一种定量菌株的固态冷冻干燥物及制备方法和使用方法与流程

本发明涉及一种定量菌株的固态冷冻干燥物及制备方法和使用方法，适用但不局限于制备符合中国药典中生物检查法要求的检验菌种。

背景技术：

本发明接种在冻干物中的接种材料一般为单种或多种微生物，例如药品、食品、化妆品、医疗器械等检验中使用到的某种菌株。所以本发明制备的冻干物可使用在多个领域中，特别是药品、食品、化妆品等领域，适用但不局限于生物检查法、灵敏度试验、无菌检查、抑菌效力检查、定量定性对照、微生物检验质量控制等。

为了更好的阐述本发明，特别的以中国药典中的生物检查法作为典型，描述本发明。

中国药典中指出：生物检查法系用于检查中国药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。无菌检查所涉及的领域十分广泛，且与人的身体健康、生命安全息息相关，是非常重要的环节。无菌检查法中涉及到的多个菌株的标准菌液的制备，其要求是：所用的菌株传代次数不超过5代；采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性；方法适用性试验时所用菌液含菌量小于100cfu。

在传统的菌液制备前，需要先购买标准菌株，该菌株的保存条件较高。然后接种各菌株至相应的固体或半固体培养基中，培养18h-48h，黑曲霉等更是需要培养5d-7d，最后稀释至每毫升含菌量小于100cfu的菌悬液，该稀释的精确度难以把控，缺点体现在以下两方面：1.稀释级别和最终吸取量都需要由稀释人员根据经验把控，但由于菌株退化或培养条件不同等原因，每次培养的菌苔活菌数偏差较大，难以做到准确；2.最终吸取的菌液含菌量需要等待计数结果出来才可以确定，而计数结果又需要数日才能确定，然而这样做，如果含菌量超出标准范围，但已经使用此稀释液完成了相关实验，实验结果肯定不符合中国药典要求且无法弥补。

如今各种生物制品层出不穷，保藏方法繁多，但效果最突出，使用最广泛，最方便工业化的还是冻干。如今冻干技术发展迅速，能满足大多冻干制品的生产。 冻干技术主要是在冻干保护剂的保护下，可将生物制品97％以上的水分除去，但尽量保持其生物活性，让其处于一种休眠状态。如果加适量恢复液，即可迅速溶解，并恢复其生物活性，用于后续实验。

在现有技术中，如需获得一定菌数含量的菌液，最主要的方法之一还是按照中国药典所述依次稀释，得到含菌量小于100cfu的菌液。这种方法既浪费资源又繁琐。

技术实现要素：

本发明将标准菌株繁殖后，稀释至确定量的菌数后，将其与保护剂融合，并冻干，冻干后同一规格含菌量一定。一方面可减少因稀释导致的时间、材料和人力上的浪费，另一方面可提高最终一定体积冻干物中菌含量的精确度。

本发明公开了一种定量菌株固态、冷冻干燥物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备GS(Gelatin Sucrose)保护剂。所述的保护剂包括4℃保存备用的A、B部分：

A部分：煮沸完全溶解于适量纯化水的明胶，煮沸完全溶解于适量纯化水的蔗糖，完全溶于适量纯化水的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、酵母粉、活性炭，将上述三者混合，调节pH值至7.2±0.2，121℃灭菌15min，4℃备用。

B部分：煮沸完全溶解于适量纯化水的葡萄糖，116℃灭菌15min，4℃备用；

步骤2：制备溶解剂。将含量分别为氯化钠0.8％-1％，磷酸氢二钾0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分装后121℃灭菌15min，制备成溶解剂，4℃备用；

步骤3：制备微生物悬液。包括接种微生物到相应的培养基上培养，培养完成后用适量溶解剂洗脱菌苔或孢子，4500rpm，离心8min，弃上清，再用步骤2中适量溶解剂溶解，重复清洗两次，最后用步骤2中溶解剂适量将菌泥溶解混匀,十倍梯度稀释至所需的稀释级；

步骤4：将步骤3中所需稀释级的菌液取适当量进行冻前计数；

步骤5：制备冻干菌悬液。结合步骤4的计数结果，步骤3中通过冻干存活率计算所需稀释级别，该稀释级的菌液与GS保护剂以一定比例混合均匀制成冻干菌悬液，该菌悬液包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明胶0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化钠0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性 炭0.2％-0.5％以及每50ul-100ul菌悬液冻干后存活菌数在100cfu-1000cfu的活菌；

