Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒及应用的制作方法

专利名称：Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及用于检测与Leber氏病相关的线粒体DNA ND5T12338C突变的试剂盒，还涉及一种与原发性Leber氏病相关的线粒体基因突变的检测方法，特别涉及检测线粒体M^T12338C突变的方法，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与原发性Leber氏病相关的线粒体DNA T12338C突变中的应用。
背景技术：
Leber 遗传性视神经病变(Leber，s Hereditary Optic Neuropathy, LH0N,简称Leber氏病)是一种母系遗传性视神经病变，主要累及视网膜、巩膜筛板前部视乳头黄斑束纤维，导致视神经退行性变的母系遗传病，严重的影响着人们正常的生产、生活。根据国家卫生部(http://www .moh.gov.cn/)最新数据统计我国现有的低视力人口约有710万,盲人约有500万，占总人数的0.4%，成为世界上视力损伤最严重的国家之一。其中，由视神经病变引起的约为55万。1871年德国眼科医生Theodor Leber首次报道该病的临床症状、体征和遗传特性。1972年Erickson等发现LHON的遗传方式呈典型的母系遗传特征。1988年Wallace DC等发现了第一个与LHON相关的线粒体基因组DNA(mitochondria DNA, mtDNA)突变位点似衫G11778A。目前已报道50多种线粒体DNA突变位点与LHON致病相关(http://www.mitomap.0rg/),其中90%以上的LHON的家系是由氧化磷酸化复合物I亚基上的ND4G11778A、ND1 G3460A和ND6 T14484C这3个原发突变位点所致。为了进一步探究LHON的发病机制，在全国范围内收集了大量的LHON家系，除上述3个原发性突变位点外，相继发现了 tRNAMetA4435G、似衫 G11696A、tRNAThr A15951G、M 7 T3866C 和似枚 T12338C 突变与 LHON相关，与线粒体相关的原发性Leber氏病在早期临床症状不明显，早期的检查常常会因此被耽误，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA突变筛查，对于预防和控制与线粒体相关的原发性Leber氏病的发生有着极其重要的作用。自发现与mtDNA突变相关的疾病以来，检测线粒体突变位点的检测方法主要还是序列测定。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。近年来，国内相继报道了 Leber遗传性视神经病变的基因诊断试剂盒及其检测方法，以满足对线粒体突变突变进行广泛筛查的需要，如福建医科大学于2005年申请了的基因诊断试剂盒及其检测方法专利(专利号:200510006097.8)，该发明是根据90 %以上的Leber氏遗传性视神经病变患者的线粒体DNA突变属于3个原发性致病位点突变(G11778A、G3460A和T14484C)，设计和合成位点特异性PCR引物，直接以全血样作PCR的DNA模板，利用等位基因特异性多重PCR技术，单管一次性PCR反应，同时检测LHON患者的线粒体DNA的3个原发性致病突变位点，具有简便快速、高效、费用低、特异性好、只需微量血液样本等优点，为LHON患者的快速临床基因诊断提供一种简易、可靠的方法和试剂盒，具有巨大的普及推广应用价值。但是该方法存在血液中直接PCR扩增的难度加大，实验中采取的多重PCR的条件要求将会增加，检测方法跟普通的方法没有本质的区别。2006年杭州优思达生物科技有限公司建立一种以单核苷酸多态性核酸试纸快速检测LHON线粒体DNA中G11778A位点突变的新方法(专利号:200610003429.1)。在应用单核苷酸多态性核酸检测试纸条进行多态位点或突变位点的检测时，需要设计一条特异性延伸引物，这条引物的3’端碱基紧临多态性碱基或突变碱基，其在DNA聚合酶的作用下开始延伸，带有抗原标记与模板对应的双脱氧单核苷酸(ddNTP)被连接到延伸引物上。虽然该方法能够实现短时间内的检测阳性位点，但PCR扩增条件严格，存在假阴性的几率大大增加。

发明内容
本发明的目的是针对目前检测tRNAIle T12338C突变的方法所存在的缺点，提供一种Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒，是一种快速、简便、准确、经济的检测原发性Leber氏病相关的线粒体DNA突变的试剂盒。本发明提供的试剂盒，由置于盒体内的DNA提取混合液、扩增T12338C的PCR混合液、针对T12338C设计的一对外引物、针对T12338C设计的一对内引物、限制性内切酶Psi 1、阳性对照和阴性对照构成。其中提取DNA提取混合液主要由细胞裂解液和溶液I(主要成分是蛋白酶K)组成；扩增T12338C的PCR混合液试剂包括dNTP (脱氧单核苷酸)、10XPCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T12338C设计的外引物包括外前向引物 F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1)，外反向引物 R: AGA AGG ATATAA TTC CTA CG (SEQ ID NO:2);针对T12338C设计的内引物包括内前向引物F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAM TTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA (SEQ ID NO:3)，内反向引物R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA (SEQ ID NO:4);限制性内切酶包括限制性内切酶Psi I ；阳性标本对照是不含有线粒体序列第12338位点发生T>C突变的酶切样本、阴性标本对照是含有线粒体序列第12338位点发生T>C突变的酶切样本。