一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。所述菌株为土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因得到得到重组土曲霉。通过基因工程改造构建带有顺乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAt1-cad-TtrpC的质粒，将其插入土曲霉中催化顺乌头酸得到过表达顺乌头酸脱羧酶得到重组土曲霉。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株。
【专利说明】一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。
技术背景
[0002]衣康酸是一种重要的化工产品，被美国能源部认为是十二个重要高附加值化学品之一，主要用于腈纶化纤、树脂、橡胶、涂料、造纸、医药、农药、轻工、食品、丝绸等领域。目前国内外所有深层发酵生产衣康酸的工厂都采用土曲霉。如图1所示，在土曲霉中衣康酸的代谢途径是由三羧酸循环分流出来的，三羧酸循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)的催化作用下脱羧形成衣康酸(Kanamasa, S.,Dwiartij L.，Okabej Μ.，Park E.Y., Cloning andfunctional characterization ofthe cis-aconitic acid decarboxylase (CAD)gene from Aspergillus terreus.App1.Microbiol.Biotechnol.，2008，80，223-229)。Li等对土曲霉在高产和低产衣康酸两种条件下的基因转录差异进行了比较分析，发现翻译成顺乌头酸脱羧酶的cad基因在高产衣康酸条件下的转录水平显著提高(Li，A.，van Luijkj N.，Beekj Μ.，Caspers, Μ.，Punt, P.，van der Werfj Μ., A clone—basedtranscriptomics approach for the identification ofgenes relevantfor itaconic acid production in Aspergillus.Fungal Genet.Biol.,2011，48，602-611)，这一实验结果表明，顺乌头酸脱羧酶是衣康酸生物合成途径中的一个关键酶，在土曲霉中提闻cad基因的表达水平将有助于提闻衣康酸的发酵广量。
[0003]关于通过基因工程提高衣康酸发酵产量的研究至今仅有两篇报道。Tevz等通过在土曲霉A156中过量表达6-磷酸果糖激酶突变体解除了针对磷酸果糖激酶的反馈抑制，强化了糖酵解途径，把衣康酸的产量提高了大约2倍，同时发酵周期缩短(Tev，G.，Bencina5M., Legisa，Μ.，Enhancing itaconic acid production by Aspergillus terreus.App1.Microbiol.Biotechnol.，2010，87，1657-1664) ；Lin 等通过在土曲霉 NRRL1960 中过量表达透明颤菌血红蛋白，提高了菌株对低氧的耐受性，并把衣康酸的发酵产量提高了 17% (Lin, Y.H., Li, Y.F., Huang, M.C., Tsai, Y.C., Intracellular expression ofVitreoscilla hemoglobin inAspergillus terreus to alleviate effect of a shortbreak in aerationduirng culture,Biotechnol.Lett.,2004,26, 1067 1072)。但是，关于通过在土曲霉中过表达顺乌头酸脱羧酶提高衣康酸发酵产量的研究，至今未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]一种提高衣康酸发酵产量的菌株，所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAtl-cad-TtrpC得到的重组土曲霉。
[0007]提高衣康酸发酵产量的菌株的构建方法，通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉。
[0008]利用提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉，过表达顺乌头酸脱羧酶来加强催化顺乌头酸生成衣康酸的反应过程，进而提高衣康酸产量。
[0009]所述顺乌头酸脱羧酶表达盒由土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因、土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子组成。将所述重组土曲霉培养于发酵培养基中，所述发酵培养基为:140g L—1 葡萄糖，2g L-1 NH4NO3,0.2g L^i(NH4)2HPO4, 20mg L-1FeSO470.4g L-1 MgSO4^Omgr1 ZnSO4,40mg L-1 CuSO4 和水，用硫酸调整 pH 至 3.5，115°C灭菌 IOrnin0
[0010]本发明所具有的优点:本发明提供的基因工程改造土曲霉以提高衣康酸发酵产量的方法，相较于传统的物理、化学等诱变方式，本发明方法目的明确，可操作性强，便于筛选。本发明提供重组菌株的衣康酸发酵产量普遍高于出发菌株，其中产量最高的菌株C27比出发菌株提高了约7g/L (9.5%)，具有很强的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本发明【背景技术】中提到的土曲霉产衣康酸代谢途径图。
[0012]图2为本发明实施例提供的载体PSGF957质粒图谱，hph-casette为潮霉素抗性元件；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pmgpd为红曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。
[0013]图3为本发明实施例提供的载体pJJL-2质粒图谱，其中PgpdAtl为土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。
[0014]图4为本发明实施例提供的载体pXH-1质粒图谱，PgpdAtl为土曲霉甘油醛_3_磷酸脱氢酶启动子JtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子。
[0015]图5为本发明实施例提供的载体pXH-3质粒图谱，PgpdAtI为土曲霉甘油醛_3_磷酸脱氢酶启动子JtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子，cad为顺乌头酸脱羧酶脱羧酶基因。
[0016]图6为本发明实施例提供的载体pXH-4质粒图谱，PgpdAtI为土曲霉甘油醛_3_磷酸脱氢酶启动子JtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；hph为潮霉素磷酸转移酶基因，该质粒含有能在土曲霉中过表达hph基因，从而赋予宿主菌潮霉素抗性。
[0017]图7为本发明实施例提供的重组土曲霉菌株摇瓶发酵产衣康酸能力的比较效果图，WT为出发菌株CICC40205。
[0018]图8为本发明实施例提供的HPLC分析菌株发酵液中衣康酸的纯度。a:衣康酸标准品；b:出发菌株CICC40205的发酵液；c:重组菌株C27的发酵液；d:重组菌株C5的发酵液。
[0019]图9为本发明实施例提供的PCR分析部分重组菌株中cad基因表达盒的整合情况。M:200bp DNA maker ;1:重组菌株C5;2:重组菌株C12;3:重组菌株C25;4:重组菌株C27;5:重组菌株C28;6:重组菌株C38;7:pXH-3 (阳性对照);8:出发菌株CICC40205 (阴性对照)。
【具体实施方式】
[0020]载体(vector)是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状DNA分子。
[0021]启动子(promoter)定义为一种结合RNA聚合酶并指导聚合酶到达编码序列的正确的转录起始位点从而起始转录的DNA序列。RNA聚合酶能有效的催化与编码区适当DNA链互补的信息RNA的装配。启动子还可以理解为包括用于转录mRNA后用于翻译5’非编码区(介于启动子和转录起始位点之间)，cis-作用转录调控元件，如增强子和能与转录因子相互作用的其他核酸序列。
