本发明涉及肠癌试剂盒检测领域，具体而言，涉及一种肠癌临床用药突变基因检测试剂盒。
背景技术：
：近些年来，靶向治疗使肿瘤的死亡率得到了有效的控制。靶向治疗具有高选择性和低毒性等优点，可以长期指导临床用药，其作用机理是针对肿瘤细胞特有的靶点设计结合药物，避免了传统治疗方法的缺点，从而达到抑制肿瘤细胞分裂增殖的作用，对患者而言不仅延长了患者的生存时间还改善了患者的生存质量。目前，临床上已经确定的与肿瘤或癌症突变相关的基因有很多个，而当这些基因发生突变时，改变了细胞对相应的靶向药物的敏感性，从而引起耐药性。为了更有效地指导临床用药，需要对不同的患病个体进行相应肿瘤突变位点的检测，因而，市场上也出现了各种用于检测不同肿瘤或癌症的相关基因突变的检测试剂盒。而目前市场上各个不同厂家生产的检测试剂盒并无同一标准，因而，使用这类基因突变检测试剂盒的检测结果也存在差异，进而使得检测结果对临床用药的指导意义不大。针对这一现状，目前还没有很好的解决办法。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种肠癌临床用药突变基因检测试剂盒，以解决现有技术中肠癌基因突变的检测试剂盒的检测结果存在多样性而缺乏临床指导意义的问题。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种肠癌临床用药突变基因检测试剂盒，该试剂盒包括文库构建相关试剂，文库构建相关试剂包括2×hifi热启动酶缓冲液，2×hifi热启动酶缓冲液包括：850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真热启动酶和0.5～0.7mm双脱氧核糖核酸。进一步地，2×hifi热启动酶缓冲液包括：900mmtris-hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真热启动酶和0.6mm双脱氧核糖核酸。进一步地，试剂盒还包括：肠癌临床用药突变基因捕获相关试剂，肠癌临床用药突变基因捕获试剂包括肠癌临床用药突变基因捕获探针。进一步地，肠癌临床用药突变基因捕获探针包括表1所示的基因的突变位点的捕获探针：表1：进一步地，表1所示的基因的突变位点的捕获探针在表2所示区域内通过叠瓦式设计获得：表2：进一步地，肠癌临床用药突变基因捕获探针为探针混合物，探针混合物的浓度为20～30ng/μl，优选为25ng/μl。进一步地，肠癌临床用药突变基因捕获试剂还包括杂交通用引物和杂交index引物；优选地，杂交通用引物的浓度为225～275μm，更优选为250μm；优选地，杂交index引物的浓度为22.5～27.5μm，更优选为25μm；优选地，杂交index引物为24～96个，更优选为48个。进一步地，肠癌临床用药突变基因捕获试剂还包括2×杂交缓冲液、杂交组分a以及cotdna，2×杂交缓冲液为2m的四甲基氯化铵缓冲液，杂交组分a为100％的甲酰胺；优选地，肠癌临床用药突变基因捕获试剂还包括2×hifi热启动酶缓冲液和捕获样本富集引物；更优选，肠癌临床用药突变基因捕获试剂中的2×hifi热启动酶缓冲液与文库构建相关试剂中的2×hifi热启动酶缓冲液相同；更优选，捕获样本富集引物的浓度为3～6μm，进一步优选为5μm。进一步地，试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。进一步地，文库构建相关试剂包括：末端修复加a反应体系、接头连接体系以及文库富集引物；优选地，末端修复加a反应体系包括末端修复加a反应缓冲液以及末端修复加a酶，更优选地，末端修复加a反应缓冲液包括400～600mmtris-hcl、80～120mmmgcl2、80～120mmdtt、8～10nmatp、3～5mmdatp、3～5mmdctp、3～5mmdgtp、3～5mmdttp；末端修复加a酶的浓度为0.04～0.06u/μl；优选地，接头连接体系包括双链寡核苷酸接头、dna连接酶以及dna连接酶缓冲液；更优选地，双链寡核苷酸接头为24～96个，进一步优选为48个；dna连接酶的浓度为0.04～0.06u/μl；dna连接酶缓冲液包括800～900mm的tris-hcl、40～60mm的mgcl2、40～60mm的dtt及0.5～1.5mm的atp；优选地，文库富集引物的浓度为3～6μm，进一步优选为5μm。应用本发明的技术方案，通过对文库构建相关试剂中的热启动酶缓冲液进行改进优化，并控制该热启动酶缓冲液体系包含850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/ul高保真热启动酶以及0.5～0.7mm双脱氧核糖核酸，使得各组分间的协同配合作用更加精准，提高了高保真热启动酶hifi的保真性能，进而提高了扩增文库的保真性，从而使得对突变基因检测结果的准确性，降低了假阳性率，为临床用药提供相对更准确的指导意义。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。如
背景技术：
所提到的，现有技术中与癌症相关的基因突变的检测试剂盒的检测结果存在多样性而缺乏临床指导意义，而目前尚无有效的解决办法。在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种肠癌临床用药突变基因检测试剂盒，该试剂盒包括：文库构建相关试剂，文库构建相关试剂包括2×hifi热启动酶缓冲液，2×hifi热启动酶缓冲液包括：850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真热启动酶和0.5～0.7mm双脱氧核糖核酸。本申请的上述肠癌临床用药突变基因检测试剂盒，通过对文库构建相关试剂中的热启动酶缓冲液进行改进优化，并控制该热启动酶缓冲液体系包含850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真热启动酶以及0.5～0.7mm双脱氧核糖核酸，使得各组分间的协同配合作用更加精准，提高了高保真热启动酶hifi的保真性能，进而提高了扩增文库的保真性，从而使得对突变基因检测结果的准确性，降低了假阳性率，为临床用药提供相对更准确的指导意义。为了进一步降低上述试剂盒检测的假阳性率，在本申请一种优选的实施例中，2×hifi热启动酶缓冲液包括：900mmtris-hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真热启动酶和0.6mm双脱氧核糖核酸。