步骤6：冻干成品。上述步骤5中冻干菌悬液进行制品冻干，冻干结束后，将制品在无菌环境下转移至西林瓶中，每个西林瓶中含一个单位的圆柱形冻干制品，盖上瓶塞，转移回冻干机，在200mbar真空度下，25℃干燥1h，在该真空度下进行压塞，然后放气、出箱、压铝盖。

作为进一步改进，上述的微生物包括接种于相应培养基上的细菌或/和真菌。上述的细菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌或/和生孢梭菌。上述的真菌包括黑曲霉或/和白色念珠菌。

作为进一步改进，上述的步骤4具体包括将步骤3中菌悬液在无菌环境下分装至圆柱状模具中，放入冻干机中，-40℃预冻2h，再以200mbar的真空度，-30℃干燥8h，升温至25℃继续干燥，以压升测试180sec内压升范围小于50mbar为判断点结束干燥过程，将干燥完成的制品进行冻后计数，计算得到冻干后的存活率。上述步骤6中，50ul-100ul的冻干菌悬液作为一个单位进行制品冻干。

本发明还公开了一种定量菌株的固态、冷冻干燥物，包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明胶0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化钠0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％配置成溶液构成的保护剂，所述的保护剂与菌液按所需比例均匀混合被冻干制成圆柱状的干燥物，所述的圆柱状冻干物中含有100cfu-1000cfu存活菌量。

作为进一步改进，所述的每个圆柱状冻干物由50ul-100ul冻干菌悬液冻干而成。上述的圆柱状冻干物中可定制特定范围含菌数。

本发明还公开了一种固态、冷冻干燥物依照上述方法制成定量菌株固态、冷冻干燥物的使用方法，将冻干物倒入装有N ml溶解剂的无菌容器中，溶解该制品，混合均匀，每次取N/10ml用于检测，菌含量小于100cfu，所述的溶解剂包括4℃备用氯化钠0.8％-1％，磷酸氢二钾0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分装后121℃灭菌15min制备的溶解液，所述的N为1ml-10ml。

本发明与现有技术相比较，包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明胶0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化钠0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％配制成溶液作为保护剂，与稀释后的菌悬液按一定 配比混合均匀之后利用冻干机将其制成圆柱状的干燥制品，制品外观光滑平整，溶解性佳，1-2秒内即可完全溶解于溶解剂中。其有益效果是，该圆柱状冻干物中含有100cfu-1000cfu菌量或可定制特定范围含菌数。取单个冻干物溶于N ml溶解液中，每N/10ml即含菌小于100cfu，精确方便。

保护剂的使用可以大大减小冻干过程中菌株受损程度，合适的保护剂将给制品提供一个良好的形状和冻干环境，确保菌株的活性受到最大程度的保护。溶解剂将给菌株提供良好的pH值,渗透压及适当营养物质，以保证菌株溶解后能得到最佳的复苏条件。

本发明相比较传统保护剂而言，有以下优点：

1.冻干存活率更高，达60％-90％；

2.外观更光滑美观，较易从模具上脱落；

3.冻干制品更加坚固，不易在运输过程中碎裂；

4.溶解性更佳，可在1s-2s完全溶解；

5.配制快捷简单，只需将各组分按照相应要求准确称量溶解后高温高压灭菌，灭菌一步到位。无需对有生物活性的组分另行过滤除菌，有效减少了传统保护剂繁杂的实验步骤，进一步避免了感染菌的风险。

附图说明

图1是本发明制品在标准2ml西林瓶中的示意图。

图2是本发明固态、冷冻干燥物的制备流程框图。

具体实施方式

参见图1-2，本实施案例一种定量菌株的固态、冷冻干燥物，包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明胶0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化钠0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％配置成溶液构成的保护剂，所述的保护剂与菌液按所需比例均匀混合被冻干制成圆柱状的干燥物，所述的圆柱状冻干物中含有100cfu-1000cfu存活菌量。或可定制特定范围含菌数。

每个圆柱状冻干物由50ul-100ul冻干菌悬液冻干而成，当然圆柱状冻干物中可根据需要定制特定冻干菌悬液的体积。

一种定量菌株固态、冷冻干燥物的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：制备GS(Gelatin Sucrose)保护剂。保护剂包括4℃保存备用的A、 B部分：

