专利名称：一株能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株。
背景技术：
植物内生菌的研究始于19世纪末,Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌[2]。目前从植物中分离的内生 菌根据其具有的独特功能可以分为:固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌[3~4]、具有抗病虫害的生防菌[5~8]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。在促进光合作用方面的内生菌报道极少，仅有在水稻上发现一种具有光合作用能力的内生菌，它也被证明是豆荚Aeschynomene[9]莖瘤中固氮菌Bredyrhizobium的一个株系。木麻黄科植物是兼有弗兰克氏菌菌(Frankia)、内生菌根菌和外生菌根菌的共生营养型植物，因此，关于木麻黄真菌学方面的研究方向目前较多涉及弗兰克氏菌(Frankia)、青枯菌(Solanasearum)、青枯假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum Smith)等，虽然木麻黄人工接种菌根菌后的促生效果已毋庸置疑，但是仅停滞于根瘤菌根菌的研究，木麻黄内生真菌方面的研究尚未见报道[1°_11]。前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从促进光合作用的根本因素去寻找内生真菌，提高其科学性和可靠性[12]。证实能促进光合作用的内生菌方面尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株。本发明提供的一株能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株，为叶点霉{Phyllosticta sp.)木麻黄根际真菌16,已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.6308。该菌的分离、纯化包括:
A、材料:将采集得到不同年份的根、枝条、鳞状叶小枝分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4°C冰箱保存；
B、消毒:70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法[13_15]；
C、接种部位的选择:鳞状叶小枝:分取植株的上、中、下三个部分的鳞状叶小枝，每个鳞状叶小枝又分为枝尖部、枝中部和枝基部3个处理；枝条:上中下分为3部位，其中第3部位为枝莖交接处；根部:分为根尖和根基2个部分；D、接种:将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28°C恒温培养箱内培养5— 7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。固体培养:使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值
6.4±0.2，培养温度为28°C，培养方式为平板培养，培养时间为48h ；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Phyllostic-ta sp.功能菌株；
其在平面培养基上，菌落呈圆形，由中心向外辐射状褶皱，中部隆起；背部褶皱，生长速度极慢。分生孢子器暗色，有孔，两面凸到球形；分生抱子梗短；分生孢子小，单孢，无色，卵圆形到长；参照真菌鉴定手册将其鉴定为叶点霉属sp.),保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.6308。上述的一种能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106cfu/ml即为成品备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。上述的一种能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地浇根。上述的一种能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株应用菌液的应用方法，是用9.0X105cfu/ml菌液，按每株IOOml在林地浇于每株木麻黄的根际。上述的一种能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液5.0X 105Cfu/ml在水培苗栽植前将苗蘸根lOmin。