一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法与流程

本发明涉及线粒体基因型检测领域，具体涉及一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法。

背景技术：

蛹虫草(cordycepsmilitaris)又叫北虫草或北冬虫夏草，是隶属子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、虫草科、虫草属的一种丝状真菌。现代研究证实，蛹虫草有抗肿瘤、抑制流感病毒、对辐射损伤的保护及抗炎等多种药理作用，目前已经在东亚地区被广泛作为滋补品及药用菌使用，并被用作冬虫夏草的替代品进行开发利用。2009年蛹虫草已被卫生部列为新资源食品(现名新食品原料)，因此蛹虫草可作为普通食品流通。目前，蛹虫草子实体已经实现了产业化生产，以蛹虫草为主要成分的保健食品已有近50种，药品有两种。蛹虫草在我国已经形成了一个巨大的产业，据估计年产值达100亿元人民币。尽管如此，市场上有些保健食品和药品只标称虫草，而未明确说明是哪种虫草；有的虽标称冬虫夏草，但实际可能为蛹虫草。

由于具有重要的经济价值，近年来人们陆续开展了蛹虫草多种组学水平的研究工作。目前，蛹虫草的核基因组和线粒体基因组均已公布，人们还开展了转录组、甲基化组和蛋白质组的研究。我们通过分析和比较不同蛹虫草菌株的线粒体基因组，发现不同的蛹虫草菌株表现出线粒体内含子的插入缺失多样性，从而具有不同的线粒体基因型(scientificreports2017,7:40219)。同时，由于为异宗配合真菌，蛹虫草是研究真菌线粒体遗传机制的理想材料。然而，开展线粒体遗传机制的研究需要同时对大量蛹虫草菌株的线粒体基因型进行分析，常规的通过测序来确定线粒体基因型的方法由于成本较高、时间较长，无法满足该类研究的需要，亟需建立一种简单易行的快速检测线粒体基因型的技术体系。

根据目前已知的研究结果，蛹虫草在其线粒体基因组中至多有8个内含子插入位点(scientificreports2017,7:40219)。本发明以这8个潜在内含子位点为靶标，建立基于pcr扩增和电泳分析的快速检测蛹虫草线粒体基因型的技术体系。该技术体系既可辅助用于蛹虫草遗传稳定性和遗传机制的研究，还可用于蛹虫草的真伪鉴别和工业生产蛹虫草菌株间的快速“亲子鉴定”。

技术实现要素：

本发明的目的是建立一种蛹虫草线粒体基因型的快速检测方法。

为达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)利用已知线粒体基因型的蛹虫草菌株，设计扩增8个线粒体内含子位点的引物，通过pcr扩增分别得到在这些内含子插入位点有对应内含子的i类扩增产物和在这些潜在内含子位点缺失内含子的ii类扩增产物；

(2)纯化各扩增产物并测定浓度后，将属于同类的扩增产物按相同质量混合在一起，分别进行琼脂糖凝胶电泳，制作成dna分子量标准i和dna分子量标准ii；所述制作dna分子量标准i的电泳条件：0.7％的琼脂糖凝胶，电压90v，时间120min；所述制作dna分子量标准ii的电泳条件：2.0％的琼脂糖凝胶，电压100v，时间60min；

(3)取待检测的蛹虫草菌株，利用与步骤(1)相同的引物进行pcr扩增，扩增产物分别按步骤(2)中dna分子量标准i和dna分子量标准ii的琼脂糖凝胶电泳条件进行电泳，通过与dna分子量标准i和dna分子量标准ii的比较，获知待检测的蛹虫草菌株的线粒体基因型。

所述的pcr扩增使用的引物分别为：cm-rnl-i1f1/cm-rnl-i1r1、cm-rnl-i2f1/cm-rnl-i2r1、cm-rnl-i3f1/cm-rnl-i3r1、cm-rnl-i4f1b/cm-rnl-i4r1b、cm-cob-f1/cm-cob-r1、cm-cox1-f1/cm-cox1-r1、cm-cox2-f1/cm-cox2-r1、cm-cox3-f1/cm-cox3-r1。