该优选实施例所制备的文库，检测得到的基因突变的假阳性率更低。在上述试剂盒成分的基础上，为了进一步提高试剂盒应用的便利性，在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括：肠癌临床用药突变基因捕获相关试剂，肠癌临床用药突变基因捕获试剂包括肠癌临床用药突变基因捕获探针。通过在上述试剂盒中同时包含肠癌临床用药突变基因捕获相关试剂，便于直接获得与肠癌临床用药相关突变基因的文库信息。上述优选实施例中，肠癌临床用药突变基因捕获探针根据实际操作中选择的与肠癌用药相关的基因的不同而不同。在本申请一种优选的实施例中，肠癌临床用药突变基因捕获探针包括表1所示的基因的突变位点的捕获探针：表1：。上述优选实施例中，表1所示的基因的突变位点能够涵盖目前已知的肠癌临床用药突变基因。具体地，在结直肠癌中，当kras基因出现第2号外显子区域的g12s、g12c、g12d、g12a、g12v突变中的一种和/或g13d突变时，患者将对egfr抑制剂药物应答低下。当nras基因出现第2号外显子区域的g12d突变和/或第3号外显子区域的q61r、q61k突变中的一种时，患者将对egfr抑制剂药物应答低下。当braf基因出现第15号外显子区域的v600e突变时，患者将对egfr抑制剂药物应答低下。当pik3ca基因出现第20号外显子区域的h1047r突变时，患者将对egfr抑制剂药物应答低下。针对上述表1中的基因的突变位点的探针可以采用现有的探针设计方法进行设计获得。在本申请一种优选的实施例中，表1所示的基因的突变位点的捕获探针在表2所示区域内通过叠瓦式设计获得：表2：本申请的上述探针，通过以待检测位点为中心，上下游各选取一定区域，在该区域内设计探针使得每条探针之间像瓦片一样错开。探针的总数可达210万条。针对同一检测位点的探针序列多样化且探针密度很大，确保每条待检测区域的dna模板都有对应探针与之结合，大大提高了覆盖度和捕获效率。根据待检测区域，进一步优化每种探针的浓度，可使得检测均一性更好。在本申请一种优选的实施例中，肠癌临床用药突变基因捕获探针为探针混合物，探针混合物的浓度为20～30ng/μl，优选为25ng/μl。在上述试剂盒成分的基础上，为了进一步提高试剂盒应用的便利性，在本申请一种优选的实施例中，肠癌临床用药突变基因捕获试剂还包括杂交通用引物和杂交index引物；优选地，杂交通用引物的浓度为225～275μm，更优选为250μm；优选地，杂交index引物的浓度为22.5～27.5μm，更优选为25μm；优选地，杂交index引物为24～96个，更优选为48个。同样地，上述试剂盒在含有上述成分的同时，还可以包括其他有助于进行捕获的试剂。在本申请一种优选的实施例中，肠癌临床用药突变基因捕获试剂还包括2×杂交缓冲液、杂交组分a以及cotdna(即胎盘dna)，2×杂交缓冲液为2m的四甲基氯化铵缓冲液，杂交组分a为100％的甲酰胺；优选地，肠癌临床用药突变基因捕获试剂还包括2×hifi热启动酶缓冲液和捕获样本富集引物；更优选，肠癌临床用药突变基因捕获试剂中的2×hifi热启动酶缓冲液与文库构建相关试剂中的所述2×hifi热启动酶缓冲液相同；更优选，捕获样本富集引物的浓度为3～6μm，进一步优选为5μm。为了进一步提高试剂盒的检测准确性及便利性，在本申请一种优选的实施例中，上述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。阴性对照品为11个位点均未野生型的dna，阳性对照品为含11种基因突变序列的dna。为了进一步提高试剂盒使用的便利性，在本申请一种优选的实施例中，上述文库构建相关试剂包括：末端修复加a反应体系、接头连接体系以及文库富集引物；优选地，末端修复加a反应体系包括末端修复加a反应缓冲液以及末端修复加a酶，更优选地，末端修复加a反应缓冲液包括400～600mmtris-hcl、80～120mmmgcl2、80～120mmdtt、8～10nmatp、3～5mmdatp、3～5mmdctp、3～5mmdgtp、3～5mmdttp；所述末端修复加a酶的浓度为0.04～0.06u/μl；优选地，接头连接体系包括双链寡核苷酸接头、dna连接酶以及dna连接酶缓冲液；更优选地，双链寡核苷酸接头为24～96个，进一步优选为48个；述dna连接酶的浓度为0.04～0.06u/μl；所述dna连接酶缓冲液包括800～900mm的tris-hcl、40～60mm的mgcl2、40～60mm的dtt及0.5～1.5mm的atp；优选地，文库富集引物的浓度为3～6μm，进一步优选为5μm。下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。需要说明的是，以下实施例以不含肠癌临床用药突变基因的阴性样本为实验对象，来详细说明本申请的试剂盒在降低假阳性率方面的有益效果。阴性样本为四个不同的dna混合物，这四个不同的dna混合物的来源不同，但均不含有肠癌用药相关基因的突变，分别命名为n1、n2、n3和n4。具体所使用的试剂盒的成分见下表3：表3：附：pre-pcr引物：指文库富集引物；post-pcr引物指捕获样本富集引物；cotdna：指胎盘dna；上述试剂盒中的引物及探针的具体序列见后续的表21。实验一：文库构建进行文库构建，具体步骤如下：.(1)末端修复及加a取dna样品和试剂依次加入配制混合液1(见表4，涡旋震荡混匀后，于pcr仪中20℃孵育30分钟，65℃孵育30分钟。表4：组分加入量dna样品1大于等于20ng末端修复&加a缓冲液7μl末端修复&加a酶3μl水补足至60μl1阴性对照品和阳性对照品浓度为5ng/μl，各加入4μl即可。(2)添加接头向末端修复&加a后的混合液1中依次加入试剂配制混合液2(见表5)，用移液器吹打混匀后，于pcr仪中20℃孵育15分钟。表5：组分加入量(μl)末端修复&加a后的混合液160dna连接酶缓冲液30dna连接酶10接头25水5合计1102接头的使用浓度根据如下表6格进行调整：表6：模板dna量/ng接头的浓度/μm1000155001525015100155015257.510351.52.50.7510.3(3)添加接头后纯化1)将添加接头后的110μl混合液转移至新的1.5ml离心管中，向其中加入88μl纯化磁珠，用移液器吹打混匀，室温静置5～15分钟，使dna和磁珠充分结合。