一种用于同时检测线粒体dna 4401a＞g和4435a＞g突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种用于同时检测线粒体DNA4401A> G和4435A>G突变的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730 万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病 的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全 世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破 裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血 压约占所有高血压的90-95%。
[0003] 线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷 (ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，所以有"细胞动力工厂"之称。除了为细胞供能 外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细 胞周期的能力。
[0004] 线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体tRNA基因突变是与原发性 高血压相关的突变热点区域，2009年GuanMX等人发现，位于线粒体tRNAMet基因4435A >G突变与原发性高血压相关（YuqiLiu，Min_XinGuanetal.Hypertention，2009;53: 1083-1090)，2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体tRNAMet基因4435A>G可能影 响原发性高血压的发生发展（ZhongqiuLu，Min_XinGuanetal.EurJHumGenet，2011 ; 19 :1181-1186)〇
[0005] 目前对于突变检测最常用方法为第一代测序测序技术，但此技术对仪器要求高， 操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污染；PCR-限制性片段 长度多态性（PCR-RFLP)是目前应用较广泛、相对成熟的检测方法，但操作繁琐，操作过程 中影响结果的不确定因素太多；近年来，变性高效液相色谱（DHPLC)和基因芯片的应用为 点突变检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检 测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快速、准确、操作简 易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。
【发明内容】
[0006] 本发明通过酶切法进行线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变检测，克服了现 有方法耗时长、操作难、成本高等缺点，提供线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变检测 试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测。
[0007] 本发明采用的技术解决方案是：一种用于同时检测线粒体DNA4401A> 6和 4435A>G突变的方法，所述的方法包括以下步骤：
[0008] (1)提取全基因组DNA:运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚-氯仿-异戊醇法，提取 全基因组DNA;
[0009] (2)特异性PCR扩增：根据人类线粒体基因剑桥参考序列，线粒体引物6F、6R作为 巢式PCR的第一对引物，特异性扩增mtDNA3796-4654位，全长898bp，产物进行纯化后，接 着以纯化后产物为模板，采用线粒体小引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作为巢式PCR的第二对引物， 特异性扩增mtDNA4344-4577位，全长234bp;
[0010] ⑶采用限制性内切酶Blaf的特异性识别序列为CTAG回文结构，限制性内切酶 Nlalll的特异性识别序列为CATG回文结构的特点，然后根据上述的特异性条带对扩增的 DNA进行酶切；
[0011] (4)电泳鉴定：酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切产物DNA片段数量及大 小即可鉴定线粒体DNA是否发生4401A>G或4435A>G突变。
[0012] 所述的全基因组DNA从细胞、血液以及组织样本中提取。
[0013] 一种所述的用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的方法的试剂 盒，所述的试剂盒包括提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、酶切反应试剂、阳 性标准品、阴性标准品。
[0014] 所述的取样本全基因组DNA的试剂包括包含裂解液、溶液I、酚-氯仿-异戊醇混 合液和溶液II，所述溶液I的主要成分为蛋白酶K，溶液II的主要成分为氢氧化钠。
[0015] 所述的PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、引物、Taq酶和三蒸 水。
[0016] 所述的酶切反应试剂包括限制性内切酶Blaf和Nlalll和酶切缓冲液。
