATAAAGGAGAGAGCCCTAATTGATA P14: TGCCATACCTTCTGTATACATATCAATTAGGGCTCTCTCCTTTATGTCTTTCCCGTAGAG P15: GGAGAGAGCCCTAATTGATATGTATACAGAAGGTATGGCAGATTTGAATGAAATGATCCT P16: GTCGACATAAGGGCAGAAGAAGGATCATTTCATTCAAATCTGCCATACCTTCTGTATACA P17: GATTTGAATGAAATGATCCTTCTTCTGCCCTTATGTCGACCTGAGGAAAAAGATGCCAA P18: TTCTCTTTGATCAAGGCAATCTTGGCATCTTTTTCCTCAGGTCGACATAAGGGCAGAAGA P19: CTGAGGAAAAAGATGCCAAGATTGCCTTGATCAAAGAGAAAACAAAAAGTCGCTATTTCC P20: TAACACTTTTTCGAAGGCAGGGAAATAGCGACTTTTTGTTTTCTCTTTGATCAAGGCAAT P21: AACAAAAAGTCGCTATTTCCCTGCCTTCGAAAAAGTGTTACAGAGCCATGGACAAGACTA P22: TCAGCTTGTTGCCAACAAGGTAGTCTTGTCCATGGCTCTGTAACACTTTTTCGAAGGCAG P23: CAGAGCCATGGACAAGACTACCTTGTTGGCAACAAGCTGAGCCGGGCTGACATTAGCCTG P24: ACATAGTAGAGAAGTTCCACCAGGCTAATGTCAGCCCGGCTCAGCTTGTTGCCAACAAGG P25: GCCGGGCTGACATTAGCCTGGTGGAACTTCTCTACTATGTGGAAGAGCTTGACTCCAGCC P26: CAGAGGGAAGTTGGAGATAAGGCTGGAGTCAAGCTCTTCCACATAGTAGAGAAGTTCCAC P27: GGAAGAGCTTGACTCCAGCCTTATCTCCAACTTCCCTCTGCTGAAGGCCCTGAAAACCAG P28: CCGTGGGCAGGTTGCTGATTCTGGTTTTCAGGGCCTTCAGCAGAGGGAAGTTGGAGATAA P29: CTGAAGGCCCTGAAAACCAGAATCAGCAACCTGCCCACGGTGAAGAAGTTTCTACAGCCT P30: GGAGGCTTCCTTGGGCTGCCAGGCTGTAGAAACTTCTTCACCGTGGGCAGGTTGCTGATT P31: TGAAGAAGTTTCTACAGCCTGGCAGCCCAAGGAAGCCTCCCGCAGATGCAAAAGCTTTAG P32: AAGAGCTCCTGAAAATCTTTCTGGCTTCTTCTAAAGCTTTTGCATCTGCGGGAGGCTTCCTTGGGCTG CC 引物由上海生工生物工程技术有限公司合成（http://www. sangon. com)。
[0012] 3.克隆鉴定与序列测定 扩增片段采用爱思进生物技术(杭州）有限公司（http://axygenbio. com) DNA琼 脂糖凝胶回收试剂盒回收后，克隆到大连宝生物有限公司（http://takara.com.cn)的 pMD-18-SimpleT载体上进行克隆鉴定和序列测定。
[0013] 4?序列分析 本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得人抗逆相关基因HsGSTA3,其核苷酸序列信 息如SEQIDNol所示，其氨基酸序列如SEQIDNo2所示。
[0014] 本发明所述的抗逆基因HsGSTA3能用于植物遗传转化，在培育提高抗逆性植物中 的应用。
[0015] 本发明实现的有益效果： 本发明克隆了人HsGSTA3基因，为了进一步分析该基因在盐、干旱逆境中的作用与功 能，我们比较了转HsGSTA3基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对盐、干旱胁迫的耐受 性。结果表明，野生型拟南芥和转HsGSTA3基因的拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转 基因植株比野生型植株有明显的抗盐、抗干旱能力，这也表明HsGSTA3基因的转入提高了 拟南芥植株的抗盐、抗干旱能力。
【附图说明】
[0016]图1 :琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0018] 下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括： 拟南芥L.)的种子经过2.5% (￥八）〇3(010)2消毒后种植在 黑土：蛭石：珍珠岩（3 :9 :1)的混合基质中，22 °C，16h光照培养（16h光照，8h黑暗，冷 光源）生长至抽薹。
[0019] 大肠杆菌（fccAericAiaco7i)DH5a由上海市农业科学院生物技术研宄所植物基 因工程研宄室保存。克隆载体PMD-18-SimpleT、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、 dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都 从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
[0020] 下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【SambookJ，FretsEF， Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press?1989]〇
[0021] 实施例1 PTDS方法获得人抗逆相关基因HsGSTA3基因片段 (一）试验方法： 本发明设计16对引物（P1 -P32)，为了克隆鉴定等构建需要，外侧引物两端分别引入HI和5^I的酶切位点。弓丨物顺序为5' - 3、
[0022] P1: AAGGATCCATGGCAGGGAAGCCCAAGCTTCACTACTTCAATGGACGG