一种基于荧光定量PCR鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及鉴定方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及鉴定方法。

背景技术：

自1992年首次从小鼠中分离得到小家鼠类螺杆菌后，到目前为止已分离到至少13种啮齿类动物螺杆菌，其中胆汁螺杆菌(helicobacterbilis)、肝螺杆菌(helicobacterhepaticus)、啮齿类螺杆菌(helicobacterrodentium)为较为重要的感染哨齿类动物的螺杆菌，主要存在于消化道，包括盲肠、结肠及肝胆等器官。啮齿动物螺杆菌会引起动物疾病，更易以隐性感染形式存在于免疫缺陷型动物中，感染啮齿类螺杆菌会导致小鼠肝炎、盲肠结肠炎等多种肠肝疾病，另外一同感染啮齿类螺杆菌和胆汁螺杆菌会引起小鼠腹泻。因此，若在科研或生物安全性评价等试验中采用此类实验动物，定会对实验数据造成影响，结果缺乏可靠性。

啮齿类螺杆菌为螺杆菌属，而螺杆菌属的菌种在菌落、菌体形态上差异小、十分相似，采用传统的生理生化特性的基础进行分类鉴定有一定困难，同时，由于螺旋杆菌需在微氧环境中生长，所需设备特殊，营养要求严苛，生长周期长等特点，制约了螺杆菌的常规检测方法的多样。pcr方法是这类生长环境苛刻菌株首选的检测方法，由于pcr在螺杆菌属和种水平上的高特异性和敏感性已经普遍用于啮齿类螺杆菌的检测中，pcr检测技术主要根据16srrna序列设计的引物进行，在生物进化中，16srrna的进化落后于其他基因，因此被称为细菌界的“分子化石”。具有高度保守性，若两种细菌基因达到98.8％以上的同源性，即将其认定为同一属种，此外，该基因序列的长度为1600nt，比较适中，可满足实验引物设计的需求。常规pcr方法在一定程度上提高了检测螺杆菌的敏感性，但在定量及灵敏度等问题上仍存在不足，有待优化完善。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及其鉴定方法，使所述方法具有高特异性、高灵敏度的特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的试剂盒，包括sybr荧光染料taq酶预混液、荧光误差校正液、阳性质控品和上述方案所述引物。

优选的，权利要求1所述的引物的质量浓度优选为10μmol/l。

优选的，所述阳性质控品的质量浓度优选为10⁸ng/μl。

优选的，sybr荧光染料taq酶预混液5ml、荧光误差校正液200μl、阳性质控品2ml和所述的正向引物400μl和所述的反向引物400μl。

本发明还提供了基于所述的试剂盒鉴别啮齿类螺杆菌的鉴别方法，包括以下步骤：

1)提取待测样品总基因组dna，得到待测样本总dna；

2)以所述步骤1)得到的样品总dna为模板，利用所述的引物进行qpcr扩增，得到荧光检测结果；

3)以阳性质控品为阳性对照，以超纯水为阴性对照，待测样品的扩增曲线与阳性质控品的扩增曲线结果一致，且阴性对照没有产生扩增曲线，则判定为样品为啮齿类螺杆菌。

优选的，qpcr扩增的扩增体系包括以下组分含量：

sybr荧光染料taq酶预混液10μl，荧光误差校正液0.4μl，50ng/μl的dna模板2μl，10μmol/l正向引物0.8μl，10μmol/l反向引物0.8μl，ddh2o6μl。

优选的，qpcr扩增的扩增程序为95℃预变性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

本发明提供了一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。本发明提供的引物适用于16srrna荧光定量pcr扩增，并且准确地从肝螺杆菌、胆螺杆菌等多种螺杆菌中鉴别出啮齿类螺杆菌，特异性达100％。

本发明还提供了一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的试剂盒及其鉴别方法，所述试剂盒方便准确地鉴定啮齿类螺杆菌的存在，操作简便，无需进行琼脂糖凝胶电泳，只需荧光定量pcr仪即可完成，实现快速、大通量诊断和检测，降低了鉴别时间和检测成本，研究表明本发明提供的这一荧光pcr检测方法，特异性达100％，灵敏度达30拷贝。

附图说明

图1为2％琼脂糖凝胶电泳检测普通pcr引物特异性结果；

图2为2％琼脂糖凝胶电泳检测普通pcr灵敏度结果；

图3为荧光pcr溶解曲线分析图；

图4荧光pcr扩增动力学曲线；

图5标准曲线图；

图6荧光pcr灵敏度检测结果；

图7特异性检测结果；

图8样品检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。

根据genbank公布的helicobacterrodentium16sribosomalrnagene的基因序列(序列号：u96297.1)设计一对引物，其中正向引物为：5’-gagatagtggagtgctagc-3’(seqidno.1)；反向引物：5’gctccatttcacaatattgc-3’(seqidno.2)，目的片段大小为268bp。所述引物委托上海生工合成。