2)将离心管置于磁力架上至溶液澄清后，用移液器吸去上清。3)向离心管中加入200μl80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。4)重复上一步，室温静置3～5分钟至乙醇完全挥发。注：避免磁珠过干。5)乙醇完全挥发后，从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入22μl水，用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。6)将离心管置于磁力架上至溶液上清澄清后，取1μl上清用于qubit定量。(4)文库富集1)分别按下表7要求依次加入试剂配制混合液3于两个不同的pcr管中，制备两个平行的文库以做对比。表7：组分加入量(μl)上清202×hifi热启动酶缓冲液a/b25pre-pcr引物5合计50附：2×hifi热启动酶缓冲液a代表上表3中的2×hifi热启动酶缓冲液体系；2×hifi热启动酶缓冲液b代表的2×hifi热启动酶缓冲液的成份为：1000mmtris-hcl、2mmmgcl2、0.04u/μl高保真热启动酶hifi以及0.4mm双脱氧核糖核酸。2)调整移液器至最佳量程上下吹打混匀液体并盖好pcr管盖，短暂离心。3)将配制好的混合液3置于pcr仪，按以下表8的反应程序扩增：表8：3具体循环数可根据如下表9进行调整：表9：pcr模板dna量/ng循环数0.512～13111～1259～11107～9505～61003～45001～2注：扩增后的产物于4℃或～20℃保存，但不超过72小时。4)扩增后纯化及片段大小分选①将50μl扩增产物转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀。室温静置15分钟。②将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。③向离心管中加入200μl80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。④重复上一步，室温静置3～5分钟至乙醇完全挥发。注：避免磁珠过干。⑤从磁力架上取下离心管，加50μl水，用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。⑥将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器移取50μl上清至新的离心管中。⑦向上述50μl上清中加入35μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟。⑧将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取上清约85μl于新的离心管中注：此步需小心留取上清，而非弃上清。⑨向上述85μl上清中，加入10μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟。⑩将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。向离心管中加入200μl80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。重复上一步，室温静置数秒至乙醇完全挥发。注：避免磁珠过干。乙醇完全挥发后，从磁力架上取下离心管，加52μl水，用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取1μl进行qubit定量检测，吸取50μl上清至新的离心管中。dna文库样品质量分析：对文库样品进行qubit定量，浓度应不小于2.5ng/μl；用2100生物分析仪分析文库大小，应在于150～500bp之间。注：纯化后的文库溶液应在-20℃条件下保存，于7天内完成后续处理。(5)文库杂交和捕获1)按下表10的要求依次加入试剂配制混合液4于新的1.5ml离心管中：表10：组分加入量dna文库混合样品1μg4杂交通用引物1000pmol杂交index引物1000pmol5cotdna5μl4根据文库样品浓度计算样本量，按下表11等质量加入文库样本。1个捕获样本至少加入8个文库，至多加入12个文库：表11：5应加入与接头相对应的杂交index引物，加入量根据以下表12调整：表12：组分加入量杂交index引物15μl(125pmol)杂交index引物25μl(125pmol)杂交index引物35μl(125pmol)杂交index引物45μl(125pmol)杂交index引物55μl(125pmol)杂交index引物65μl(125pmol)杂交index引物75μl(125pmol)杂交index引物85μl(125pmol)2)用移液器吹打混匀后，用真空离心浓缩仪在60℃、1350r/min下进行干燥，直至液体完全蒸干。3)待液体蒸干后，按下表13加入试剂配制混合液5：表13：组分加入量(μl)2×杂交缓冲液7.5杂交组分a3合计10.54)向干燥后的混合液4中，加入10.5μl混合液5配成杂交混合液，涡旋震荡混匀，短暂离心以去除管壁残留。于恒温金属浴仪95℃孵育10分钟使dna变性，短暂离心以去除管壁残留。5)用移液器将杂交混合液转移至新的pcr管中，加入4.5μl探针，涡旋震荡混匀，短暂离心以去除管壁残留。于pcr仪47℃孵育16～20小时，同时pcr仪加热盖温度设置为57℃以上。(6)文库清洗1)缓冲液的稀释方法见下表14：表14：组分超纯水加入量(μl)30μl～10×洗脱缓冲液i27020μl～10×洗脱缓冲液ii18020μl～10×洗脱缓冲液iii18040μl～10×洗脱缓冲液iv360200μl～2.5×磁珠洗脱缓冲液3002)取100μl1×洗脱缓冲液i和400μl1×洗脱缓冲液iv在47℃预热至少2小时。3)取100μl捕获磁珠于新的1.5ml离心管中，将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。4)从磁力架上取下离心管，加入200μl1×磁珠洗脱缓冲液，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。