[0022]“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数=相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)X100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算:在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行:例如，Smith 和 Waterman (Smith, T.F.andffaterman, M.S., Comparison of biosequences, Adv.App1.Math., 1981, 2, 482-489)的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch (NeedlemanS.B.andWunsch C.D., A general method applicable to the search forsimilaritiesin the amino acid sequence of two proteins, J.Mol.Biol., 1970, 48, 443-453.)的同源性比对算法；Pearson 和 Lipman (Pearson W.R.，Lipman D.J.，Improved toolsfor biological sequence comparison, Proc.Natl.Acad.Sc1.，1988，85，2444-2452.)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA);或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995 增干丨J)。
[0023]以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0024]本发明中质粒提取釆用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是釆用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是釆用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01 )。土曲霉CICC40205菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0025]实施例1 土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因cad表达盒的构建
[0026]1.1表达载体pXH-1的构建
[0027]以 TtrpC-F(5，-cagacatgtagatctaagcttgcggccgcacttaacgttactgaaatc_3，)和TtrpC-R(5，-gtcgtgccagtcgactctaga-3，)为引物对，以质粒 pSGF957 (由 Seoul Nationaluniversity 得到，构建质粒图谱如图 2，Kimj J.G.，Choij Y.D.，Changj Y.J.，Kimj S.U.，Genetictransformation of Monascus purpureus DSMl379， Biotechnology Letters，2003，25，1509 - 1514)为模板进行 PCR 扩增 TtrpC 片段，产物经 Pci KFermentasj CatalogN0.:#ER1871)和Xba I酶切并纯化。pJJL_2是将PgpdAtl启动子片段克隆在pMD18_simple载体上(Takara，Catalog N0.:D103A)，然后通过定点突变除去pMD18_simple质粒上的PciI酶切位点所获得(质粒图谱参见图3)，其具体构建方法参照中国专利:一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的启动子及其应用(申请号201210116163.7)。用Pci I和Xba I对质粒pJJL-2进行酶切，回收载体片段。将回收的pJJL_2片段和TtrpC片段经T4连接酶连接得到质粒pXH-1 (参见图4)。
[0028]1.2 土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因的克隆
[0029]本发明所使用的土曲霉CICC40205菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的信息设计引物cad-Fl (5’ -gcattccatgaccaaacaatctgcggacagc-3，)和 cad-Rl (5， -ggcggatccttataccagtggcgatttcacgg-3，)，以土曲霉CICC40205的cDNA为模板扩增土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测长度约为1500bp的条带为目的产物，目的条带产物经割胶回收纯化后TA克隆至pMD18_T载体(TaKaRa，Catalog N0.:D101A)中，测序后得到质粒pXH_2。测序结果显示克隆的DNA条带为土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因，核苷酸序列为SEQ ID N0.1，对应的氨基酸序列为SEQ ID N0.2。与已完成基因组测序的土曲霉NIH2624菌株的基因ATEG—09971相比较，同源性为96%，与Kanamasa等人克隆的cad基因(GenBank:AB326105.1)的同源性为 100% (Kanamasa, S.，Dwiartij L，Okabej M.，Park E.Y.，Cloning andfunctionalcharacterization of the cis-aconitic acid decarboxylase (CAD)gene fromAspergillus terreus.App1.Microbiol.Biotechnol.，2008，80，223-229)。
[0030]SEQ ID N0.1:
[0031]
【权利要求】
1.一种提高衣康酸发酵产量的菌株，其特征在于:所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAtl-Cad-TtrpC得到的重组土曲霉。
2.—种权利要求1所述的提高衣康酸发酵产量的菌株的构建方法，其特征在于:通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉。
3.一种权利要求1所述的利用提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，其特征在于:通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉，过表达顺乌头酸脱羧酶来加强催化顺乌头酸生成衣康酸的反应过程，进而提高衣康酸产量。
4.按权利要求3所述的利用提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，其特征在于:所述顺乌头酸脱羧酶表达盒由土曲霉顺乌头酸脱羧酶基因、土曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子组成。
5.按权利要求3所述的利用提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，其特征在于:将所述重组土曲霉培养于发酵培养基中，所述发酵培养基为=HOgL-1葡萄糖，2g L-1NH4NO3,0.2g L-1 (NH4)2HPO4, 20mg L-1 FeSO4,0.4g L-1 MgSO4,40mg L-1 ZnSO4,40mg L-1 CuSO4和水，用硫酸调整pH至3.5，115°C灭菌IOmin0
【文档编号】C12R1/66GK103834582SQ201210477312
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年11月22日 优先权日:2012年11月22日
【发明者】李建军, 黄雪年, 吕雪峰, 李悦明, 张希铭, 李霞 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 青岛科海生物有限公司