所述的已知线粒体基因型的蛹虫草菌株至少为v40-5和cm09-31-28或cm06。

所述的pcr扩增使用的dna聚合酶为easytaqpcrsupermix、kodplusneo或kodfxneo。

上述技术方案中：

所有目前已知线粒体基因型的蛹虫草菌株见表1。

表1已经线粒体基因型的蛹虫草菌株

注：√代表某菌株在对应位点有内含子，×代表在对应位点缺失内含子。该表信息来源于scientificreports2017,7:40219。

由上表可知，在已知线粒体基因型的蛹虫草菌株中，最多含有8个内含子插入位点，其中，在基因cox1、cox2、cox3、cob中各含有1个内含子插入位点，在基因rnl中含有4个内含子插入位点。在这8个内含子位点中，rnl-i2和rnl-i4没有缺失现象，而其它6个内含子都可能发生缺失。

所述的用于制作dna分子量标准的各pcr扩增产物的浓度在40-60ng/μl之间，分别取2-3μl进行混合。

本发明方法通过分子量标准i和分子量标准ii的双重验证，即可了解一个蛹虫草菌株在8个潜在内含子插入位点上的内含子存在情况，从而准确地确定其线粒体基因型。

与现有技术相比，本发明具有下列优点：

(1)相比传统的通过测序才能确定基因型的方法，本发明所述检测方法不需要进行测序，可以极大地节约成本。

(2)依据本发明所述检测方法，通过与制备好的dna分子量标准进行比较就可以确定待检测蛹虫草菌株的线粒体基因型，因此，本发明操作简便，可极大节约检测时间。

(3)由于蛹虫草线粒体内含子长度比较大(893-1828bp)，某位点有或无内含子所得到的扩增产物，其大小区别是非常明显的，因此，使用本发明制成的分子量标准，通常不会出现模棱两可或者判断出错的情况。

(4)本发明所涉及的pcr扩增和核酸电泳技术现在绝大多数学校或科研机构普遍都能完成。本发明适用于各种pcr仪，对仪器设备无特殊要求。所述其它试剂都很容易购买。

(5)由于具有上述优点，本发明适于同时对大量蛹虫草菌株进行线粒体基因型的检测。

附图说明

图1.蛹虫草线粒体基因组中存在内含子的8个位点pcr扩增片段的电泳结果，其中m为trans2kplusdnaladder。

图2.蛹虫草线粒体基因组中缺失内含子的6个位点pcr扩增片段的电泳结果，其中m为trans2kplusdnaladder。

图3.由存在内含子的8个位点的扩增片段混合制备成的dna分子量标准i(m-i)，其中第1泳道m为购买的1kbplusdnaladder。

图4.由缺失内含子的6个位点的扩增片段混合制备成的dna分子量标准ii(m-ii)，其中第1泳道为购买的trans2kplusdnaladder。

图5.实施例2中菌株v40-5扩增产物与dna分子量标准i的比较

图6.实施例2中菌株v40-5扩增产物与dna分子量标准ii的比较

图7.实施例2中菌株cm552扩增产物与dna分子量标准i的比较

图8.实施例2中菌株cm552扩增产物与dna分子量标准ii的比较

图9.实施例2中菌株cm09-9-24扩增产物与dna分子量标准i的比较

图10.实施例2中菌株cm09-9-24扩增产物与dna分子量标准ii的比较

图11.实施例3中菌株129扩增产物与dna分子量标准i的比较

图12.实施例3中菌株129扩增产物与dna分子量标准ii的比较

图13.实施例3中菌株13扩增产物与dna分子量标准i的比较

图14.实施例3中菌株13扩增产物与dna分子量标准ii的比较

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例1：dna分子量标准i和ii的制备

1.蛹虫草菌株培养和总dna的提取

将已知线粒体基因型的蛹虫草菌株v40-5、v26-17、f02、cm09-31-18、cm09-9-24、cm06、cm552接种到新鲜制备的pda平板中，之后转接到铺有一层无菌玻璃纸的pda平板中，然后在25℃培养箱中培养1-2周。收集菌丝体，充分研磨后利用ctab法提取总dna。

