一种与乳腺癌相关的诊断标志物及其用途的制作方法

本发明属于生物技术和肿瘤学领域，涉及与乳腺癌相关的microrna及其应用。。

背景技术：

乳腺癌是女性中最常见的肿瘤，也是致死率第二高的恶性肿瘤。根据中国肿瘤登记中心发布，我国恶性肿瘤发病率前三位是肺癌、乳腺癌、胃癌。中国是乳腺癌发病率增长速度最快的国家之一，近年来乳腺癌发病率正以每年3％的速度递增，已成为女性的第一杀手。

微小核酸(micrornas)是真核生物中广泛存在的一类长度约18～23个核苷酸的rna分子，通过与靶基因mrna结合或促使mrna的降解或阻碍转录后翻译，从而达到抑制转录的目的。作为基因表达的关键调控因子，mirna在细胞生长、胚胎发育、组织分化、以及疾病的发生发展等多项生命活动中起着极为重要的作用。mirna与癌症的发生发展密切相关，大约50％得到注解的mirna在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点。研究发现mirna在多种癌症组织中表达失调，通过调控促癌或者抑癌信号通路的活性，起着肿瘤抑制因子或是原癌基因的功能。多种mirna在乳腺癌中表达异常，并且与乳腺癌雌激素受体er、pr以及人表皮生长因子受体her2的表达相关。例如mir-342在luminalb型er阳性和her2阳性乳腺癌中表达量最高而在三阴性乳腺癌中表达最低。而mir-21、mir-210、mir-221在三阴性(er阴性、pr阴性、her2阴性)乳腺癌中高表达，并且和预后复发率高和低生存率显著相关，mir-10b、mir-145、mir-205、mir-205和mir-122则在这类乳腺癌中显著低表达。这些差异表达的mirna不仅可以应用到乳腺癌分类，还能作为预后因子或者乳腺癌治疗的新切入点。mirna的表达还与乳腺癌的早期诊断有密切的关系。研究发现let-7a的表达和乳腺癌luminal分型密切相关，mir-195能特异性区分乳腺癌和其他癌症类别及其正常对照，mir-195、let7a和mir-155联合监测可使乳腺癌检测效率达到94％。这些研究结果表明乳腺癌特异性mirna的表达与乳腺癌分子亚型、乳腺癌的诊断和预后评价具有密切关系。

技术实现要素：

本申请发明人通过分析癌症基因信息数据库(thecancergenomeatlas,tcga)中乳腺癌基因表达的数据资料，通过分析比较了mir-20a在694例乳腺癌组织和83例正常乳腺组织中的表达差异，结果显示mir-20a在乳腺癌组织中的表达显著高与正常乳腺组织；发明人又对82例三阴性(基底样型)乳腺癌和391例其它类型乳腺癌(包括luminala型,luminalb型和her2阳性)组织中mir-20a的表达进行了分析，发现三阴性乳腺癌组织中mir-20a的表达水平显著高于其它类型乳腺癌组织(图1)。

通过对30对乳腺癌病人肿瘤组织和癌旁组织中mir-20a原位杂交实验，结果显示乳腺癌组织中mir-20a的表达水平明显高于癌旁组织(图2)。

通过分析347例乳腺癌样本中mir-20a的表达水平和基因组不稳定的关系，发现mir-20a表达水平高的乳腺癌组织中基因组拷贝数变异和基因突变率都显著高于mir-20a表达水平低的乳腺癌组织(图3)。

用三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231构建人乳腺癌荷瘤小鼠模型发现mir-20a显著促进肿瘤的起始(图4)。

