蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法。
【背景技术】
[0002]纳米银(Silver nanoparticles , AgNPs)是研究和应用最为广泛的纳米抗菌材料O纳米银是一种粒径在I?100 nm之间的金属银微粒。近年来研究发现纳米银以其大的比表面积和小尺寸效应，极大提高了对细菌表面的吸附性和渗透性，具有抑菌性强、抗菌谱广、不易产生耐药性等优点，为新型抗菌材料的研发开辟了新的方向。
[0003]纳米银的制备技术种类繁多，采用较多的是化学法还原法，但化学方法采用的化学试剂常对环境和人体健康造成危害。另外，银纳米粒子极易团聚和被氧化，导致在应用时失去其应有的功能，不利于长期稳定使用。近年来纳米生物合成法利用植物、微生物等生物中的活性物质作为还原剂和稳定剂制备纳米银，具有价格低廉、合成效率高、反应条件温和、产物稳定、绿色环保等优点。
[0004]蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草、北虫草等。为子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属。蛹虫草是现代珍稀中草药，在药效成分种类上与传统冬虫夏草相近，蛹虫草中富含虫草多糖、虫草素(37 -脱氧腺苷)、虫草酸(D-甘露醇)、麦角留醇、腺苷、超氧化物歧化酶(SOD)等多种有效成分。其中丰富的还原性物质为纳米银的生物合成提供了保障，并且由于其菌丝体提取物中富含糖类、脂类、蛋白质等生物大分子，能够与纳米材料结合而赋予其优异的理化性状和独特的生物学特性，为新型纳米抑菌材料的制备打下了基础。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种生产成本低，得到的银纳米粒子抗菌谱广，能够避免传统化学方法合成纳米银危害环境弊端的蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法。
[0006]本发明的技术解决方案是:
一种蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法，其特征是:包括下列步骤:
(1)蛹虫草菌丝体的制备:
取保藏于试管斜面上的蛹虫草菌苔2-3 Cm2，置于100 ml PDA液体培养基中，23°C、130rpm空气浴震荡器中培养4-5 d，获得蛹虫草菌丝体；
(2)蛹虫草菌丝体浸提液制备:
将步骤(I)中含有蛹虫草菌丝体的液体培养基用双层纱布过滤收集蛹虫草菌丝体，再用超纯水对收集到的蛹虫草菌丝体冲洗3次，按照质量比:蛹虫草菌丝体:水=1:10的比例加入灭菌超纯水，悬浮菌丝体，置于23°C恒温摇床150 rpm震荡培养24 h，用双层纱布过滤收集滤液，得到蛹虫草菌丝体浸提液；
(3)纳米银的生物合成
取2mL 0.0lM AgNO3溶液加入到18mL蛹虫草菌丝体浸提液中，将溶液搅拌，120°C油浴加热回流2 h，即得到生物合成的纳米银材料，4 °C避光保存。
[0007]PDA液体培养基中含有马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L。
[0008]得到的纳米银材料还进行抑菌圈实验进行验证抑菌效果:
分别选用4种临床病原菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和4种水产病原菌:鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、点状气单胞作为指示菌，采用琼脂扩散法检测合成纳米银的抑菌活性；临床病原菌采用LB培养基，37°C培养;供试水产病原菌采用2216E培养基，28°C培养;将指示菌培养液50 yL加到5 mL液体培养基中，200 rpm震荡8?10h，培养至对数增长期，菌液用生理盐水稀释至16 CFU/mL，分别取10yL均匀涂布于固体培养基上，然后在培养基上放置杯外径为8mm的牛津杯，杯中加入得到的纳米银材料20 yL，用蛹虫草菌丝体浸提液和生理盐水做阴性对照，做三次重复;将培养平皿在恒温培养箱中培养18 h后观察。
[0009]本发明生产成本低，得到的银纳米粒子抗菌谱广，能够避免传统化学方法合成纳米银危害环境的弊端。
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
【具体实施方式】
[0011]—种蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法，包括下列步骤:
(1)蛹虫草菌丝体的制备:
取保藏于试管斜面上的蛹虫草菌苔2-3 Cm2，置于100 ml PDA液体培养基中，23°C、130rpm空气浴震荡器中培养4-5 d，获得蛹虫草菌丝体；
(2)蛹虫草菌丝体浸提液制备:
将步骤(I)中含有蛹虫草菌丝体的液体培养基用双层纱布过滤收集蛹虫草菌丝体，再用超纯水对收集到的蛹虫草菌丝体冲洗3次，按照质量比:蛹虫草菌丝体:水=1:10的比例加入灭菌超纯水，悬浮菌丝体，置于23°C恒温摇床150 rpm震荡培养24 h，用双层纱布过滤收集滤液，得到蛹虫草菌丝体浸提液；