2.内含子位点的扩增

参照表1，选取从步骤1中适当的菌株中提取的dna作为扩增内含子位点的模板dna。扩增内含子位点时，首选扩增体系1，无法得到理想的扩增条带时可选扩增体系2或扩增体系3。

pcr扩增体系1(总体积50μl)：

pcr扩增体系2(总体积50μl)：

pcr扩增体系3(总体积50μl)：

pcr扩增程序：

1)热启动：pcr仪机盖温度升至105℃，样品槽温度升至94℃时再放入样品；

2)预变性：94℃5min；

3)40个变性-退火-延伸的循环：

变性：94℃1min；

退火：采用二阶段退火法，前5个循环54℃，后35个循环51℃；时间1min；

延伸：72℃，延伸时间在扩增含有内含子的片段时使用2min，在扩增缺失内含子的片段时使用1min；

4)剩余步骤：72℃8min；4℃或12℃保存。

pcr扩增仪：使用美国伯乐公司的t100pcr仪进行扩增。

扩增各内含子位点的引物信息见表2。设计引物时着重考虑了预期扩增片段的长度，使有内含子的各扩增片段和无内含子的各扩增片段分别具有不同的长度，以便通过琼脂糖凝胶电泳能相互区分开。

表2本发明涉及的引物信息

*，在已知线粒体基因型的蛹虫草菌株中没有发现在该位点内含子缺失的情况

根据以上扩增体系和程序，得到在8个内含子位点均含有对应内含子的i类扩增产物(图1)和在6个位点缺失内含子的ii类扩增产物(图2)。扩增产物的大小与预期完全一致。

3.pcr扩增产物的切胶纯化和定量

制备1％的琼脂糖凝胶，将上述扩增产物进行电泳，电泳结束后在geldocxr+凝胶成像系统的紫外灯下切取含有目标电泳条带的胶块，利用omega公司的gelextractionkit进行胶回收纯化，浓缩后获取纯度较高、电泳条带单一的目的dna片段。

用超微量分光光度计nonodrop2000对已纯化的pcr产物进行定量(表3、表4)。其中，i类扩增产物是指在内含子插入位点都有对应内含子的扩增产物，ii类扩增产物是指在这些潜在内含子位点缺失内含子的扩增产物。

表3i类扩增产物各dna片段的定量

表4ii类扩增产物各dna片段的定量

*，在已知线粒体基因型的蛹虫草菌株中没有发现在该位点内含子缺失的情况

4.dna分子量标准的制备及电泳条件的确定

参照表3和表4各dna片段的浓度定量结果，将属于同类扩增产物的dna片段按相同质量混合在一起，分别制备成dna分子量标准i和ii。其中，dna分子量标准i(由在8个内含子位点都存在内含子的8个pcr扩增产物组成)的适宜电泳条件为：0.7％的琼脂糖凝胶，电压90v，电泳时间为120min；各条带从上往下依次代表rnl-i4、cox2、rnl-i1、cox3、rnl-i2、cob、cox1、rnl-i3这八个位点有内含子时的扩增产物大小(图3)。dna分子量标准ii(由在6个内含子位点缺失内含子的6个pcr扩增产物组成)的适宜电泳条件为：2.0％的琼脂糖凝胶，电压100v，电泳时间为60min；各条带从上往下依次代表cox2、rnl-i1、cox3、rnl-i3、cox1、cob这六个位点缺失内含子时的扩增产物大小(图4)。通过所述电泳条件下的琼脂糖凝胶电泳，构成dna分子量标准i和ii的各个条带清晰可辨。

