一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记及其应用。

背景技术：

大肠埃希菌又称大肠杆菌，属于肠杆菌类，是革兰氏阴性短杆菌，在自然界分布广泛，多寄生于人或动物的肠道里，一般为正常菌群。奶酪、肉和牛奶都可能通过圈养动物和收获的食品而被大肠埃希菌污染。虽然大部分的大肠埃希菌对人体健康无害，但在一定条件下会引起肠道外感染；而且某些大肠埃希菌菌株致病性强，其产生的毒素可使人致病或致死，进而造成严重损失。

随着抗菌药物的广泛的应用，大肠埃希菌的耐药率呈逐年上升趋势，并出现对多种抗菌药物耐药，而由该菌引起的感染已成为临床较为棘手的问题。eco的耐药机制很多，如细菌产生灭活酶或钝化酶对抗菌药物的灭活与修饰；抗菌药物作用靶位的改变；膜对抗菌药物的通透性下降，药物摄入减少；膜对抗菌药物的主动外排，药物排出增加；细菌形成生物被膜；其中以产酶最为重要，研究的也最多。

技术实现要素：

本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够快速、准确检测大肠埃希菌的方法，本发明提供了一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记及其应用。

技术方案：一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

表1分子标记序列

所述分子标记在制备检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

优选的，所述试剂盒检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的大肠埃希菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释150～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

有益效果：(1)本发明所述分子标记能够快速、准确的检测出大肠埃希菌氧氟沙星的耐药基因；(2)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高、稳定性强的优点。

附图说明

图1是实施例1～3检测结果图；

其中，m为分子量为1000bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。

具体实施方式

实施例1

一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

所述分子标记在制备检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

所述试剂盒检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的大肠埃希菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释150倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

实施例2

一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

所述分子标记在制备检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

所述试剂盒检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的大肠埃希菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入35μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释30倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

实施例3

一种用于检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

所述分子标记在制备检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

所述试剂盒检测大肠埃希菌氧氟沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的大肠埃希菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

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<110>苏州乔纳森新材料科技有限公司

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