5)重复上一步。6)向离心管加入100μl1×磁珠洗脱缓冲液，涡旋震荡混匀。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。7)取杂交后的文库样品15μl，加入到磁珠离心管中，用移液器吹打混匀，于pcr仪47℃孵育45分钟。每间隔15分钟涡旋震荡3秒，使磁珠处于悬浮状态。8)孵育结束后，向离心管中加入100μl47℃预热的1×洗脱缓冲液i，涡旋震荡混匀。9)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。10)从磁力架上取下离心管，加入200μl47℃预热的1×洗脱缓冲液iv，用移液器吹打混匀。于恒温金属浴仪47℃孵育5分钟。11)重复一次9)～10)的步骤。12)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。13)从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入200μl未加热的1×洗脱缓冲液i，涡旋震荡2分钟。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。14)从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入200μl1×洗脱缓冲液ii，涡旋震荡1分钟。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。15)从磁力架上取下离心管，每个离心管中分别依次加入200μl1×洗脱缓冲液iii，涡旋震荡30秒。将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。16)从磁力架上取下离心管，加入40μl水，用移液器吹打混匀。将混匀后的液体标记为“1”。(7)捕获样本富集及纯化1)按下表15配制混合液6表15：组分加入量(μl)2×hifi热启动酶缓冲液a/b50post-pcr引物10合计602×hifi热启动酶缓冲液a/b同表7。2)将混合液6与“1”混合，涡旋震荡混匀。按50μl/管分装量分装到两个新的pcr管中，按以下表16的反应程序扩增：表16：注：扩增后的产物可于2～8℃保存，但不超过72小时。3)将100μl扩增产物转移至新的1.5ml离心管中，加入180μl纯化磁珠，涡旋震荡混匀。室温静置15分钟。4)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。5)向离心管中加入200μl80％乙醇，室温静置30秒，用移液器吸去上清。6)重复上一步，室温静置3～5分钟至乙醇完全挥发。注：避免磁珠过干。7)乙醇完全挥发后，从磁力架上取下离心管，分别加入52μl水。用移液器吹打混匀，室温静置2分钟。8)将离心管置于磁力架上使磁珠进行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器转移50μl上清于新的离心管中。此时捕获的文库样品处于上清中。注：纯化后的文库溶液应在～20℃以下保存7天。(8)上机测序使用illumina公司生产的nextseq500测序仪及相关配套试剂进行上机测序。经生物信息学分析得到以下结果。阴性对照品和阳性对照品在采用本申请的2×hifi热启动酶缓冲液a和作为比较例的2×hifi热启动酶缓冲液b进行文库富集及捕获样本富集，所得到的检测结果见下表17和表18。表17：表18：从表17和表18可以看出，无论采用本申请的试剂盒中还是采用作为比较例的试剂盒，其中阴性对照品和阳性对照品的检测结果都全部合格，都表明整个实验体系没有污染，没有错误。此次试验的结果可信。进一步检测阴性样本在采用本申请的2×hifi热启动酶缓冲液a和作为比较例的2×hifi热启动酶缓冲液b进行文库富集及捕获样本富集后结果，所得到的检测结果分别见表19和20。表19：已知上述4种阴性参考品的11个位点均未发生突变。将ngs检测结果大于等于千分之三的突变判定为阳性，根据检测结果可以计算出假阳性率(假阳性数/金标准真阴性数*100％＝9/132)为6.82％。表20：将ngs检测结果大于等于千分之三的突变判定为阳性，根据检测结果可以计算出假阳性率假阳性率(假阳性数/金标准真阴性数*100％＝29/132)为22％。比较表19和表20的数据可见，本申请的对热启动酶的缓冲液成份比例进行调整后的试剂盒，可降低假阳性检出率约15％左右。为了进一步证明本申请的试剂盒的成分中可能的优选范围，发明人还进一步采用如下表21和表22中的试剂盒成分对上述四个阴性对照品进行了同样的文库构建及检测，检测结果与表21类似，此处不再提供相应数据。表21：表22：本申请的上述试剂盒中的引物及探针的具体序列均见下表23。表23：从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请的上述肠癌临床用药突变基因检测试剂盒，通过对文库构建相关试剂中的热启动酶缓冲液进行改进优化，并控制该热启动酶缓冲液体系包含850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/ul高保真热启动酶以及0.5～0.7mm双脱氧核糖核酸，使得各组分间的协同配合作用更加精准，提高了高保真热启动酶hifi的保真性能，进而提高了扩增文库的保真性，从而使得对突变基因检测结果的准确性，降低了假阳性检出率，为临床用药提供相对更准确的指导意义。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>臻悦生物科技江苏有限公司<120>肠癌临床用药突变基因检测试剂盒<130>pn73756zhkej<160>102<170>patentinversion3.5<210>1<211>58<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头1-48第一链<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>2<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头1-48第一链<400>2gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacgtgatatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>3<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头2第二链<400>3gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaaacatcgatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>4<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头3第二链<400>4gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatgcctaaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>5<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头4第二链<400>5gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacagtggtcaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>6<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头5第二链<400>6gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaccactgtatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>7<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头6第二链<400>7gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacattggcatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>8<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头7第二链<400>8gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccagatctgatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>9<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头8第二链<400>9gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccatcaagtatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>10<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头9第二链<400>10gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcaccgctgatcatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>11<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头10第二链<400>11gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacacaagctaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>12<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头11第二链<400>12gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacctgtagccatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>13<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头12第二链<400>13gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacagtacaagatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>14<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头13第二链<400>14gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacaaccaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>15<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头14第二链<400>15gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaaccgagaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>16<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接头15第二链<400>16gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacgcttaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>17<211>65<212>dna<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