实施例2：用制备的dna分子量标准i和ii验证已知蛹虫草菌株的线粒体基因型

1.蛹虫草菌株培养和总dna的提取

选择3株线粒体基因型已知的蛹虫草菌株v40-5、cm552和cm09-9-24，按照实施例1中的描述进行菌株培养和总dna的提取。

2.内含子位点的扩增

根据实施例1的描述，从以上3个菌株中分别用表2所列的8对引物组合进行pcr扩增。pcr扩增时的延伸时间使用2min。

3.已知蛹虫草菌株线粒体基因型的确认

本课题组之前的研究表明，菌株v40-5在所检测的8个位点均存在内含子(scientificreports2017,7:40219)。从附图5和6可以看出，来自v40-5八个位点的扩增条带大小很好地对应了dna分子量标准i中的各个条带，而没有对应dna分子量标准ii中的条带。该结果验证了菌株v40-5在8个位点均含有内含子。

本课题组之前研究表明，菌株cm552在cob、cox1、cox2、rnl-i2和rnl-i4这5个位点含有内含子，而在cox3、rnl-i1和rnl-i3这3个位点缺失内含子(scientificreports2017,7:40219)。从附图7和8可以看出，在来自cm552八个位点的扩增条带中，cob、cox1、cox2、rnl-i2和rnl-i4这5个位点有与dna分子量标准i对应的条带，而无与dna分子量标准ii对应的条带；cox3、rnl-i1和rnl-i3这3个位点有与dna分子量标准ii对应的条带，而无与dna分子量标准i对应的条带。该结果验证了菌株v40-5在cob、cox1、cox2、rnl-i2和rnl-i4这5个位点含有内含子，而在cox3、rnl-i1和rnl-i3这3个位点缺失内含子。

本课题组之前研究表明，菌株cm09-9-24在cox1、rnl-i2、rnl-i4这3个位点含有内含子，而在其余5个位点都缺失内含子(scientificreports2017,7:40219)。从附图9和10可以看出，在来自cm09-9-24八个位点的扩增条带中，cox1、rnl-i2和rnl-i4这3个位点有与dna分子量标准i对应的条带，而无与dna分子量标准ii对应的条带；cob、cox2、cox3、rnl-i1和rnl-i3这五个位点有与dna分子量标准ii相对应的条带，而无与dna分子量标准i对应的条带。该结果验证了菌株cm09-9-24在cox1、rnl-i2、rnl-i4这3个位点含有内含子，而在其余5个位点缺失内含子。

综上所述，利用本发明制成的dna分子量标准i和dna分子量标准ii，3个已知蛹虫草菌株的线粒体基因型都得到了成功验证，证明了本发明所述检测方法的有效性。

实施例3：用制备好的dna分子量标准i和ii检测未知蛹虫草菌株的线粒体基因型

1.蛹虫草菌株培养和总dna的提取

选择2株线粒体基因型未知的蛹虫草菌株129和13，按照实施例1的描述进行菌株培养和总dna的提取。

2.目的dna片段的扩增

根据实施例1的描述，从这2个菌株中分别用表2所列的8对引物组合进行pcr扩增。pcr扩增时的延伸时间选择2min。

3.未知蛹虫草菌株线粒体基因型的检测

从附图11和12可以看出，菌株129在rnl-i2和rnl-i4这两个位点有与dna分子量标准i对应大小的条带，而无与dna分子量标准ii对应的条带；cob、cox1、cox2、cox3、rnl-i1、rnl-i3这6个位点有与dna分子量标准ii对应的条带，而无与dna分子量标准i对应的条带。该结果表明，菌株129只在rnl-i2和rnl-i4这两个位点含有内含子，而在其它6个位点缺失内含子。

从附图13和14可以看出，菌株13在cob、cox1、cox2、cox3、rnl-i1、rnl-i2和rnl-i4这7个位点都有与dna分子量标准i对应大小的条带，而无与dna分子量标准ii对应的条带；rnl-i3位点有与dna分子量标准ii对应的条带，而无与dna分子量标准i对应的条带。该结果表明，菌株13在cob、cox1、cox2、cox3、rnl-i1、rnl-i2和rnl-i4这7个位点均含有内含子，而在rnl-i3位点缺失内含子。

综上所述，本发明制成的两种dna分子量标准可用于确定未知蛹虫草菌株的线粒体基因型。

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<110>山西大学

<120>一种蛹虫草线粒体基因型的检测方法

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