综上所述，本发明一个方面提供了一种诊断标志物在制备用于诊断肿瘤的试剂盒中的用途，所述诊断标志物为microrna-20a。

本发明另一个方面提供了一种诊断标志物在制备用于判断肿瘤愈后的试剂盒中的用途，所述诊断标志物为microrna-20a。

在本发明的技术方案中，所述肿瘤为乳腺癌。

在本发明的技术方案中，所述的乳腺癌为三阴性乳腺癌。

本发明再一个方面提供了一种诊断标志物在制备用于判断肿瘤类别的试剂盒中的用途，所述诊断标志物为microrna-20a。

在本发明的技术方案中，所述判断肿瘤类别为判断乳腺癌的类别。

在本发明的技术方案中，所述判断乳腺癌的类别为区别三阴性乳腺癌和其他种类乳腺癌，优选地，所述其他种类乳腺癌为luminala型、luminalb型和her2阳性。

本发明再一个方面提供了一种诊断乳腺癌、判断肿瘤愈后或判断乳腺癌类别的试剂盒，所述试剂盒中包含microrna-20a。

本发明再一个方面提供了microrna-20a的拮抗剂在制备治疗乳腺癌的药物中的用途，优选地，所述乳腺癌为三阴型乳腺癌。

在本发明的技术方案中，所述microrna-20a的核苷酸序列为seqidno.1，

mir-20a：5′-uaaagugcuuauagugcagguag-3seqidno.1。

有益效果

发明提供了一种新型的乳腺癌诊断分子标志物，其诊断效率高，能够实现乳腺癌的分型检测。

附图说明

图1.(a)分析tcga乳腺癌mirna表达数据库，其中包括694例肿瘤组织和83例正常组织，肿瘤组织中mir-20a的表达水平显著高于正常组织；(b)分析tcga乳腺癌mirna表达数据库，其中包括82例三阴性乳腺癌和391例其它类型乳腺癌，mir-20a在三阴性乳腺癌中的表达高于其它类型乳腺癌。

图2.(a)在30对乳腺癌和癌旁组织中通过原位杂交实验检测mir-20a,乳腺癌组织中mir-20a的表达水平显著高于癌旁组织；(b)乳腺癌组织和癌旁组织中mir-20a原位杂交和he染色示意图。

图3.分析tcga乳腺癌数据库，347例乳腺癌样本按照mir-20表达水平分为高表达和低表达两组，分别对比两组中(a)基因组拷贝数变异和(b)突变率的差异。

图4.(a)在三阴性人乳腺癌细胞系mda-mb-231细胞中稳定表达阴性对照mirna(negativecontrol,nc)和mir-20a，将细胞注射到裸鼠皮下构建裸鼠移植瘤模型。细胞注射8天后计算小鼠成瘤率，mir-20a促进肿瘤的起始；(b)肿瘤生长曲线显示mir-20a促进肿瘤的生长。

具体实施方式

实施例1.乳腺癌组织中mir-20a表达量分析

从癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas,tcga)官网下载乳腺癌的mir-seq数据进行分析。分析694例肿瘤组织与83例正常乳腺中mir-20a的表达量。分析82例三阴性乳腺癌和391例其它类型乳腺癌中mir-20a的表达量。

实验结果显示(图1)mir-20a在乳腺癌组织，特别是三阴性乳腺癌组织中表达量显著升高。

实施例2.乳腺癌组织原位杂交实验

将30例乳腺癌与正常乳腺临床组织切片与10pmol的mir-20a互补探针(lna修饰并用dig标记)杂交，与交联了碱性磷酸酶的抗dig-apfab片段共同孵育后，用氮蓝四唑检测。

实验结果显示(图2)乳腺癌中mir-20a的表达显著高于正常组织。

实施例3.乳腺癌中mir-20a表达量与基因组稳定性分析

从癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas,tcga)官网下载乳腺癌数据进行分析。将347例乳腺癌样本按照mir-20表达水平分为高表达和低表达两组，分别对比两组中基因组拷贝数变异和突变率的差异。

实验结果显示(图3)mir-20a高表达的乳腺癌患者，其基因组拷贝数的变化以及突变率都更高，即基因组更加不稳定。

实施例4.小鼠移植瘤实验

通过慢病毒转染法构建nc与mir-20a过表达的mda-mb-231细胞系并扩大培养，同时将购买的4周龄雌性balb/c裸鼠继续饲养10天；消化两种细胞、计数，pbs重悬细胞使细胞浓度为5×10⁷/ml，细胞悬液与4℃融化的基质胶按照1:1混合，放置于冰上；将小鼠随机分为两组，每组12只，两组分别注射200μl的nc与mir-20a细胞悬液于腹部皮下；对两组小鼠分别编号，每天观察，待肿瘤长出后，每天测量肿瘤的大小与小鼠的体重；3周后处死小鼠，对肿瘤的发生率与肿瘤体积进行统计作图。

实验结果显示(图4)，注射mir-20a过表达乳腺癌细胞的小鼠，肿瘤发生率更高，肿瘤的生长速率更快，说明mir-20a可促进肿瘤的发生与发展。

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<110>清华大学深圳研究生院

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