本发明涉及的菌株是从木麻黄植株中分离纯化得到的，目标菌株为叶点霉{Phyllosticta sp.)木麻黄根际真菌16,已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.6308。将木麻黄根际真菌16接种于木麻黄水培苗，根据光合作用的各项指标综合评判，进一步证实其对光合作用具有促进作用以及实际对木麻黄的干物质的增效作用，寻找到对促进光合作用有益的功能内生真菌可应用于生产。菌株16处理的Fm值为对照苗木的2.13倍，Fv为对照苗木的2.21倍，Fv/Fm值与对照CK相比增加了 6.24%。OPSII较对照增加了 14.10%, Rfd对照CK相比增加了 6.30%。说明了接菌处理有利于提高苗木的潜在光合能力。菌株16号处理下苗木的生物量鲜重、生物量干重、地上部分鲜重和干重、地下部分鲜重和干重都显著高于其他菌株处理下的苗木，生物量鲜重达到1.043g，为对照CK的2.34倍，生物量干重达到0.283g，为对照CK的1.66倍，地上部分与地下部分各生物量指标较对照的增幅至少达到33%以上，因此，菌株16号对木麻黄苗木的生物量促进作用很明显。`
图1为不同接菌处理下苗木Fm、Fv的比较。图2为不同接菌处理植株苗木Fv/Fm的比较。
具体实施例方式1、水培繁殖中的应用
取配制好的木麻黄根际真菌16 (菌株16)应用菌液，制成5.0X105cfu/ml菌液，在水培苗栽植前蘸根lOmin。可提高植苗成活率10%以上。2、根际土壤浇施应用
试验材料为惠安一号水培苗，苗木于2011年7月盆栽于福建农林大学森林生态研究所田间试验地。 水培苗根系长齐后，将其移入黄心壤土和沙以3:1的比例混合的土壤，并分装于约500个直径22cm，高15cm的花盆中。每盆放入相等质量的3.36KG混合土壤，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入1(Γ15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。经过一个月的恢复性生长，在木麻黄根际施入菌株浓度为9.0X 105cfu/ml的菌液100ml，重复3次，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。菌液的制备:将菌株16接入液体培养基，培养基为改良马丁培养基，每L含蛋白胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾1.0g、硫酸镁0.5g，其它为无菌水，pH值6.4±0.2。经过24h的培养，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成
1.0X 106cfu/ml至9.0X 106cfu/ml备用。接种后30天后进行光合作用等指标的测定，检测方法和结果如下:
2.1菌株浇施后木麻黄叶绿素荧光参数分析
应用 Photon Systems Instruments.(PSI)公司生产的 Handy Fluor Cam 突光成像仪在夜间19:00-22:00测定木麻黄苗木的叶绿素荧光参数，测定前先将苗木放入暗箱内，充分暗反应20min，随后将苗木放于摄像头之下，调节焦距至能看清叶片图像为止。测量的原始参数有:Fo (最小、基础或不变荧光强度等)是光系统II (PS II )反应中心所有电子均处于完全开放时的荧光产量，它与叶片的叶绿素浓度有关；Fm(最大荧光)是叶片经暗适应20min后，光系统II (PS II )反应中心处于完全关闭时的荧光产量，可反映PS II的电子传递情况；Fo':(光下最小荧光)是光适应状态下全部PS II中心都开放时的突光强度；Fm'(光下最大突光)是光适应状态下全部PS II中心都关闭时的突光强度。其它动力学参数:
X Fv/Fm= (Fm-Fo)/Fm:PS II的最大或潜在的光化学效率，反映的是PS II原初光能转化效率[19_2°]，非胁迫条件下该值变化极小，胁迫条件下该值有明显下降[21]；:2 Yield=OPSII=AFziFm' =(Fm/ -FVFm':PS II 实际光化学量子效率，反映了植物目前的实际光合效率；
5: qN=(Fv-Fv' )/Fv=1-(Fm' -Fo' )/(Fm-Fo)或 NPQ=(Fm-Fm' )/Fm' =Fm' -1:非光化学淬灭系数；
Φ Rfd=Fd/Fs= (Fm-Fs )/Fs:此比值为叶片活力指标,反映叶片光合作用活力，即叶片潜在的光合作用量子转化效率。对不同处理下各苗木的原始荧光参数(Fm、Fv)和其他动力学叶绿素荧光参数(Fv/Fm、OPSI1、Rfd和NPQ)进行单因素方差分析，以检验其变化的显著性，多重比较采用Duncan法，所有数据处理以及图表制作均采用Excel和SPSS软件处理。I不同处理水培苗Fm、Fv和Fv/Fm的值
