本发明属于食用菌药用菌遗传育种领域，具体涉及一种紫外线二次诱变育种的方法，尤其涉及一种提高菌种的变异量的蛹虫草紫外线二次诱变育种的方法。
背景技术：
冬虫夏草(拉丁学名cordycepssinensis(berk.)sacc)又名虫草，是我国特产的一种名贵滋补药材，与人参、鹿茸齐名，为传统三大补品之一。其营养成分高于人参，可入药，也可食用，是上乘的佳肴，具有很高的营养价值。冬虫夏草可以增强机体的免疫力，滋补肺肾，对肺癌、肝癌等有明显的抑制作用。在临床上对肺虚久咳，气喘，肺结核咯血，盗汗，肾虚腰膝酸痛，阳痿遗精，神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。
蛹虫草(拉丁学名cordycepsmilitaris)，又称作北冬虫夏草、北虫蛹草、北蛹虫草等，属于麦角菌科虫草属，与冬虫夏草同属异种，药用价值与驰名中外的冬虫夏草相似。蛹虫草世界性分布，天然资源数量很少，在我国主要产于云南(昆明、安宁、江川)、吉林(安图、永吉)、辽宁(沈阳)、内蒙古(哲里木盟)等地，生于针、阔叶林或混交林地表土层中鳞翅目昆虫的蛹体上。
蛹虫草对环境的要求较低，液体发酵可形成菌丝体，人工大规模固体培养可获得子座。蛹虫草的成分如虫草多糖和虫草酸，与天然的冬虫夏草的含量相当，有些成分的含量甚至超过冬虫夏草，如虫草素的含量是天然冬虫夏草的35倍以上。蛹虫草的有效活性成分虫草多糖被认为是非特异性免疫调节剂，可激活肌体的免疫细胞。与冬虫夏草相比，蛹虫草具有以下几个优点：蛹虫草作为虫草属的模式种，分布广泛，为世界各国学者所认识和接受；蛹虫草已在人工条件下育成了完整子座；蛹虫草含有虫草素和虫草多糖，其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。因为具有以上优点，蛹虫草已经成为虫草属中药用虫草菌中的佼佼者。
由于蛹虫草独特的药用价值、营养价值、科研价值以及潜在的巨大经济价值，人工培育蛹虫草的技术受到了广泛关注。蛹虫草栽培是一系列复杂操作的工作程序，包括菌株选择、母种选育与保存、菌种制备、出草管理以及市场销售等，每个程序都必不可少且至关重要。其中育种又是这些程序中的首要内容，没有优良的菌种，其他工作程序的准备或优化就没有基础，最终可能直接造成蛹虫草减产或栽培失败。
然而现有的蛹虫草人工培养多关注改进或优化培养基配方和培养条件或总体考虑各个步骤的培养基配方和培养条件，少关注菌种驯化。例如，cn1724641a公开了一种北冬虫夏草液体菌种营养基的制备方法及其应用。该发明主要通过选取不同的原料，包括胡萝卜、葡萄糖等物料，然后进行充分混合，再加入一定量的链霉素后进行发酵，制得北冬虫夏草液体菌种营养基；然后在培育北冬虫夏草的过程中进行温度、时间的不同控制，以达到较好的培育效果。cn101463325a公开了一种北冬虫夏草工厂化栽培方法，经菌种制备、配料装瓶、灭菌、接种、培养、出草采收步骤、工厂化栽培北冬虫夏草，采用了常见的人工代料作为培养材料，降低了生产成本。该发明获得的北冬虫夏草质量稳定性好，生物转化率高。cn104054513a公开了一种可以代替冬虫夏草入药、能代替天然冬虫夏草药源的北冬虫夏草菌种培养方法，该技术方案包括下列步骤：(1)母种制备；(2)母种转原种和栽培种；(3)悬浮液菌种或/液体菌种的制备；(4)北冬虫夏草菌种的人工栽培。该发明公布的北冬虫夏草菌种培养方法，能够增加冬虫夏草的产量。
技术实现要素：
为解决蛹虫草人工培养菌株筛选问题，本发明提供一种蛹虫草紫外线二次诱变育种的方法。本发明提供的方法能大幅度地增加菌种的变异量，从而有利于技术人员从诱变后的群体中筛选优良菌株。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案：
本发明提供一种蛹虫草紫外线二次诱变育种的方法，包括如下步骤：
1)准备蛹虫草孢子悬浮液；
2)第一次诱变处理；
3)第二次紫外线照射诱变处理；
4)挑菌筛选。
