一种同步检测PCV2和PRV感染的引物序列及方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于同步检测pcv2和prv混合感染的引物序列及方法。

背景技术：

猪圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)和猪伪狂犬病毒(porcinepseudorabiesvirus，prv)感染是当前我国养猪生产中普遍存在且危害严重的dna病毒病。其中，pcv2爆发时死亡率可达50％以上，因此其已成为当前我国养猪业中最重要的传染病。prv属于疱疹病毒科α疱疹病毒亚科，其感染会引起成年妊娠母猪流产、死胎、木乃伊、新生仔猪急性死亡以及三周龄以内的仔猪表现神经症状和高死亡率；据调查目前我国规模猪场伪狂犬病的血清阳性率达70％以上，危害严重。以上2种病原在临床上较为常见，并且常常混合感染，其引发的疾病已经给养猪业造成严重的经济损失。

传统的pcv2感染和prv感染的检测方法有病毒分离、实验动物接种和血清学试验等方法，这些方法操作繁琐、检测周期长、有的存在非特异性反应和敏感度低等缺点，已经不能满足养殖业的防病需求。随着分子生物学的发展，pcr检测方法可以快速、高效地对病原体进行检测。

聚合酶链反应(pcr)是体外酶促合成特异dna片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测周期短等特点，不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断。

常规pcr操作简单，技术要求低，但对于多种病毒混合感染需要进行多次pcr检测，进而延长了检测周期，增加了检测成本。复合pcr是指在同一pcr反应体系中加入多对引物，同时对多个目的基因进行扩增的方法；利用该方法同时检测多个目的基因省时省力省成本，但反应体系中存在的引物很容易形成复杂的引物二聚体，进而影响检测的灵敏度和准确性，因此复合pcr的成功关键在于设计引物的特异性、反应体系和程序的优化。

现有技术中有通过多重rt-pcr对猪的多种病毒进行检测的方法，但其对rna浓度、质量要求较高，检测过程中极易受到基因组dna和rna酶的污染，因此，其对操作人员技术要求较高，不利于广泛推广应用。此外，也存在多重荧光pcr的检测方法，但其探针所标记不同发光波长的荧光基团之间很容易互相干扰，进而影响特异性检测。

由此可见，对于pcv2和prv感染进行同步检测的方法仍存在很大的发展空间，本领域技术人员亟待设计一种操作简便、技术要求低、特异性高、稳定性强、重复性好的pcv2、prv同步检测方法。

技术实现要素：

基于现有技术的不足之处，本发明提供一种能够同时检测pcv2和prv混合感染的方法。

本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：

一种同步检测pcv2和prv感染的引物序列，其特征在于：包括pcv2病毒引物序列和prv病毒引物序列；其中，所述pcv2病毒引物序列包括上游引物pcv2-f1和下游引物pcv2-f2；所述prv病毒引物序列包括上游引物prv-f3和下游引物prv-f4；所述pcv2-f1、pcv2-f2、prv-f3和prv-f4的核苷酸序列分别如序列表seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4所示。

一种同步检测pcv2和prv感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据genbank中登录的pcv2orf2基因和prvgh基因的核苷酸序列设计如权利要求1所示的两对特异性引物；

(2)使用所述两对特异性引物对待测样本进行复合pcr扩增，得到pcr产物，进行琼脂糖凝胶电泳检测；若出现470bp大小的条带，则待测样品中含有pcv2病毒；若出现298bp大小的条带，则待测样品中含有prv病毒。

进一步地，所述复合pcr扩增的反应体系为50.0μl，其中：10×buffer5.0μl、2.0mmmgcl24.0μl、200μmdntps5.0μl、0.1μmpcv2-f11.0μl、0.1μmpcv2-f21.0μl、0.2μmprv-f32.0μl、0.2μmprv-f42.0μl、rtaqdnapolymerase0.5μl、dna模板2.0μl、ddh2o27.5μl。

进一步地，所述复合pcr扩增的反应程序为95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；最后72℃延伸10min。

有益效果：本发明提供了用于pcv2和prv同步检测的两对特异性引物和复合pcr检测方法。通过比对genbank数据库中15种pcv2病毒株、18种prv病毒株的基因共有特征及pcv2orf1、prvgh基因的核苷酸序列，应用primerpremier软件分别设计了两对特异性引物，其gc含量相当，退火温度相近，特异性强，不会产生引物二聚体，并且扩增出的pcv2和prv片段大小适当，可在琼脂糖凝胶电泳中进行明确区分，便于直观地观察实验结果。本发明通过复合pcr各技术参数的合理设置，同步检测pcv2和prv，操作简单、方便、可公式化，技术要求低，成本低廉，省时省力，并且保证了良好的特异性、灵敏性和稳定性，适于临床推广应用。

附图说明

图1所示为本发明复合pcr扩增试验结果；图中m为puc19dna/mspιmarker，1为pcv2dna扩增产物；2为prvdna扩增产物；pcv2dna与prvdna混合模板的扩增产物。

图2所示为本发明复合pcr的特异性试验结果；图中m为puc19dna/mspιmarker，1为pcv2dna与prvdna混合模板的扩增产物；2为ppvdna扩增产物；3为etecdna扩增产物；4为appdna扩增产物。

图3所示为本发明复合pcr的敏感性试验结果；图中m为puc19dna/mspιmarker，1-8为pcv2dna与prvdna混合模板10^-1-10^-8稀释倍数下扩增产物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步详述：