A部分：煮沸完全溶解于适量纯化水的明胶，煮沸完全溶解于适量纯化水的蔗糖，完全溶于适量纯化水的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化钠、酵母粉、活性炭，将上述三者混合，调节pH值至7.2±0.2，121℃灭菌15min，4℃备用。

B部分：煮沸完全溶解于适量纯化水的葡萄糖，116℃灭菌15min，4℃备用；

步骤2：制备溶解剂。将含量分别为氯化钠0.8％-1％，磷酸氢二钾0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分装后121℃灭菌15min，制备成溶解液，4℃备用；

步骤3：制备微生物悬液。包括接种微生物到相应的培养基上培养,培养好后用适量溶解剂洗脱菌苔或孢子，4500rpm，离心8min，弃上清，再用步骤2中溶解剂适量溶解重复清洗两次，最后用步骤2溶解剂适量将菌泥溶解混匀,根据需要可十倍梯度稀释至一定稀释级。为了便于计算上述的适量均可采用3ml-10ml。

步骤4：将步骤3中稀释级的菌液取适当量进行冻前计数；

步骤5：制备冻干菌悬液。结合步骤4的计数结果，步骤3中通过冻干存活率计算所需稀释级别，该稀释级的菌液与GS保护剂以一定比例混合均匀制成冻干菌悬液，该菌悬液包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明胶0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化钠0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％以及每50ul-100ul菌悬液冻干后存活菌数在100cfu-1000cfu的活菌；

步骤6：冻干成品。上述步骤5中冻干菌悬液进行制品冻干，冻干结束后，将制品在无菌环境下转移至西林瓶中，每个西林瓶中含一个单位的圆柱形冻干制品，盖上瓶塞，转移回冻干机，在200mbar真空度下，25℃干燥1h，在该真空度下进行压塞，然后放气、出箱、压铝盖。西林瓶可采用2ml的西林瓶。

定量菌株固态、冷冻干燥物使用时，需要溶解剂，溶解剂包括4℃备用氯化钠0.8％-1％，磷酸氢二钾0.5％-1％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母粉0.5％-2％的水溶液分装后121℃灭菌15min制备的溶解液。作为优选，氯化钠0.9％，磷酸氢二钾0.8％，胰蛋白胨1％，酵母粉1％。

将可为圆柱状冻干物倒入装有N ml溶解剂的无菌容器中，溶解该制品，混 合均匀，每次取N/10ml用于检测，N为1ml-10ml。菌含量小于100cfu，符合中国药典规定，每瓶可使用十次。

微生物可包括药品、食品、化妆品、医疗器械等检测所用的常规菌。本实施案例中，微生物包括接种于相应培养基上的细菌或/和真菌。上述的细菌包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌或/和生孢梭菌。上述的真菌包括黑曲霉或/和白色念珠菌。步骤4具体包括将步骤3中菌悬液在无菌环境下分装至圆柱状模具中，每个模具装量50ul，放入冻干机中，-40℃预冻2h，再以200mbar的真空度，-30℃的干燥温度干燥8h，升温至25℃继续干燥，以压升测试180sec内压升范围小于50mbar为干燥结束判断点结束干燥过程，将干燥完成的制品进行冻后计数，计算得到冻干后的存活率。上述步骤6中最终每个冻干制品中含菌量为100cfu-1000cfu。

本发明中，上述步骤3中，为了便于计算，培养完成后用5ml溶解剂洗脱菌苔或孢子，4500rpm，离心8min，弃上清，再用步骤2中5ml溶解剂溶解，重复清洗两次，最后用步骤2中5ml溶解剂将菌泥溶解混匀。用5ml来洗脱菌苔或孢子，也可以是6ml、7ml，但最终可十倍梯度稀释到一个合适梯度后，取该梯度菌液与GS保护剂以一定比例混合均匀制成冻干菌悬液，该菌悬液包括葡萄糖0.1％-0.5％、蔗糖5％-10％、明胶0.5％-1.5％、胰蛋白胨1％-2％、大豆蛋白胨0.5％-1％、氯化钠0.5％-1％、酵母粉0.2％-0.5％和活性炭0.2％-0.5％以及每50ul-100ul菌悬液冻干后存活菌数在100cfu-1000cfu的活菌。

