拟南芥维生素B1合成酶基因AtTHI1在植物生长发育和抗干旱中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种拟南芥维生素Bl(VBl)合成酶基因的应用，尤其涉及拟南芥维生素B1合成酶基因AtTHIl(Gene ID:835567)在植物生长发育和调控气孔运动及抗干旱中的应用，属于分子生物学、基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]通过生物信息学对已公布的拟南芥维生素B1合成酶基因AtTHIl基因序列(Gene ID:835567)分析，表明其编码维生素B1 (VB1)合成代谢酶THI1。VB1又称硫胺素(Thiamine)，是生物体内一种重要的代谢物质，其二磷酸盐TDP是许多重要酶的辅因子。
[0003]已知的研究结果表明拟南芥维生素B1合成酶基因AtTHIl在植物保卫细胞中大量表达。但是通过检索和对已经有AtTHIl基因序列的公布及VB1合成功能的分析，有关拟南芥维生素B1合成酶基因AtTHIl在植物生长发育和调控气孔运动及抗干旱中的应用还未见报道。
【发明内容】
[0004]针对现有研究的不足，本发明的目的是提供一种拟南芥维生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生长发育和调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。
[0005]本发明所述拟南芥维生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生长发育和调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。
[0006]其中:所述拟南芥硫胺素(VB1)合成酶基因AtTHIl核苷酸序列见GeneID:835567，所述植物优选是十字花科植物，所述十字花科植物优选是拟南芥、芥菜、油菜、白菜或甘蓝。
[0007]本发明首先验证AtTHIl基因的表达突变体CS3573和CS3590为有效突变，通过生长实验，证明AtTHIl的正常表达对植物的生长发育必不可少(结果见图1)。然后根据已公布的AtTHIl基因核苷酸序列(Gene ID:835567)，通过RT-PCR技术从拟南芥中克隆基因AtTHI 1。利用得到的基因片段构建植物表达载体pSTART-THI 1，经过分子学和遗传学操作获得AtTHI过表达植株(命名为THI1-0E-8、THI1-0E-14)。经气孔运动、离体叶片失水、植物抗干旱等生理性状分析，阐明AtTHIl的过表达降低植物对脱落酸(ΑΒΑ)促进气孔关闭过程的敏感性，使转基因植株的离体叶片失水率降低，抗干旱能力增强(结果见图2、图3)，进一步证实拟南芥维生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在调控气孔运动及植物抗干旱中的应用。
[0008]本发明首次阐明了拟南芥维生素B1 (VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生长发育和调控气孔运动及植物抗干旱中的应用，为利用AtTHIl基因调控气孔的张开和闭合以实现调控植物体内的保水性及抗干旱能力奠定了基础，预示本发明的应用将有助于改良植物的抗旱胁迫能力，对培育抗旱高产的作物新品种有重要的理论指导意义，对我国农业生产具有巨大应用价值。
【附图说明】
[0009]图1:AtTHIl突变体影响植物生长发育
[0010]在正常培育条件下(无VB1添加)，AtTHIl突变体(CS3573，CS3590)生长10天的小苗真叶发生白化，后期枯萎，不能完成正常的生长周期；外源添加VB1的条件下，AtTHIl突变体(CS3573，CS3590)可以保持正常的生长，30天后，同野生型(Col_0)保持一样的生长状态。说明AtTHIl在植物体内VB1合成过程中起到重要的作用，发生突变后会导致植物条件性致死。
[0011]图2:AtTHIl过表达植株离体叶片失水率降低。
[0012]其中A:THI1基因表达量水平鉴定；B:气孔开度统计结果；C:植株离体叶片失水率结果。
[0013]通过转基因技术，得到THI1过表达植株THI 1_0E_8、THI1-0E-14，两者体内THI1的表达量明显高于野生型Col-Ο (如图2-A)。
[0014]在ΑΒΑ促进气孔关闭过程中ΤΗΙ1-0Ε-8、ΤΗΙ1-0Ε-14的气孔开度比野生型(Col_0)小，对ΑΒΑ的作用过敏感(如图2-Β);另外，与野生型(Col-Ο)对比，AtTHIl过表达植株(THI1-0E-8.THI1-0E-14)离体叶片失水减慢(如图2-C)。说明AtTHIl过表达后促进ΑΒΑ诱导气孔关闭过程，进而减少植物体内水分散失。
[0015]图3:AtTHIl过表达提高植物抗旱性
[0016]干旱处理下，与野生型(Col-Ο)对比，AtTHIl过表达植株(THI1-0E-8、THI1-0E-14)抗干旱能力增强，同样干旱条件下存活率更高(如图3)。说明AtTHIl过表达提高植物的抗干旱能力，在培育抗逆高产作物新品种中有重要的应用潜质。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例用于阐明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照产品制造生产厂商的使用说明。
[0018]实施例1拟南芥AtTHIl突变体的获得和分子鉴定
[0019]1，订购AtTHI 1突变体
[0020]通过拟南芥生物信息学网站TAIR(http://www.arabidopsis.0rg/)，查询 AtTHIl突变体，选取CS3573，CS3590两个独立株系进行验证和后续实验分析。
[0021]2，测序验证突变体中AtTHIl基因核苷酸序列
[0022]首先提取突变体总RNA，反转录后得到cDNA为模板进行PCR扩增。
[0023]PCR所用到的上游引物和下游引物分别是:
[0024]THI1-F:5’ -ATGGCTGCCATAGCTTCT-3’
[0025]THI1-R:5’-TTAAGCATCTACGGTTTCAG-3’
[0026]PCR产物送博尚公司测序。
[0027]测序结果证明，CS3573，CS3590突变体中，AtTHIl基因序列分别发生核苷酸替换和缺失，导致AtTHIl无法按照正常密码子序列翻译表达蛋白。
[0028]实施例2拟南芥AtTHIl过表达植株获得
[0029]1，PCR方法克隆AtTHIl基因片段
[0030]以拟南芥总RNA反转录获得的cDNA为模板，以下面引物组合进行PCR扩增:
[0031 ] THI 1-0E-F:5’ -TAGGATCCATGGCTGCCATAGCTTCT-3’
[0032]THI1-0E-R:5’-GTGAGCTCTTAAGCATCTACGGTTTCAG-3’
[0033]PCR产物电泳检测，切胶回收目的条带，纯化得到AtTHIl基因片段。
[0034]2，载体连接和转化
[0035]首先用纯化后的AtTHIl基因片段连接中间克隆载体Blunt (北京全式金公司产品)，转化大肠杆菌DH5a，通过抗生素筛选和菌落PCR得到阳性克隆；连接后的Blunt载体进行测序，获得测序完