在上述试剂 盒中，在扩增T12338C的PCR混合液中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜(0.1-0.2 μ I)。本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测与Leber氏病相关的线粒体基因M^T12338C突变中的应用。通过以下步骤实现:
(1)基因组DNA的提取:运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA ；
(2)特异性PCR扩增:使用Primer5.0软件和01 igo7.0软件根据SEQ ID N0:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F#/R#、F#/I^是能扩增出包含上述原发性Leber氏病的线粒体突变位点的片段，F#/R#卜扩增出为线粒体DNA的核苷酸11929-12793，其序列为序列表中的SEQ ID N0:l、2 ;F /R肖扩增出为线粒体DNA的核苷酸12268-12488，其序列为序列表中的SEQ ID Ν0:3、4
(3)酶切鉴定:将上述PCR产物用限制性内切酶I对T12338C位点处进行酶切；
(4)突变检测:聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T12338C突变。在上述检测mtDNA T12338C突变的方法中，可从血标本(如一滴血)、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理，处理方法如下:
(1)血标本(如一滴血):取20 200μ I少量血标本(如一滴血)或Icm2的血滤纸片放入1.5ml EP管(离心管)，加入900μl红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)(三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀；
(2)带毛囊的毛发:用体积比70%乙醇洗带毛囊的毛发I次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分别放入2 4根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分；
(3)口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前，必须让被收集者漱口。以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，可视条件选 择如下方法收集唾液样本:①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0.1ml唾液直接吐进EP管内生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入EP管中将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约Icm2碎纸片置于EP管中。然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于-20°C保存备用。在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是，针对mtDNA T12338C位点存在的位置相邻近，扩增在一条片段上，故应设计3’末端与12338位点野生型T和12338位点突变型C相对应的上游引物；针对12338位点设计3’末端分别与12338位点野生型T和12338位点突变型C相对应的下游引物。(参照图2)
本发明人针对设计的特殊的引物形成限制性酶切位点进行特异性PCR扩增(图3)，mtDNA T12338C发生突变后使形成的酶切位点消失。酶切位点是由mtDNA T12338C突变形成的，其中的限制性内切酶为I，其位点处为序列表中的SEQ ID N0:3、4;
用以上设计的引物，以相应的被检测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后分别获得明亮清晰的大小约221bp的恒定扩增带，12338突变位点对应于扩增片段的第70位。在上述检测线粒体基因原发性Leber氏病突变的方法中，结合特异性PCR技术和酶切技术，每份DNA样本分别用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行普通PCR扩增，然后进行突变位点处的酶切，通过一次PCR便可在几小时内检出原发性Leber氏病相关的mtDNA T12338C 突变。理论上，基因组DNA样本经一次PCR反应，即体系中仅加入针对突变型位点T12338C引物F/R后，加入针对突变位点新形成的限制性内切酶泣_7 I进行酶切，就可进行检测。也就是说，同一基因组DNA样本经一次PCR-酶切，从而使检测结果更为准确、可信。