优选地，所述第二次紫外线照射诱变处理的照射时间为1～2.5分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述第二次紫外线照射诱变处理，照射时间为2分钟。
优选地，所述第一次诱变处理选自紫外线诱变处理、x光线诱变处理、y射线及硫酸二乙酯诱变处理、5-溴尿嘧啶诱变处理、氮芥诱变处理、n"广甲基n"亚硝基胍诱变处理中的一种。
优选地，所述第一次诱变处理为紫外线照射诱变处理，照射时间为0.8～1.5分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述第一次诱变处理为紫外线照射诱变处理，照射时间为1分钟。
在本发明的具体实施方式中，在第二次紫外线照射诱变处理之前，应先将紫外线光源紫外灯开启20～60分钟。
在本发明的一种实施方式中，在第二次紫外线照射诱变处理之前，应先将紫外线光源紫外灯开启20分钟。
在本发明的具体实施方式中，在第一次紫外线照射诱变处理之前，应先将紫外线光源紫外灯开启20～60分钟。
在本发明的一种实施方式中，在第一次紫外线照射诱变处理之前，应先将紫外线光源紫外灯开启20分钟。
制备蛹虫草孢子悬浮液选用无菌生理盐水或磷酸缓冲液均可。
紫外照射诱变诱变处理应在黑暗处进行，优选黑暗无菌室或超净工作台，箱内装15-20瓦紫外灯1支，悬挂于30厘米高处。诱变处理时应先开灯20～60分钟，使紫外灯波长稳定，然后将蛹虫草孢子悬浮液倒入无菌培养皿中，打开皿盖，照射数分钟。
当蛹虫草孢子悬浮液每毫升所含的活孢子数约在106～113个时，如本领域技术人员所知，为得到单个菌落，孢子悬浮液稀释倍数范围可以是1000-10万倍。
本发明取得了以下技术效果：
本发明提供的方法能大幅度地增加蛹虫草孢子的变异量，从而有利于技术人员从诱变后的群体中筛选优良菌株，进而筛选出虫草素、腺苷、多糖或蛹虫草产量高的优良菌株，以提高蛹虫草的药用/食用价值以及经济价值。
具体实施方式
为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。
实施例1蛹虫草紫外线二次诱变育种的方法
包括四个步骤：
1)准备蛹虫草孢子悬浮液
出发菌株：蛹虫草品种ycc-01。
将新鲜的无菌孢子移入5ml无菌生理盐水中，摇匀后即成孢子悬浮液。孢子悬浮液的终浓度为每毫升含孢子108～115个。
2)第一次诱变处理
在黑暗超净工作台进行，箱内装15-20瓦紫外灯1支，悬挂于30厘米高处，诱变处理时应先开灯20分钟，使波长稳定，然后将蛹虫草孢子悬浮液倒入直径为6厘米的无菌培养皿中，打开皿盖，照射1分钟。
经检测，照射后的蛹虫草孢子悬浮液每毫升所含的活孢子数约在106～113个。
因此为得到单个菌落，先用无菌水将照射后的孢子悬浮液稀释10万倍、100万倍、1000万倍，然后分别取释释液0.3ml涂布于装有琼脂培养基的培养皿上，在22℃下培养4～6天直到每个平板上得到单菌落。
3)第二次紫外线照射诱变处理
在黑暗超净工作台进行，箱内装15-20瓦紫外灯1支，悬挂于30厘米高处，诱变处理时应先开灯20分钟，使波长稳定，然后将第一次诱变处理得到的蛹虫草单菌落平板打开皿盖，照射2分钟。选纯正、健壮的单个菌落移入斜面试管内，供下一步挑菌筛选。
4)挑菌筛选
选纯正、发育健全的单个菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待长好后，再分别接入2～3瓶300ml液体营养液中，然后分级进行栽培试验，按照本领域常规方法检测蛹虫草虫草素的含量以评价蛹虫草的变异量。
实施例2虫草素的含量检测方法
参考cn102060898b实施例5公开的方法。
