一种与肝癌相关的基因及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种与肝癌相关的基因及其应用，具体的涉及与肝癌相关的ensg00000260285基因及其应用。

背景技术：

原发性肝细胞癌(hcc)是消化系统的一种人类肿瘤，hcc患者的5年生存率较低，且是全球癌症相关的第二大死因。肝细胞癌具很高的发病率和致命性。它是全球主要的健康挑战，缺少早期的诊断工具是其有效治疗hcc的临床障碍之一。

目前尽管有在手术技术及医疗治疗发面新的进展，先前研究鉴定了hcc中许多异常表达的蛋白编码基因，新的分子标志物能在早期诊断中起作用，但是仍急切需要进行风险评估。理解hcc临床症状和分子改变间的关系对发现hcc新的诊断及治疗策略及提高诊断患者的预后非常重要。

近年来，基因组范围的研究揭示了，整个人类基因组70％-90％能够被转录为rna，但仅有不到2％最终翻译成蛋白，其余均不能编码蛋白质，称为非编码rna(noncodingrna，ncrna)。ncrna种类繁多，根据其功能的不同可分为调控性非编码rna(regulatorynoncodingrna)和管家非编码rna(housekeepingnoncodingrna)；根据其大小又可将调控性非编码rna分为长非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)和短链非编码rna(mirna,rrna，trna，snorna等)。长链非编码rna被认为是长度大于200nt的转录产物，以rna的形式起作用。越来越多的研究发现长非编码rna和mirna、蛋白构成复杂的调控网络，可以在表观遗传水平、转录及转录后水平参与基因表达调控。

异常lncrnas表达能引起各种人类疾病及紊乱。越来越多报道失调的lncrna表达在各种癌症类型中，暗示lncrnas可能作为潜在的癌或抑癌rnas。至今，lncrna研究仍然处于起步阶段，仍有很大一部分lncrnas有待被发现探究。lncrna在hcc中的作用很多仍然未知，缺乏系统的研究，揭示lncrna在肝细胞肝癌中的功能及作用机制具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种诊断肝癌的产品和方法，通过检测生物标志物的表达水平来判断患者是否患有肝癌或者患肝癌的风险。

本发明的目的之二，提供一种治疗肝癌的药物组合物和手段，通过改变生物标志物的功能性表达，从而实现治疗肝癌的目的。

本发明的目的之三，提供一种筛选治疗肝癌潜在药物的方法，通过药物能否调节生物标志物的表达水平来判断候选物是否是潜在的治疗肝癌的药物。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测ensg00000260285的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用，其中，ensg00000260285在肝癌患者中表达水平上调。

进一步，所述试剂选自包括：通过rt-pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测样本中ensg00000260285基因表达水平用试剂。

本发明提供了一种诊断肝癌的产品，所述产品包括检测样本中ensg00000260285表达水平的试剂。本发明所述产品只要能够检测ensg00000260285的表达水平即可，而不局限于常见的检测产品如芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒等。所述“样本”包括细胞、组织、脏器、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的，所述样本为组织、血液。

进一步，所述试剂包括特异性识别ensg00000260285的探针，或特异性扩增ensg00000260285的引物。

在本发明的具体实施方式中，所述特异性扩增ensg00000260285的引物序列如seqidno.2～3所示。

本发明提供了ensg00000260285基因在筛选预防或治疗肝癌潜在物质中的应用。

本发明提供了一种筛选预防或治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达或含有ensg00000260285基因的体系；和

检测所述体系中ensg00000260285基因的表达；

其中，若所述候选物质可降低ensg00000260285基因的表达水平(优选显著降低，如低20％以上，较佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，则表明该候选物质是预防或治疗肝癌的潜在物质。所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对ensg00000260285基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明提供了ensg00000260285在制备治疗肝癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括ensg00000260285功能性表达的抑制剂，所述抑制剂选自：以ensg00000260285或其转录本为靶序列、且能够抑制ensg00000260285基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)、dsrna、微小rna、反义核酸，或能表达或形成所述shrna、小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。优选的，所述的抑制剂为sirna。

在本发明的具体实施例中，所述sirna的序列为seqidno.6～7。

进一步，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括：

ensg00000260285功能性表达的抑制剂；和

药学上可接受的载体。

药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。

附图说明

图1是利用qpcr检测ensg00000260285在肝癌患者中的表达情况图；

图2是利用tcga数据库交叉验证ensg00000260285在肝癌患者中的差异表达图；

图3是ensg00000260285在肝癌患者中的roc曲线图；

图4是利用qpcr检测ensg00000260285在肝癌细胞中的表达情况图；

图5是检测转染sirna对肝癌细胞中ensg00000260285的表达影响图；

图6是利用cck8检测ensg00000260285对细胞增殖的影响图；

图7是检测ensg00000260285对细胞的克隆形成集落的影响图；

图8是检测ensg00000260285对肝癌细胞凋亡的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的lncrna芯片，检测肝癌组织和癌旁组织中lncrna的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncrna片段，探讨其与肝癌的发生之间的关系，从而为肝癌的早期检测及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了肝癌中ensg00000260285显著性上调。实验证明，sirna干扰沉默ensg00000260285，能够有效地抑制肝癌细胞的增殖，为肝癌的个性化治疗提供了新途径。

ensg00000260285基因

ensg00000260285基因位于14号染色体上，一种代表性的人ensg00000260285基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明中的ensg00000260285包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncrna使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(例如，rt-pcr)，而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)。