本发明人还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成(委托生物公司)获得引物，并将引物按一定的比例混合，与提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、阳性标本对照、阴性标本对照以及使用说明书组合起来，制成了用于体外检测母系遗传原发性Leber氏病线粒体基因mtDNA T12338C突变的试剂盒，使得样本DNA提取、特异性PCR扩增和酶切可以在试剂盒提供的试剂基础上顺利完成。其中，提取样本DNA的试剂主要由细胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)组成；PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶，限制性内切酶包括限制性内切酶泣7 I。用本发明的方法及其制备的体外检测原发性Leber氏病相关的线粒体基因mtDNAT12338C突变试剂盒具有以下特点:
1.传统上获得原发性Leber氏病患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3 5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。本发明运用蛋白酶K消化裂解法，从少量的血液标本(如一滴血)、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法不仅解决了传统上从原发性Leber氏病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦；而且还解决了跨地区传递样本的问题，血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。2.目前国内外有几种线粒体相关的母系遗传性疾病基因诊断方法，如直接测序法荧光定量PCR检测方法、基因芯片检测方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较，PCR-酶切技术则结合了特异性PCR技术及酶切技术两者的优点，每份DNA样本用特异性引物即引物F/R于PCR反应管中进行特异性PCR扩增，通过一次PCR-酶切便可在几小时内同时检出mtDNA T12338C突变。另外值得一提的是，本方法所用的引物均经过仔细设计。首先，正常和突变等位基因间不同的碱基在酶切过程中对特异性限制性内切酶形成的位点不同，因而大大提高了酶切的特异性；另外由正常对照和空白对照的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，以确保结果的特异性和稳定性。3.应用本发明提供的试剂盒进行mtDNA T12338C突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室 开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行原发性Leber氏病相关的mtDNA T12338C突变的大规模筛查和预防性检查。


图1是本发明试剂盒结构示意图。图2是本发明的特异性巢式PCR引物示意图。图3是本发明的特异性巢式PCR扩增方案示意图。图4是携带T12338C突变原发性Leber氏病家系系谱图。图5是基因特异性巢式PCR扩增鉴定mtDNA T12338C的7%聚丙烯酰胺凝胶电泳图。符号说明:
图2和3中:F外为特异性巢式PCR第一次扩增的正向引物#外为特异性巢式PCR第一次扩增的反向引物，与F外配对使用；F内为特异性巢式PCR第二次扩增的正向引物，R内为特异性巢式PCR第二次扩增的反向引物，与F内配对使用；T12338C表示为线粒体DNA第12338位，野生型为T，发生基因突变后为C。图4中:□为正常男性个体；〇为正常女性个体；■为发病男性个体；籲为发病女性个体；，为先证者；I为该家系的第一代成员；II为该家系的第二代成员；111为该家系的第三代成员。图5中:Ml表示野生型位点检测的PCR扩增产物的电泳图(阴性对照者)；M2表示先证者携带T12 3 38C突变位点检测的P C R扩增产物经酶切鉴定的电泳图；M 3为携带T12338C突变的先证者的女儿；M4分别为未携带T12338C突变的先证者的丈夫，M6表示未携带T12338C突变位点检测的PCR扩增产物发生酶切的电泳图；M7阳性对照者电泳图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。实施例1 一种Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒
参见图1，本发明提供的试剂盒，由置于盒体8内的DNA提取混合液1、扩增T12338C的PCR混合液2、针对T12338C设计的一对外引物3、针对T12338C设计的一对内引物4、限制性内切酶/ / I 5、是阳性对照6和阴性对照7构成。其中提取DNA提取混合液I主要由细胞裂解液和溶液I (主要成分是蛋白酶K)组成；扩增T12338C的PCR混合液2试剂包括dNTP (脱氧单核苷酸)UOXPCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和Taq酶(DNA聚合酶)，针对T12338C设计的一对外引物3包括外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQID NO:1)，外反向引物 R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO: 2);针对 T12338C 设计的一对内引物 4 包括内前向引物 F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA (SEQ ID NO:3)，内反向引物 R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA(SEQ ID NO:4);阳性对照6是不含有线粒体序列第12338位点发生T>C突变的酶切样本，阴性对照7是含有线粒体序列第12338位点发生T>C突变的酶切样本。在上述试剂盒中，在扩增T12338C的PCR混合液2中添加用于提高延伸反应特异性的少许二甲基亚砜(0.1-0.2 μ I)。实施例2携带线粒体基因T12338C突变的原发性Leber氏病家系的检测
