病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及花弁生物技术领域，具体设及一种病毒诱导的石竹八氨番茄红素脱氨 酶基因高效沉默体系。
【背景技术】
[0002] 石竹为石竹科石竹属植物，原产于，由于其具有耐寒、抗旱、抗盐碱、花色众多等优 点，因此在花坛、地被等园林上广泛应用。研究石竹抗逆机理，获得抗逆基因，进而对同属植 物进行遗传改良，可W增加北方园林用植物种类，达到节约型绿化的目的。但目前缺乏对 控制运些性状基因功能进行快速、有效验证的体系。VIGS(virus-in化cedgenesilence, VIG巧技术已应用于多种植物进行基因功能验证，但由于石竹抗逆性强，该体系目前在石竹 上尚无应用。
【发明内容】
[0003] 为解决上述问题，本发明提供了一种病毒诱导的石竹八氨番茄红素脱氨酶基因高 效沉默体系，可W获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。
[0004] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0005] 病毒诱导的石竹八氨番茄红素脱氨酶基因高效沉默体系，包括如下步骤：
[0006] S1、采用八氨番茄红素脱氨酶（PDS)的编码基因序列设计特异引物，引物分别为
[0007] 4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
[0008] 4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
[0009] S2、从石竹中克隆PDS基因，通过RT-PCR在石竹中扩增出SOObp大小的PDS基因 片段，并将片段连接到pGEMT-easy载体上；
[0010] S3、将连接到载体PGEMT-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的 TRV2载体上；
[0011] S4、将步骤S3所得的PTRV2-PDS5000转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR 鉴定；
[001引 S5、室溫下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液（MES+MgC12+Aceto)中活化4h 后，采用浓度为IOOum的乙酷下香酬对4叶期的石竹幼苗室溫下进行高压侵染，待叶片出现 水溃状时，表明侵染完成；
[0013] S6、将侵染后的石竹幼苗先放在15°C下预培养2d后，10°C下继续预培养5d;
[0014] S7、然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20°C，光照为4000LUX的培养箱中进行培 养，15-20d后，出现叶片漂白现象。
[001引其中，所述步骤S5中高压侵染的压力为0. 08MPa。
[0016] 本发明具有W下有益效果：
[0017] 根据八氨番茄红素脱氨酶（PD巧的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石 竹中扩增出大约50化P的CDNA片段。将获得的PDSCDNA片段连接到TRV2上，通过优化 农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系，根据植株出现光漂白的频率、漂白的叶面积大小、漂 白的状况，将乙酷下香酬浓度、苗龄、侵染后预培养的溫度W及预培养后植株的光照条件进 行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，可W获得病毒诱导的基因沉默性 状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例病毒诱导的石竹八氨番茄红素脱氨酶基因高效沉默体系的 流程框图。
[0019] 图2为本发明实施例中龙葵、烟草及石竹PDS核巧酸水平同源性比较。
【具体实施方式】
[0020] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，W下结合实施例对本发明进行进一步 详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于限定本发 明。
[0021] 如图1所示，本发明实施例提供了病毒诱导的石竹八氨番茄红素脱氨酶基因高效 沉默体系，包括如下步骤：
[002引 S1、采用八氨番茄红素脱氨酶（PDS)的编码基因序列设计特异引物，引物分别为
[0023] 4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA
[0024] 4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG
[00巧]S2、从石竹中克隆PDS基因，通过RT-PCR在石竹中扩增出SOObp大小的PDS基因 片段，并将片段连接到pGEMT-easy载体上；
[0026]S3、将连接到载体pGEMT-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的 TRV2载体上；
[0027]S4、将步骤S3所得的PTRV2-PDS5000转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR 鉴定；