(3)纳米银的生物合成
取2mL 0.0lM AgNO3溶液加入到18mL蛹虫草菌丝体浸提液中，将溶液搅拌，120°C油浴加热回流2 h，即得到生物合成的纳米银材料，4 °C避光保存。
[0012]PDA液体培养基中含有马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L。
[0013]得到的纳米银材料还进行抑菌圈实验进行验证抑菌效果:
分别选用4种临床病原菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和4种水产病原菌:鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、点状气单胞作为指示菌，采用琼脂扩散法检测合成纳米银的抑菌活性;临床病原菌采用LB培养基(酵母提取物5 g/L，蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L)，37°C培养;供试水产病原菌采用2216E培养基(蛋白胨5 g，酵母膏I g，磷酸高铁0.01 g，陈海水定容至1000 mL)，28°C培养;将指示菌培养液50 yL加到5 mL液体培养基中，200 rpm震荡8?10 h，培养至对数增长期，菌液用生理盐水稀释至16 CFU/mL，分别取10yL均匀涂布于固体培养基上，然后在培养基上放置杯外径为8mm的牛津杯，杯中加入得到的纳米银材料20 yL，用蛹虫草菌丝体浸提液和生理盐水做阴性对照，做三次重复;将培养平皿在恒温培养箱中培养18 h后观察。抑菌圈实验表明生物合成的纳米银对供试的临床病原菌和水产病原菌均产生显著的抑菌圈，说明合成的纳米银抑菌剂能有效抑制供试病原菌的生长;而作为对照的蛹虫草浸提液和生理盐水则对病原菌完全没有抑制作用。
【主权项】
1.一种蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法，其特征是:包括下列步骤: (1)蛹虫草菌丝体的制备: 取保藏于试管斜面上的蛹虫草菌苔2-3 Cm2，置于100 ml PDA液体培养基中，23°C、130rpm空气浴震荡器中培养4-5 d，获得蛹虫草菌丝体； (2)蛹虫草菌丝体浸提液制备: 将步骤(I)中含有蛹虫草菌丝体的液体培养基用双层纱布过滤收集蛹虫草菌丝体，再用超纯水对收集到的蛹虫草菌丝体冲洗3次，按照质量比:蛹虫草菌丝体:水=1:10的比例加入灭菌超纯水，悬浮菌丝体，置于23°C恒温摇床150 rpm震荡培养24 h，用双层纱布过滤收集滤液，得到蛹虫草菌丝体浸提液； (3)纳米银的生物合成 取2mL 0.0lM AgNO3溶液加入到18mL蛹虫草菌丝体浸提液中，将溶液搅拌，120°C油浴加热回流2 h，即得到生物合成的纳米银材料，4 °C避光保存。2.根据权利要求1所述的蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法，其特征是:PDA液体培养基中含有马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/Lo3.根据权利要求1所述的蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法，其特征是:得到的纳米银材料还进行抑菌圈实验进行验证抑菌效果: 分别选用4种临床病原菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和.4种水产病原菌:鳗弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、点状气单胞作为指示菌，采用琼脂扩散法检测合成纳米银的抑菌活性；临床病原菌采用LB培养基，37°C培养;供试水产病原菌采用.2216E培养基，28°C培养;将指示菌培养液50 yL加到5 mL液体培养基中，200 rpm震荡8?.10 h，培养至对数增长期，菌液用生理盐水稀释至16 CFU/mL，分别取10yL均匀涂布于固体培养基上，然后在培养基上放置杯外径为8mm的牛津杯，杯中加入得到的纳米银材料20 μL，用蛹虫草菌丝体浸提液和生理盐水做阴性对照，做三次重复;将培养平皿在恒温培养箱中培养18 h后观察。
【专利摘要】本发明公开了一种蛹虫草提取液生物合成纳米银抑菌剂的方法，包括蛹虫草菌丝体的制备、蛹虫草菌丝体浸提液制备、纳米银的生物合成等步骤。本发明生产成本低，得到的银纳米粒子抗菌谱广，能够避免传统化学方法合成纳米银危害环境的弊端。
【IPC分类】B82Y40/00, B22F9/24, C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN105499603
【申请号】CN201510984435
【发明人】王磊, 徐慧, 周美红
【申请人】鲁东大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月25日