通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、核酸膜条、试剂盒

在本发明中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ensg00000260285所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括pcr引物以及基因特异性dna寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是dna，也可以是rna，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过pna(polyamidenucleicacid，肽核酸)、lna(注册商标，lockednucleicacid，bridgednucleicacid，交联化核酸)、ena(注册商标，2′-o,4′-c-ethylene-bridgednucleicacids)、gna(glycerolnucleicacid，甘油核酸)、tna(threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测ensg00000260285的表达水平。在本发明的具体实施例中用于检测ensg00000260285的表达水平的试剂包括特异性扩增ensg00000260285的引物，所述引物序列序列如seqidno.2～3所示。所述的试剂盒中还含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取rna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括ensg00000260285基因在内的多个基因(例如，与肝癌相关的多个基因)的表达水平，将肝癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肝癌诊断的准确率。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种ensg00000260285功能性表达的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制ensg00000260285基因的功能性表达即可，这些抑制剂作为对于下调ensg00000260285有用的物质，可用于预防或治疗肝癌。

作为本发明的一种优选方式，所述ensg00000260285的抑制剂是一种ensg00000260285特异性的小干扰rna分子。如本文所用，所述的“小干扰rna”是指一种短片段双链rna分子，能够以同源互补序列的mrna为靶目标降解特定的mrna，这个过程就是rna干扰(rnainterference)过程。小干扰rna可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链rna复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链rna复合物。

在筛选有效的sirna序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种sirna序列，并将它们分别通过转染试剂转染肝癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的sirna，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该sirna在能有效的抑制细胞中ensg00000260285基因的表达水平，以及肝癌细胞的增殖。在本发明的具体实施例中，优选的sirna的序列如seqidno.6～7所示。

本发明的核酸抑制物如sirna可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链rna之后进行制备。sirna等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效量的所述的ensg00000260285的抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于抑制肝癌。任何前述的ensg00000260285的抑制剂均可用于药物组合物的制备。

在本发明中，药学上可接受的载体包括(但不限于)缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞(宿主细胞)转染试剂。

本发明可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的抑制剂或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将ensg00000260285的抑制剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带ensg00000260285的抑制剂的表达单位(比如表达载体或病毒等，或sirna或shrna)递送到靶点上，并使之表达活性的ensg00000260285抑制剂，具体情况需视所述的抑制剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种抑制ensg00000260285基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的化疗剂，包括但不限于：微管激活剂、烷化剂、抗赘生抗代谢物、铂类化合物、dna-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，hmg-coa抑制剂，cdk抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋dna，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。

可药用载体可包括但不限于：病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。相关的递送载剂可包括但不限于：脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肝癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用spss18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当p<0.05时具有统计学意义。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肝癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集10例肝癌患者的癌组织以及癌旁组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna样品的制备

利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行组织rna的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、逆转录和标记

用lowrnainputlinearamplificationkit将mrna逆转录成cdna，同时用cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-humanlncrnaarray，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据处理

杂交后芯片用agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％pmt各扫描1次，2次结果agilent软件自动合并。扫描图像数据采用featureextraction进行处理分析，得到的原始数据应用bioconductor程序包进行后续数据处理。差异基因筛选标准：fdr<0.01，abs(log2fc)>1.5。

6、结果

与癌旁组织相比，ensg00000260285在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。

实施例2qpcr测序验证ensg00000260285基因的差异表达

1、对ensg00000260285基因差异表达进行大样本qpcr验证。按照实施例1中的样本收集方式收集肝癌组织和癌旁组织样本各60例。

2、rna提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmdntp，0.1mmdtt，30μmoligodt，200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)qpcr扩增检验

引物设计：

ensg00000260285基因的引物序列为：

正向引物：5’-ttctgcctggacaacatag-3’(seqidno.2)

反向引物：5’-aatcagccattggttctct-3’(seqidno.3)

管家基因gapdh的引物序列为：

正向引物：5’-ccgggaaactgtggcgtgatgg-3’(seqidno.4)

反向引物：5’-aggtggaggagtgggtgtcgctgtt-3’(seqidno.5)

配制25μl反应体系：sybrgreen聚合酶链式反应体系12.5μl，正反向引物(5μm)各1μl，模板cdna2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95℃60s，(95℃15s，60℃15s，72℃45s)×35个循环。

以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，δδct法进行相对定量。

3、结果

结果如图1所示，与癌旁组织相比，ensg00000260285基因在肝癌组织中表达水平上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同rna-sep结果一致。

实施例3分析ensg00000260285在tcga数据库中的表达情况

1、数据收集

从tcga数据库中收集200例肝癌组织和50例癌旁组织的lncrna表达谱数据，分析ensg00000260285在肝癌组织和癌旁组织中的表达水平；绘制箱形图。

2、roc曲线分析

使用r语言中的proc包分析ensg00000260285的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制roc曲线。