称取150g的干燥人工培养的蛹虫草子实体，用力压碎后，加入到行星球磨机的250ml球磨灌中，调整转速为500r/min，氧化铝球个数为20(10大球和10小球)，采用正反交替研磨，交替时间5min，处理总时间为30min，得到蛹虫草子实体粉末。将150g粉末加入到1500ml的蒸馏水中，用0.1mol/lhcl调整ph为2.5，温度为45℃，用频率为30khz超声波处理1h，处理完后离心(3000r/min，10min)，收集上清液，在上清液中加入45g活性炭吸附色素，再过滤，在滤液中再加入45g活性炭吸附色素，重复操作，直到上清液没有颜色为止，将此上清液先用300ml的乙酸乙酯在空化混悬萃取装置中萃取，弃去乙酸乙酯层，剩余液体再用300ml的氯仿在空化混悬萃取装置中萃取，弃去氯仿层，剩余液体上d101层析柱，先用蒸馏水洗脱至流出液无色，再用ph为5.5的体积分数为50％的乙醇水溶液以1ml/min速度洗脱，收集洗脱液，真空干燥即得虫草素晶体，称量得到每150g的干燥人工培养的蛹虫草子实体虫草素含量。
实施例3菌种变异量检测
以虫草素的含量为评价指标评价诱变处理后蛹虫草的变异量。
待检测样品：
样品1：实施例1第一次诱变处理后得到的单菌落选纯正、发育健全的100个单菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待长好后，再分别接入2～3瓶300ml液体营养液中，分级进行栽培。分别测定每个单菌落培养得到的子实体的虫草素含量。
样品2：实施例1第二次紫外线照射诱变处理后得到的单菌落选纯正、发育健全的100个单菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待长好后，再分别接入2～3瓶300ml液体营养液中，分级进行栽培。分别测定每个单菌落培养得到的子实体的虫草素含量。
对照样品1：未做诱变处理的蛹虫草品种ycc-01无菌孢子移入5ml无菌生理盐水或磷酸缓冲液中，摇匀后即成孢子悬浮液。孢子悬浮液的终浓度为每毫升含孢子108～115个。取释释液0.3ml涂布于装有琼脂培养基的培养皿上，在22℃下培养4～6天直到每个平板上得到单菌落。选纯正、发育健全的100个单菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待长好后，再分别接入2～3瓶300ml液体营养液中，分级进行栽培。分别测定每个单菌落培养得到的子实体的虫草素含量。
对照样品2：按照实施例1第一次诱变处理的方法处理蛹虫草孢子，处理时间为3分钟。选纯正、发育健全的100个单菌落移入斜面试管内，一个菌落只接一支斜面，待长好后，再分别接入2～3瓶300ml液体营养液中，分级进行栽培。分别测定每个单菌落培养得到的子实体的虫草素含量。
蛹虫草栽培方法：
1)采用马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，酵母膏2g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁1g，水1000ml配方按常规繁育生产用液体菌种。
2)采用750ml的玻璃罐头瓶为容器，每瓶45克小麦，加水70ml，1.05公斤/平方厘米压力灭菌75分钟，冷却接种。
3)菌瓶先放于20℃避光培养6天，然后转入光暗交叉培养，每天白天以1000勒克斯强度光照，晚上暗培养，环境湿度85％，每天通风3次。
4)整个生产周期55天，子实体长度控制在8～12厘米，其它按常规操作，每批采样后抽样测定虫草素含量。
试验结果：
检测结果显示，与对照样品1相比，样品1中有20％以上的单菌落培养得到的子实体的虫草素含量变化值在50％以上；样品2中有80％以上的单菌落培养得到的子实体的虫草素含量变化值在50％以上；对照样品2中有40％以上的单菌落培养得到的子实体的虫草素含量变化值在50％以上。
以上实验结果表明，第二次紫外线照射诱变处理能大幅度地增加菌种的变异量，且所述诱变效果(变异量)大于单纯延长紫外线照射处理时间的变异量。本发明公布的蛹虫草紫外线二次诱变育种的方法将有利于技术人员从诱变后的群体中筛选优良菌株。
本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“比如、诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元件对于实施本发明是必要的。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。