1.检测样本
选择I个携带T12338C突变的原发性Leber氏病家系。其家系图参见图4。这个家系呈现母系遗传，发病者均以视力损伤为唯一的临床症状，但是家系中母系成员的视力损伤程度不等。这个家系总人数为18人，其中母系成员数为12人，患Leber氏病者有2人。2.基因组DNA的提取
分别获取4名受检者的样本(包括采集I1-9,11 -10和家系外正常者的毛细血管一滴静脉血滤纸片；111 -5为由于年龄较小采集带毛囊的头发)，将血滤纸片用干净的剪刀剪成大小约lcm2的碎纸片放入1.5ml EP管(Eppendorf管)，加入900 μ I红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl,pH 7.6)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀；带毛囊的头发样本用70%乙醇洗带毛囊的毛发I次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1.5ml EP管中分 别放入2 4根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分。然后加入600 μ I细胞裂解液，混匀后再加入溶液I，使得蛋白酶K的工作浓度为20μ g/ml。充分混匀后55°C消化裂解，接着以盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于_20°C保存备用。
3.引物设计
使用Primer 5.0软件和01igo7.0软件协助设计改良引物,根据已公开的人类线粒体基因剑桥参考序列(SEQ ID N0:5)进行设计，引物的设计方案(见图3)如下:
针对mtDNA 12338位点，保证引物设计的特异性，我们设计巢式PCR两对引物F外/R夕卜，F内/R内；它们长度、退火温度相近便于实验条件稳定，以增强特异性。由此设计出的4263 位点的巢式 PCR 引物为外前向引物 F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG (SEQ ID NO:1),外反向引物 R: AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG (SEQ ID NO: 2);内前向引物 F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAATTTTGGTGCAACTCCAAATAAMGTTA (SEQ ID NO:3)，内反向引物 R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA (SEQ ID NO:4)。参见图2，在本发明的实施方案中，引物设计的指导思想是，针对mtDNA T12338C位点存在的位置相邻近，扩增在一条片段上，故应设计3’末端与12338位点野生型T和12338位点突变型C相对应的上游引物；针对12338位点设计3’末端分别与12338位点野生型T和12338位点突变型C相对应的下游引物。本发明人针对设计的特殊的引物形成限制性酶切位点进行特异性PCR扩增(图3)，mtDNA T12338C发生突变后使形成的酶切位点消失。酶切位点是由mtDNA T12338C突变形成的，其中的限制性内切酶为I，其位点处为序列表中的SEQ ID N0:3、4。用以上设计的引物，以相应的被检测样本的DNA为模板，通过PCR扩增后分别获得明亮清晰的大小约221bp的恒定扩增带，12338突变位点对应于扩增片段的第70位。

4.基因特异性巢式PCR扩增
根据上述设计的4条引物序列，通过人工合成(委托生物公司)获得2对引物，以上述提取的被检样本基因组DNA为模板，进行基因特异性巢式PCR扩增和7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳酶切鉴定。
表I基因特异性巢式PCR扩增反应体系(TAKAM公司产品)
权利要求
1.一种Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒，其特征在于，由置于盒体(8)内的DNA提取混合液(I)、扩增T12338C的PCR混合液(2)、针对T12338C设计的一对外引物(3)、针对T12338C设计的一对内引物(4)、限制性内切酶I (5 )、阳性对照(6 )和阴性对(7 )构成，其中提取DNA提取混合液(I)由细胞裂解液和溶液I组成；扩增T12338C的PCR混合液(2)试剂有脱氧单核苷酸、10XPCR缓冲液、MgCl2、三蒸水和DNA聚合酶组成，针对T12338C设计的一对外引物(3)有外前向引物F: TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG和外反向引物R:AGA AGG ATA TAA TTC CTA CG，针对T12338C设计的一对内引物(4)有内前向引物F: TTTTAAAGGATAACAGCTATCCATTGGTCTTAGGCCCCAAAAA TTTTGGTGCAACTCCAAATAAAAGTTA 和内反向引物R: GTGGGGAAGAGACTGATAATA ;阳性对照(6)是不含有线粒体序列第12338位点发生T>C突变的酶切样本，阴性对照(7)是含有线粒体序列第12338位点发生T>C突变的酶切样本，溶液I为蛋白酶K。