本发明还提供了一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的试剂盒，包括sybr荧光染料taq酶预混液、荧光误差校正液、阳性质控品和上述方案所述引物。

本发明提供的试剂盒包括正向引物和反向引物。正向引物和反向引物的摩尔浓度优选为10μmol/l。所述的正向引物的体积优选为400μl和所述的反向引物的体积优选为400μl。

本发明提供的试剂盒包括sybr荧光染料taq酶预混液。所述sybr荧光染料taq酶预混液优选为sybrpremixextaqⅱ试剂。在所述试剂盒中，所述sybrpremixextaqⅱ试剂的体积优选为5ml。所述sybrpremixextaqⅱ试剂的来源购自大连宝生物工程有限公司。

本发明提供的试剂盒包括荧光误差校正液。所述荧光误差校正液优选为roxreferencedyeⅱ试剂。所述roxreferencedyeⅱ的体积优选为200μl。所述roxreferencedyeⅱ试剂购自大连宝生物工程有限公司。

本发明提供的试剂盒包括阳性质控品。所述阳性质控品的拷贝含量优选为10¹～10⁸拷贝/μl。所述阳性质控品的体积优选为2ml。

本发明中，所述阳性质控品的制备方法，包括以下步骤：

1)用上述方案中的引物扩增啮齿类螺杆菌，得到的pcr产物经过胶回收后，与plb载体连接，得到重组质粒；

2)将所述重组质粒转化到dh5α大肠杆菌中，筛选得到阳性菌落，菌落扩增使用质粒小提试剂盒提取质粒，得到质粒；

3)经过紫外分光光度计测量吸收值，得到阳性质控品的浓度和拷贝数。

本发明中，所述步骤1)中扩增的程序优选为94℃1min30s；94℃30s，52℃30s，72℃15s，35个循环；72℃1min30s；16℃2h。

本发明中，所述步骤1)中扩增的体系优选包括：10μm的正向引物1μl，10μm的反向引物1μl，taqmax10μl，dna模板2μl和ddh2o6μl。

本发明中，所述连接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的连接方法即可。本发明实施例中，所述连接采用连接试剂盒。所述连接试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

本发明中，所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转化方法即可。

本发明中，所述阳性菌落的筛选方法优选采用菌落pcr法。本发明对所述菌落pcr法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的菌落pcr法即可。本发明中，所述质粒小提试剂盒的来源优选购自为北京天根生化科技有限公司。

本发明中，所述阳性质控品的质量浓度优选为50ng/μl，原始拷贝数为1.5×10¹⁰拷贝/μl。

本发明还提供了基于所述的试剂盒鉴别啮齿类螺杆菌的鉴别方法，包括以下步骤：

①提取样本总基因组dna，得到待测样本总dna；

②以所述步骤①得到的样品总dna为模板，利用上述方案所述的引物进行qpcr扩增，得到荧光检测结果；

③以阳性质控品为阳性对照，以超纯水为阴性对照，待测样品的扩增曲线与阳性质控品的扩增曲线结果一致，且阴性对照没有产生扩增曲线，则判定为样品为啮齿类螺杆菌。

本发明中，所述提取基因组dna的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的提取基因组dna的方法即可。本发明中，所述提取基因组dna的方法采用试剂盒法提取。

提取基因组dna后，本发明优选进行dna浓度的检测。所述检测的方法优选采用核酸定量仪进行检测。根据检测结果，调整模板的浓度至20～120ng/μl。

本发明中，qpcr扩增的扩增体系优选包括以下组分含量：

sybrpremixextaqⅱ10μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，50ng/μl的dna模板2μl，10μmol/l正向引物0.8μl，10μmol/l反向引物0.8μl，ddh2o6μl。

本发明中，qpcr扩增的扩增程序优选为95℃预变性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。

本发明中，qpcr扩增优选采用实时荧光定量pcr仪器(appliedbiosystemsstepone^tmreal-timepcrsystemthermalcyclingblock)进行扩增。所述qpcr扩增设置空白对照和阳性对照。所述空白对照用相同体积的超纯水替换样品鉴别组的模板dna，所述阳性对照用相同体积的阳性质控品替换样品鉴别组的模板dna。空白对照、阳性对照和样品鉴别扩增所用程序相同。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及其鉴定方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

pcr特异性引物的设计

根据genbank公布的helicobacterrodentium16sribosomalrnagene的基因序列(序列号：u96297.1)，目的片段大小为268bp。设计一对引物f：5’-gagatagtggagtgctagc-3’；r：5’gctccatttcacaatattgc-3’，引物由上海生工合成。