实施例1

(1)引物的设计与合成

通过比对genbank数据库中15种pcv2病毒株、18种prv病毒株的基因共有特征及pcv2orf1(seqidno.5)、prvgh(seqidno.6)基因的核苷酸序列，应用primerpremier软件分别设计了两对特异性引物，包括pcv2病毒引物和prv病毒引物。

其中，pcv2病毒引物包括上游引物pcv2-f1和下游引物pcv2-f2；prv病毒引物包括上游引物prv-f3和下游引物prv-f4；pcv2-f1、pcv2-f2、prv-f3和prv-f4的核苷酸序列分别如表1所示。引物由上海生工生物工程有限公司合成，预计扩增产物大小分别为470bp和298bp。

表1

(2)病毒基因组dna的提取

分别取pcv2、prv阳性病料各0.1克，置于eppendorf管中，加入te缓冲液1ml，用捻磨棒捻成匀浆，-70℃冻融三次，离心取上清0.2ml，再用病毒dna提取试剂盒提取病毒dna，最后洗脱于50μlte缓冲液中，于-20℃保存。

(3)复合pcr检测；

以pcv2dna或prvdna或pcv2dna与prvdna1：1混合作为dna模板，进行复合pcr扩增，复合pcr扩增的反应体系为50.0μl，其中：10×buffer5.0μl、2.0mmmgcl24.0μl、200μmdntps5.0μl、0.1μmpcv2-f11.0μl、0.1μmpcv2-f21.0μl、0.2μmprv-f32.0μl、0.2μmprv-f42.0μl、rtaqdnapolymerase0.5μl、dna模板2.0μl、ddh2o27.5μl。

复合pcr扩增的反应程序为95℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存备用。

反应结束后，对pcr扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。1号泳道中扩增出一条清晰的目的条带，约470bp，与预期大小相当；将pcr产物纯化回收后，连接到pgem-t载体中克隆、转化、测序，序列分析表明，所克隆的目的dna片段大小为470bp，为预期扩增的目的dna片段，证明样品中含有pcv2。

2号泳道中扩增出一条清晰的目的条带，约298bp，与预期大小相当；将pcr产物纯化回收后，连接到pgem-t载体中克隆、转化、测序，序列分析表明，所克隆的目的dna片段大小为298bp，为预期扩增的目的dna片段，证明待测样品中含有prv。

3号泳道中同时扩增出两条清晰的目的条带，分别约为470bp和298bp，与预期大小相当；将pcr产物纯化回收后，连接到pgem-t载体中克隆、转化、测序，序列分析表明，所克隆的目的dna片段大小分别为470bp和298bp，为预期扩增的目的dna片段，证明待测样品中同时含有pcv2和prv。

由上可知，本发明复合pcr两对特异性引物gc含量相当，引物间交叉反应弱，退火温度均在56℃左右，均可扩增出预期目的片段，特异性强；扩增出的pcv2和prv片段大小适当，可在琼脂糖凝胶电泳中进行明确区分，便于直观地观察实验结果；mgcl2、dntps、rtaqdnapolymerase及引物浓度均是综合考虑扩增效率、灵敏度、特异性、稳定性等众多因素设计的，可有效检出pcv2和prv。

实施例2

用病毒基因组dna试剂盒分别提取猪细小病毒(ppv)、猪大肠杆菌(etec)、猪胸膜肺炎放线杆菌(app)基因组dna，应用实施例1中所述的复合pcr引物及方法进行扩增、电泳，以检测复合pcr的特异性。

检测结果如图2所示，pcv2与prv的混合dna能扩增出特异性片段，而ppv、etec、app均未扩增出片段，由此证实了复合pcr扩增的特异性。

实施例3

用紫外分光光度计测定pcv2dna和prvdna混合模板的浓度，混合dna模板浓度约为1μg/μl，用te缓冲液将混合模板作1:10系列稀释，每个稀释度取2μl作为模板，应用实施例1中所述的复合pcr引物及方法进行复合pcr扩增，电泳，以检测复合pcr的敏感性。

检测结果如图3所示，10^-3稀释倍数时仍能扩增出470bp和298bp两条带，10^-5稀释时仅能扩增出470bp一条带。说明复合pcr能检测到1ng的prv和0.01ng的pcv2。

实施例4

将pcv2和prv阳性病料于-70℃保存；两对特异性引物混合，酶试剂、mgcl2及dntps混合，于-20℃保存。每隔1个月，将-70℃保存的pcv2和prv阳性病料重新提取dna，取出-20℃保存的复合pcr反应体系的各种混合试剂进行pcr扩增，共检测3个月，以验证复合pcr的稳定性。

3个月的检测结果显示：每次均能扩增出预期目的片段，且眼观浓度相当，证明了复合pcr反应体系的稳定性。

实施例5

对浙江省不同地区的73份临床疑似病料进行检测，结果表明该方法不仅大大节约检测时间而且消耗试剂少，降低污染机会，具有很好的实际应用价值，适于推广应用。检测中pcv2的阳性检出率高，达到57.5％，该阳性检出率与pcv2的实际感染率符合程度较高；另外，pcv2与prv混合感染阳性检出率为6.8％，与实际的混合感染率相符；由此可见，利于本发明可有效筛选出猪群中的感染个体，进而及时防止病毒感染的扩散，提高pcv2与prv的病毒防控力度。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>杭州师范大学

<120>一种同步检测pcv2和prv感染的引物序列及方法

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