3、结果

ensg00000260285的表达水平如图2所示，相比对照组，ensg00000260285在肝癌组织中表达显著上调。

ensg00000260285的roc曲线如图3所示，ensg00000260285的auc值高达0.938，且具有较高的特异性和敏感性，说明ensg00000260285应用于肝癌的诊断具有较高的准确性。

实施例4ensg00000260285基因在肝癌细胞系中的差异表达

1、细胞培养

人肝癌细胞株hepg2、huh7和正常肝细胞系hl-7702，，以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、rna的提取

1)胰酶消化贴壁细胞，吹打获得的细胞经离心、重悬、清洗后，以含10％fbs的dmem培养基重悬；

2)将重悬的细胞转移至6孔板，添加培养基至2m1/孔，轻摇6孔板使细胞均匀重悬；

3)细胞贴壁生长48h，去培养基；

4)以1mltrizol试剂裂解细胞，反复吹打6孔板壁，尽量使细胞完全裂解；

5)转移细胞裂解液至1.5mldepc处理过的ep管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步骤同血液中rna提取过程。

3、逆转录

具体步骤同实施例2.

4、结果

结果如图4所示，与正常肝细胞系相比，ensg00000260285基因在肝癌细胞hepg2、huh7中表达均上调，差异具有统计学意义(p<0.05)，同rna-sep结果一致。

实施例5ensg00000260285基因的沉默

1、细胞培养

人肝癌细胞株hepg2，以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含edta的胰蛋白酶常规消化传代。

2、sirna设计

针对ensg00000260285基因的sirna序列：

阴性对照sirna序列(sirna-nc)：

正义链：5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.6)，

反义链：5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.7)；

sirna1：

正义链：5’-aagagaaacccaagagaagug-3’(seqidno.8)，

反义链：5’-cuucucuuggguuucucuucc-3’(seqidno.9)；

sirna2：

正义链：5’-uaacaucucugaguuucaguu-3’(seqidno.10)，

反义链：5’-cugaaacucagagauguuaaa-3’(seqidno.11)；

sirna3：

正义链为5’-uuuauccacagaacaugaccc-3’(seqidno.12)，

反义链为5’-gucauguucuguggauaaaag-3’(seqidno.13)；

sirna4：

正义链为5’-auccuaaucccacuuugaccu-3’(seqidno.14)，

反义链为5’-gucaaagugggauuaggauuu-3’(seqidno.15)

将细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱中细胞培养24h；

在无双抗、含10％fbs的dmem培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(hepg2)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(20nm)(sirna1、sirna2、sirna3)，其中阴性对照组sirna与ensg00000260285基因的序列无同源性，浓度为20nm/孔，同时分别进行转染。

3、qpcr检测ensg00000260285基因的表达水平

3.1细胞总rna的提取

具体步骤同实施例4。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3qpcr扩增步骤同实施例2。

4、结果

结果如图5显示，与对照组相比，转染sirna的实验组可以降低ensg00000260285的表达水平，其中sirna1的干扰效果最好。

实施例6cck8检测细胞增殖实验

1、细胞培养与转染步骤同实施例4

2、cck8检测细胞增殖

1)将对数增殖期的hepg2细胞接种于96孔板，每孔2×10³个细胞；

2)实验分三组，分别是空白对照组、转染sirna-nc组和转染sirna1，每组设6个复孔；

3)分别在转染0h、24h、48h、72h后加入10μl/孔cck8试剂；

4)2h后使用酶标仪检测a450的吸光值。

3、结果

图6所示的结果显示：空白对照组同空载组无明显差异，而转染sirna1组的细胞生长速度明显低对照组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(p<0.05)，上述结果表明ensg00000260285的表达能够促进肝癌细胞的生长。

实施例7软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的dmem完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×dmem培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于co2温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×dmem培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％co2温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图7所示，与对照组相比，转染sirna2-ensg00000260285的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

实施例8ensg00000260285基因对肝癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测ensg00000260285基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例4。

2、细胞转染步骤同实施例5。

3、步骤

1)将3m110×上样缓冲液用27ml蒸馏水稀释。

2)收集细胞样本并用预冷的pbs清洗。

3)将细胞加入lml1×上样缓冲液，300g离心10min，吸出缓冲液。

4)再次加入lml1×上样缓冲液，将细胞悬液中细胞浓度调整为1×10⁶个/ml。

5)将细胞悬液取出100μl，加入ep管中。

6)将5μl的annexinvfitc加入ep管中，混匀ep管中的液体，在室温下避光孵育10min。

7)向ep管中加入5μlpi染液，在室温下避光5min。

8)在ep管中加入500μl的pbs溶液，轻轻混匀，1h内上流式细胞仪进行检测。

4、结果：

结果如图8所示，实验组与对照组相比，细胞凋亡率升高(p<0.05)，该结果说明，ensg00000260285的表达抑制肝癌细胞的凋亡。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技术有限公司

<120>一种与肝癌相关的基因及其应用

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<170>patentinversion3.5

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