实施例2

pcr扩增方法的建立

(1)常规pcr反应体系为20μl：

h.ro-16srrna-f(10μm)1μl；

h.ro-16srrna-r(10μm)1μl；

taqmix10μl；

基因组dna2μl；

ddh2o6μl。

其中，基因组dna分别为肝螺杆菌阴性对照、胆螺杆菌阴性对照、啮齿类螺杆菌。

(2)常规pcr反应程序：

94℃1min30s；94℃30s，52℃30s，72℃15s，35个循环；72℃1min30s；16℃2h。2％琼脂糖凝胶电泳观察pcr结果，如图1所示，各泳道样品具体为：1：dl2000marker，2：空白对照，3：肝螺杆菌阴性对照，4：胆螺杆菌阴性对照，5：啮齿类螺杆菌阳性样品，只有泳道5出现大小约为268bp的条带，并且条带清晰，这说明所述扩增引物对啮齿类螺杆菌具有扩增特异性。

实验例3

阳性质粒标准品制备

将实施例2中啮齿类螺杆菌扩增得到的pcr产物经过胶回收试剂盒回收后，与plb载体连接，经过转化到dh5α大肠杆菌中，筛选得到阳性菌落，菌落扩增使用质粒小提试剂盒提取质粒，得到质粒，经过紫外分光光度计测量浓度为50ng/μl，原始拷贝数为1.5×10¹⁰拷贝/μl。

实施例4

普通pcr敏感性实验

将所得质粒按照10倍稀释得到1.5×10⁰～1.5×10⁸拷贝数/μl，使用1.5～1.5×10⁸拷贝/μl为样本，检测普通pcr灵敏度，反应体系与反应程序实施例2相同。经过2％琼脂糖凝胶电泳如图2所示，1：3×10⁹拷贝/μl，2：3×10⁸拷贝/μl，3：3×10⁷拷贝/μl，4：3×10⁶拷贝/μl，5：3×10⁵拷贝/μl，6：3×10⁴拷贝/μl，7：3×10³拷贝/μl，8：3×10²拷贝/μl，9：30拷贝/μl，10：空白对照，11：dl2000marker。由图2可知，在3×10²拷贝/μl时，目的条带可见。

实施例5

荧光定量pcr反应标准曲线的建立

荧光定量pcr反应标准曲线的建立将标准品进行10倍系列稀释，取15-1.5×10⁶拷贝/μl的6个梯度浓度的质粒作模板，进行实时荧光定量pcr扩增，制作溶解曲线(图3)和标准曲线(图5)。荧光定量pcr反应体系包括sybrpremixextaqⅱ10μl，h.ro-16srrna-f0.8μl，h.ro-16srrna-r0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，dna模板(0.05fg/μl～500pg/μl)2μl，ddh2o6μl。反应程序为95℃预变性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。扩增动力学曲线如图4所示，具体为1：3×10⁶拷贝/μl，2：3×10⁵拷贝/μl，3：3×10⁴拷贝/μl，4：3×10³拷贝/μl，5：3×10²拷贝/μl，6：30拷贝/μl。

由图4所示，指数增长期曲线平行，反映了pcr的扩增效率相近，不同稀释度之间的ct值相差均匀，ct值与拷贝数呈现良好的线性关系。

实施例6

荧光定量pcr敏感性试验

敏感性试验将标准品进行10倍梯度稀释后，取浓度为0.15～1.5×10⁶拷贝/μl的标准品进行荧光定量pcr检测，同时做普通pcr检测。结果图6所示，其中1：3×10⁶拷贝/μl，2：3×10⁵拷贝/μl，3：3×10⁴拷贝/μl，4：3×10³拷贝/μl，5：3×10²拷贝/μl，6：30拷贝/μl，7：3拷贝/μl，8：0.3拷贝/μl，9：空白对照。

图6表明荧光定量pcr检测方法可以检测到30个拷贝/μl的标准品，而常规pcr仅能检测到300个拷贝/μl的标准品，表明建立的h.rodentium实时荧光定量pcr检测方法具有较高的敏感性，比常规pcr至少高10倍。

实施例7

荧光定量pcr的特异性试验

特异性试验检测肝螺杆菌，胆螺杆菌，h.rodentium，方法同实施例5，结果如图7所示。图7表明，只有h.rodentium有荧光信号，发生了扩增反应，而肝螺杆菌，胆螺杆菌未发生任何扩增，说明所述方法具有很好的特异性。

实施例8

荧光定量pcr的样品检测

实验大小鼠粪便dna提取物检测，收集不同实验房大小鼠粪便，使用粪便dna提取试剂盒提取dna，根据如上所示的荧光pcr体系及程序，并添加阳性及空白对照。结果图8所示，其中1：阳性对照，2-14：检测样品，15：空白对照。图8显示，2～15样品均未扩增出如阳性对照所示的扩增曲线，这表明实验动物均未感染h.rodentium。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种基于荧光定量pcr鉴定啮齿类螺杆菌的引物、试剂盒及鉴定方法

<130>1

<160>2

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<213>人工序列

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