[0017] 本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于同时检测线粒体DNA4401A> 6和 4435A>G突变的试剂盒及其检测方法，本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可 用于后续实验研究，如血液样本可建立永生化类淋巴母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细 胞培养、组织可用于诱导多功能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源本试剂盒借助特异 性PCR技术与专一性限制性内切酶，利用双酶切技术可直接根据酶切产物DNA片段数量及 大小同时检测线粒体DNA是否发生4401A>G或4435A>G突变。另外值得一提的是，本 试剂盒提供的阳性标准品和阴性标准品可以对应用本试剂盒的检测结果进行对比分析，从 而更直观、更清晰的分析检测结果，本发明利用双酶切技术可直接根据酶切产物DNA片段 数量及大小同时检测线粒体DNA是否发生4401A>G或4435A>G突变。且酶切活性稳定， 技术易掌握，且结果便于分析，检测方便快速，必将成为临床推广原发性高血压线粒体相关 突变的新方法，本发明检测方法操作简便、易掌握；对仪器设备及操作人员无特殊要求，适 合在一般医院、分子生物实验室开展。
【附图说明】
[0018]图1为特异性条带扩增循环条件。（A. 6F和6R引物特异性条带扩增循环条件； B.Mt-Hp-F和Mt-Hp-R引物特异性条带扩增循环条件）
[0019] 图2为突变样本、对照样本PCR产物及酶切产物图。（其中图2A为携带线粒体DNA 4401A>G突变样本双酶切产物电泳图；图2B为携带线粒体DNA4435A>G突变样本双酶 切产物电泳图；图2C为双突变样本双酶切产物电泳图；图2D为不携带线粒体DNA4401A> G和4435A>G突变样本双酶切产物电泳图；Μ为50bpDNALadder，泳道1为巢式PCR产 物，泳道2为酶切产物，泳道3为空白对照）
[0020] 图3为突变样本、对照样本测序验证酶切方法图。
[0021] 图4为本发明检测4401A>G和4435A>G突变原理图。
【具体实施方式】
[0022] 1.DNA的提取：运用酚-氯仿-异戊醇法提取血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜 刮片或唾液的样本中的DNA。
[0023] 2.特异性引物设计及特异性条带PCR扩增：根据人类线粒体基因序列 (NC_012920. 1)采用文献报道的线粒体引物6F、6R作为巢式PCR的第一对引物，特异性扩 增mtDNA3796-4654位，全长898bp。产物纯化后，以其为模板，采用文献报道的线粒体小 引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作为巢式PCR的第二对引物，特异性扩增mtDNA4344-4577位，全长 234bp，同样对产物进行纯化。
[0024] 3.专一性酶切及电泳鉴定：采用限制性内切酶Blaf和Nlalll对上述特异性条带 进行酶切，酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，即可鉴定是否发生4401A>G或4435A>G突 变。
[0025] 具体步骤如下：
[0026] 1.收集标本：从细胞、血液以及组织样本中快速提取全基因组DNA，针对采样方 式、样本来源以及样本形式的不同，对不同样本和样本形式选择相应的方法进行预处理，处 理方法如下：
[0027](1)收集样品前准备好灭菌的收集容器，每人250ml瓶子2瓶（内有5ml双抗）， 选择晨尿，主要收集中段尿，瓶口不要碰到任何皮肤部位，收集150-200ml尿液，将尿液转 移至50ml的离心管中，400g离心lOmin，弃上清，加10mlPBS，清洗一次，400g离心lOmin， 弃上清；
[0028] (2)指尖采血：用手指按摩采血部位，使中指或无名指指尖自然充血，再用医用酒 精棉球消毒皮肤，待酒精挥发干燥后，右手持消毒刺针，自指尖腹侧迅速刺入2mm，立即出 针，让血液自然流出，用消毒棉球擦去第一滴血后，按需要依次采血，采血完毕，用消毒干棉 球压住伤口片刻。静脉采血：先用碘酊棉签自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒 皮肤，待碘酊挥发后，再用医用酒精棉签以同样方法拭去碘迹，然后左手拇指固定静脉穿刺 部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，使针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头 与皮肤成30度角快速刺人皮肤，然后以5度角向前穿破静脉壁进人静脉腔，见回血后，将针 头顺势探人少许。取50~100μ1血液标本（如一滴血）或lcm2的血滤纸片放入1. 5ml Eppendorf管中，用PBS补至200μ1，室温静置10分钟；
[0029] (3)收集组织前，要让受检者了解研究内容，并自愿同意参加试验的原则并签订 《知情同意书》。先用医用酒精棉球从内向外对采集皮肤处进行消毒，然后涂上局部麻醉软 膏，贴上麻醉贴，然后用采集皮肤组织的器具采集米粒大小的皮肤组织，将组织放入含有双 抗的PBS溶液中。
[0030] 然后用细胞裂解液和溶液I对上述样本进行消化裂解，再用酚-氯仿-异戊醇沉 淀DNA，用乙醇清洗有机溶剂，最后用溶液II溶解DNA后于-20°C保存备用。
[0031] 2.特异性引物设计
[0032] 根据人类线粒体基因序列（NC_012920. 1)采用文献报道的线粒体引物6F、6R作 为巢式PCR的第一对引物，特异性扩增mtDNA3796-4654位，全长898bp。线粒体小引 物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作为巢式PCR的第二对引物，特异性扩增mtDNA4344-457