荧光分析当中，Fm和Fv均反映着光系统II的光化学活性。最大荧光(即Fm)是光系统II (即PS II )反应中心处于完全关闭状态下的荧光产量，它既可以反映光系统II的电子传递情况，也能反映光是否受到抑制的情况(当Fm降低时)；可变荧光(即Fv)为Fm与Fo之差，反映着光系统II的电子受体一初级醌受体(即QA)的还原情况，研究发现，Fv值的变化程度反映着植物对周围环境胁迫的忍耐能力[16]。从图1中的Fm可以看出，菌株16处理的Fm值较对照CK有显著的提高，差异达到显著水平，为对照苗木的2.13倍。从图1中的Fv可以看出，菌株16号增幅较大，为对照苗木的2.21倍。荧光参数中，PS II的实际光化学效率(即Fv/Fm)是研究植物光合生理状态的重要参数，反映着植物的潜在光合能力，同时也是研究植物胁迫的重要参数，在非胁迫的环境条件下，植物的物种与生长条件对其影响不大，该参数值保持在0.75与0.85之间，一旦受到外界胁迫作用，Fv/Fm呈现明显的下降趋势，其值的减小意味着光系统II反应中心的光化学损害与光能热耗散的增加[17]。图2直观地反映了菌株16接菌方式对木麻黄苗木Fv/Fm的影响。菌株16处理的植株显著高于对照，与对照CK相比，增加了 6.24%。说明了接菌处理有利于提高苗木的潜在光合能力。2不同处理水培 苗ΦPSI1、Rfd和NPQ的值
表I不同处理下木麻黄水培苗叶绿素荧光参数的特征值
I mm§ II
； ； ；
I fmii I mmEfl_ |
j mmtmmtjj
160:94二鞭0^523=0 Q6bcdLD3-0 35 de
***
I CKI0: ^0 0 €0..492=0.02 M 1.133=0.15 |
*在表中的同一列数值中，有不同小写字母者表示差异显著(P < 0.05)
OPSII能准确反映植物当前PSII反应中心的实际光合效率状况，其值越大，光合结构电子传递能力越强，参与光化学反应的光能份额越大，越有利于提高植物的光合能力18]。由表I的参数特征值可以看出，菌株16号的OPSII较对照增加了 14.10% ;Rfd为叶片活力指标，反映叶片光合作用活力，即叶片潜在的光合作用量子转化效率，与植物光合作用成线性关系，可直观反映植物的光合作用能力，Rfd值的测定中发现，菌株16号与对照CK相比增加了 6.30%ο3不同处理对木麻黄水培苗生物量的影响
生物量是反映苗木生产力水平的重要指标，它与苗木地上与地下部分的生长发育之间有着极为密切的关系；植物的根冠比是指植物地下部分与地上部分的干重的比值，它的大小能够表征苗木对土壤养分或光照的需求与竞争能力，若根冠比值越大，则说明苗木对养分的需求和竞争能力越强，相反根冠比值越小，则说明苗木对光照的需求和竞争能力越强。用SPSS 18.0统计分析软件对木麻黄苗木的各生物量指标进行方差分析，结果表明不同处理下木麻黄苗木的各生物量指标的Sig均为0.000，即差异均达到显著水平(显著水平为
0.05)，各指标的多重比较见表2。表19不同处理对木麻黄苗木生物量的影响
权利要求
1.一株能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株，为叶点霉5/7.)木麻黄根际真菌16，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC N0.6308。
2.一种如权利要求1所述的叶点霉菌株的应用菌液，其特征在于:所述应用菌液的制备方法，是将所述的叶点霉sp.)木麻黄根际真菌16接入液体培养基,摇床振荡培养，培养温度为28°C，培养时间48 72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0X106cfu/ml，备用；液体培养基:为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH 值 6.4±0.2。
3.—种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于:所述应用菌液用于林地浇根或苗木栽植前期蘸根。·
全文摘要
本发明涉及一株能促进木麻黄光合作用的叶点霉菌株，为叶点霉(Phyllostictasp.)木麻黄根际真菌16，已于2012年6月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.6308。将木麻黄根际真菌16接种于木麻黄水培苗，根据光合作用的各项指标综合评判，进一步证实其对光合作用具有促进作用以及实际对木麻黄的干物质的增效作用，寻找到对促进光合作用有益的功能内生真菌可应用于生产。
文档编号C12R1/645GK103173363SQ20131006879
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者吴承祯, 洪伟, 谢安强, 林燕青, 林勇明 申请人:福建农林大学