2.根据权利要求1所述的一种Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒，其特征在于，扩增T3866C的PCR混合液(2)中添加0.1-0.2 μ I 二甲基亚砜。
3.根据权利要求1或2所述的一种Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒在检测与Leber氏病相关的线粒体基因ND5 T12338C突变中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现: (1)基因组DNA的提取:用蛋白酶K消化裂解法，从血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中提取基因组DNA ； (2)特异性PCR扩增:使用Primer5.0软件和Oligo7.0软件根据SEQ ID N0:5所示的人类线粒体基因序列所设计的引物F#/R#、F#/I^是能扩增出包含上述原发性Leber氏病的线粒体突变位点的片段，F#/R#卜扩增出为线粒体DNA的核苷酸11929-12793，其序列为序列表中的SEQ ID N0:l、2 ;F /R肖扩增出为线粒体DNA的核苷酸12268-12488，其序列为序列表中的SEQ ID Ν0:3、4; (3)酶切鉴定:将上述PCR产物用限制性内切酶I对T12338C位点处进行酶切； (4)突变检测:聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，直接根据酶切PCR产物产生的DNA片段数量及DNA片段大小，检测mtDNA是否发生T12338C突变。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(I)所述从血标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液的样本中快速提取基因组DNA，通过以下方法获得: (1)血标本:取20 200μ I血标本或Icm2的血滤纸片放入1.5ml离心管，加入900 μ I红细胞裂解缓冲液，20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，pH 7.6，室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀； (2)带毛囊的毛发:用体积比70%乙醇洗带毛囊的毛发I次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次，在1.5ml离心管中分别放入2 4根毛发，毛囊置于离心管底部，用干净的剪刀剪去毛发闻于尚心管的部分； (3)口腔粘膜刮片或唾液:收集唾液前，必须让被收集者漱口，以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、牙膏、咖啡、烟等物质，半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液，选择如下方法收集唾液样本:①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将0.1ml唾液直接吐进离心管内；②生理盐水漱口，吐进离心管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的离心管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面，放入离心管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约Icm2碎纸片置于离心管中； 然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，利用盐析法去除蛋白杂质，异丙醇沉淀DNA，最后 用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于_20°C保存备用。
全文摘要
本发明提供一种Leber病之线粒体T12338C检测试剂盒，由置于盒体内的DNA提取混合液、扩增T12338C的PCR混合液、针对T12338C设计的一对外引物和一对内引物、限制性内切酶PsiⅠ、阳性对照和阴性对照构成。本发明从少量的血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA，既解决传统上从原发性Leber氏病患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦，又解决了跨地区传递样本的问题，提高酶切特异性，避免出现假阴性，提高检测结果的稳定性。本发明是一种快速、简便、准确、经济的检测试剂盒。可实行原发性Leber氏病相关的mtDNAT12338C突变的筛查和预防性检查。
文档编号C12Q1/68GK103173545SQ20131006933
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者冀延春, 管敏鑫, 蒋萍萍, 梁敏, 张娟娟, 徐静 申请人:浙江大学