[0028]S5、室溫下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液（MES+MgC12+Aceto)中活化 地后，采用浓度为IOOum的乙酷下香酬对4叶期的石竹幼苗室溫下进行高压侵染，压力为 0. 08MPa，待叶片出现水溃状时，表明侵染完成；
[0029]S6、将侵染后的石竹幼苗先放在15°C下预培养2d后，10°C下继续预培养5d;
[0030]S7、然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20°C，光照为4000LUX的培养箱中进行培 养，15-20d后，出现叶片漂白现象。
[00引]实施例
[003引步骤一、设计引物扩增了不同大小的PDS片段，引物分别为
[0037]步骤二、通过RT-PCR扩增，W4F和4R为引物扩增的500bp大小的片段；W6F和 6R为引物扩增的260bp大小的片段；
[003引步骤S、获得的片段连接到pGEMT-easy上测序，比对结果如下（图2)。表明扩增 的片段与PDS基因有高度同源性。
[0039] 步骤四、将连接到载体pGEMT-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切 后的TRV2载体上，然后进行酶切验证。PTRV2-PDS500和PTRV2-PDS260经EcoRI剪切后，分 别获得的10. 0化和50化P，W及10. 0化和26化P的酶切片段。
[0040] 步骤五、将连接了不同PDS片段大小的TRV2转入农杆菌GV3101中，阳性克隆进行 PCR检测，然后侵染石竹幼苗。经农杆菌侵染石竹幼苗后，连接了 26化PPDS大小的载体侵染 效果不好，未出现叶片漂白现象，而连接了 5(K)bpPDS大小的载体侵染效果好，出现叶片漂 白现象。
[0041] 步骤六、建立侵染体系
[0042] 分别采用不同浓度的乙酷下香酬配制侵染液，对不同苗龄的石竹幼苗进行浸染处 理，而后在10°C、15°C低溫条件下处理一周，在正常溫度、不同光强的外界条件下培养石竹 幼苗两周W上，观察记录侵染结果。
[0043] 表1不同浓度的乙酷下香酬的侵染效果比较
[0044]
[0045]表2不同苗龄的石竹幼苗的侵染效果比较
[0046]
[0047] 表3侵染后不同溫度预处理与20°C培养下不同光照强度协同作用对PDS漂白效果 的影响
[0048]
[0049] 如表1-3可知，侵染体系为：浓度为IOOum的乙酷下香酬的侵染四片真叶的石竹幼 苗，侵染后在15°C下预培养2d后，10°C下继续预培养5山然后放在20°C、光照为4000LUX下 进行培养，侵染效率最高，植株侵染率20 %。
[0050] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W作出若干改进和润饰，运些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，其特征在于，包括如下步 骤： 51、 采用八氢番茄红素脱氢酶（ros)的编码基因序列设计特异引物，引物分别为 4F：GATGAGGATGGGGACTGGTA 4R：ATTTAGCGCCTTTGACATGG 52、 从石竹中克隆PDS基因，通过RT-PCR在石竹中扩增出500bp大小的PDS基因片段， 并将片段连接到pGEMT-easy载体上； 53、 将连接到载体pGEMT-easy上的PDS片段用酶切后连接到采用同样酶切后的TRV2 载体上； 54、 将步骤S3所得的pTRV2-PDS5000转入GV3101农杆菌中，进行阳性克隆的PCR鉴 定； 55、 室温下将含有重组质粒的农杆菌在渗透缓冲液（MES+MgC12+Aceto)中活化4h后， 采用浓度为l〇〇um的乙酰丁香酮对4叶期的石竹幼苗室温下进行高压侵染，待叶片出现水 渍状时，表明侵染完成； 56、 将侵染后的石竹幼苗先放在15°C下预培养2d后，10°C下继续预培养5d; 57、 然后步骤S6处理后的石竹幼苗放在20°C，光照为4000LUX的培养箱中进行培养， 15-20d后，出现叶片漂白现象。2. 根据权利要求1所述的病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，其 特征在于，所述步骤S5中高压侵染的压力为0. 08MPa。
【专利摘要】本发明公开了一种病毒诱导的石竹八氢番茄红素脱氢酶基因高效沉默体系，根据八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因序列设计特异引物，通过RT-PCR在石竹中扩增出大约500bp的cDNA片段。将获得的PDS？cDNA片段连接到TRV2上，通过优化农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系，根据植株出现光漂白的频率、漂白的叶面积大小、漂白的状况，将乙酰丁香酮浓度、苗龄、侵染后预培养的温度以及预培养后植株的光照条件进行配套整合，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，可以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证石竹基因功能的问题。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN105296535
【申请号】CN201510559160
【发明人】贺学勤, 张婧
【申请人】内蒙古农业大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年8月30日