本实施案例中以5ml溶解剂且稀释液与保护剂比例为1：4为例，用5ml溶解剂洗脱菌苔或孢子，离心清洗后，得到洗净的5ml菌液，取0.5ml该菌液，加入至4.5ml溶解剂中混匀，为十倍梯度稀释，本次记10-¹稀释液，取0.5ml 10-¹稀释液加入至4.5ml溶解剂中，混匀，记10-²稀释液，如此依次稀释至10-¹⁰，取10-⁵、10-⁶、10-⁷、10-⁸、10-⁹、10-¹⁰，10-⁵之前的稀释液含菌量一般较高，不予考虑计数，各取0.1ml稀释液滴在已灭菌的平板上，用20ml该菌适宜生长的固体培养基(40℃左右液体状态)倾注在平板上，轻摇混匀，即倾注法计数，每个稀释级计两块平板。假如10-⁷的稀释液计数结果是两块平板长菌分别为80和78个，可估计该稀释级别含菌量为7.9*10²cfu/ml，则10-⁵稀释液含菌量为7.9*10⁴cfu/ml，取10-⁵稀释液1ml与4ml GS保护剂混匀，计算得该混合液冻干 前每50ul含菌量为790cfu。每个模具中滴加50ul该混合液，冻干。冻干后用1.1ml溶解剂溶解该冻干制品，取0.1ml稀释液滴在已灭菌的平板上，用20ml该菌适宜生长的固体培养基(40℃左右液体状态)倾注在平板上，轻摇混匀。假如计数结果是两块平板长菌分别为69和71个，可估计冻干后为每50ul含菌量为700cfu，存活率为700/790*100％＝88.6％。计算出合理的稀释倍数是为了使冻干后每颗制品含菌量为100cfu-1000cfu。

合适的稀释倍数可以反推得到，如冻后要求每颗制品含菌量为500cfu，经过实验测得该菌在保护剂保护下存活率为80％，那么稀释液与保护剂混合液冻干前每50ul含菌量应为500/80％＝625cfu，推算每5ml(即5000ul)混合液冻干前总含菌量为625cfu*100＝6.25*10⁴cfu，而稀释液和保护剂比例为1:4，所以5ml混合液中有1ml为稀释液，活菌都来自于这1ml稀释液，所以合适的稀释梯度的稀释液中含菌量为6.25*10⁴cfu/ml，根据要求每颗冻干制品含菌量为100cfu-1000cfu，所以与保护剂混合的合适的稀释液含菌量范围为：1.25*10⁴cfu/ml-1.25*10⁵cfu/ml，具体要根据存活率来计算，不同冻干机即使使用同一冻干曲线，冻干存活率也有很大别差，但使用同一台冻干机，同一冻干曲线来冻干制品，则冻干存活率偏差很小。

本实施案例中，为了便于计算，冻干前稀释菌液和保护剂以1:4的比例为例,即每1ml稀释液配比4ml保护剂，则保护剂为每1000ml中的A、B部分包括:

A部分：煮沸完全溶解于适量纯化水的6.25g-18.75g明胶，煮沸完全溶解于适量纯化水的62.5g-125g蔗糖，完全溶于适量纯化水的12.5g-25g胰蛋白胨、6.25g-12.5g大豆蛋白胨、6.25g-12.5g氯化钠、2.5g-6.25g酵母粉、2.5g-6.25g活性炭，将上述三者混合，调节pH值至7.2±0.2，121℃灭菌15min，4℃备用；

B部分：煮沸完全溶解于适量纯化水的1.25g-6.25g葡萄糖，116℃灭菌15min，4℃备用。

其中A部分可定容为900ml，B部分可定容为100ml，当然A、B部分可任意定容只要满足每保护剂1000ml中，能完全溶解上述A、B中相应的组分。

本发明定量菌株固态、冷冻干燥物稳定性检测如下：

定量菌株固态、冷冻干燥物保存在-20℃条件下，每隔一个月进行计数。结果见下表一、二、三，计数结果单位：cfu/50ul

表一

表二

表三

从上表可明确看出，本发明制品在-20℃低温保存条件下一年内有较高的存活率，均在90％以上，可以较好地保持制品中所含菌株的活力，保证制品质量。