一株嗜松篮状菌菌株Li?93及其应用
【专利摘要】本发明提供了一株嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li?93，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11765。本发明还提供一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的制品，该制品的活性成分为嗜松篮状菌Li?93。本发明还提供一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法。利用上述制品和方法制备GAMG时，具有产物单一，无副产物生成的特点，在常规条件下制备GAMG得率为96％左右，高于现有水平，因此本发明为制备GAMG提供了一种简单有效的产品及方法。CGMCC No.1176520151130
【专利说明】
-株嗜松篮状菌菌株Li -93及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一株产0-葡萄糖醒酸巧酶的嗜松篮状菌菌株 及其应用。
【背景技术】
[0002] 甘草酸（Gly巧rrhizin，化）是甘草（Gly巧rrhiza uralensis)的主要有效成分之 一，是一种=祗皂巧类化合物，可作为天然的甜味剂，具有消炎、抗癌，抗肿瘤、保肝护肝及 增强细胞免疫调节的功效，此外还具有良好的美白作用，结合其消炎的功能，能起到润肤和 清除自由基等多种功效，因此也被广泛应用于化妆品领域。但是由于甘草酸极性较强，不易 透过细胞膜进入细胞内发挥药理作用，不仅限制其功能的发挥，也造成药物的浪费。单葡萄 糖醒酸基甘草次酸(Gly巧；rrhetinic acid monoglucuronide，GAMG)是甘草酸最外侧糖巧 键裂解后，水解去除一分子葡萄糖醒酸后生成的产物，在保留甘草酸功效的同时因其具有 极性适中，易于透过细胞膜，生物利用度高，且具有更高的甜度，更好的生物安全性等优点 被认为是甘草酸良好的替代品。
[0003] 全细胞催化是指利用完整的生物机体作为催化剂进行底物催化与转化，其本质是 利用细胞中的酶进行催化，但是相比于酶催化法，免去了酶的提取与纯化过程，制备更简 单，生产成本更低。本领域生产GAMG的方法有很多种，其中利用微生物细胞催化底物转化是 一种有效的手段。发明专利申请20 141 0088328 . 3利用分离到的一株产紫青霉 Penicilliumpu巧urogenum Li-3,经固定化细胞处理后可连续转化生产GAMG，采用不同处 理条件，制备GAMG的得率分别为8.5 %、16.9 %和34%。但是，如此低的得率对后续提取和纯 化GAMG产生负担，而且造成底物的浪费，难W满足低成本，规模化的生产要求。因此，本领域 亟需筛选一种用于制备GAMG且产率高的新菌株。
【发明内容】
[0004] 本发明基于本领域上述不足和需求，提供一株分离所得的嗜松篮状菌菌株 (Tala;romycespinophilun〇Li-93,该菌株可用于制备 GAMG，且 GAMG 产率较高。
[0005] 本发明的技术方案如下：
[0006] 一株嗜松篮状菌（Talaromyces pinophilum)菌株Li-93,其保藏编号为：CGMCC No.11765。
[0007] 用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包 括所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[000引用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分是 所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[0009] 所述制品还包括用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的常规成分和/或用于培养所 述的嗜松篮状菌菌株Li-93的培养基成分。
[0010] -种制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品的制备方法，其特征在于，采用所述的 嗜松篮状菌菌株Li-93作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或
[0011] 在标有制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有所述的嗜松篮状菌 菌株Li-93。
[0012] -种制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制备单葡萄糖醒酸基 甘草次酸的过程中添加和/或使用所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[0013] 用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包 括所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[0014] 用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分是 所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[0015] 所述菌剂，还包括用于制备菌剂的常规成分。
[0016] 所述的嗜松篮状菌菌株Li-93在制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸方面的应用。
[0017] 本发明从新疆甘草种植地±壤中分离到一株丝状真菌，经ITS测序、序列比对、菌 落及菌体形态学鉴定，确定该菌株为一株嗜松篮状菌(Talaromyces pino地ilus)，其被命 名为嗜松篮状菌Li-93。
[0018] 本发明对上述嗜松篮状菌Li-93在制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸(GAMG)的效果方 面进行了验证，发现:该菌可定向将甘草酸或其盐转化生成GAMG，而无副产物GA的生成，在 常规条件下制备GAMG得率为96 %左右，高于现有技术水平。
[0019]由此可见，本发明提供的嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilus)菌株Li-93能较 为高效地制备GAMG,且该菌生长条件要求不高、获取容易、成本低廉，为本领域制备GAMG提 供了一种简单有效的产品和方法。
[0020] 所述嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93已送保藏，其保藏信息如 下：
[0021] 菌种保藏名称:Li-93
[0022] 保藏号:CGMCC No. 11765
[0023] 分类命名:嗜松篮状菌
[0024] 拉下名：Talaromyces pino地il皿
[0025] 保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、
[0026] 保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0027] 保藏日期:2015年11月30日
【附图说明】
[002引图1是嗜松篮状菌(Talaromyces pino地il皿化i-93光学显微镜图；
[0029] 图2是嗜松篮状菌转化甘草酸单锭盐生成单葡萄糖醒酸基干草次酸(GAMG)的高效 液相色谱分析图，1:甘草次酸(GA)的标准品；2 :GAMG的标准品；3:转化前;4转化后。
【具体实施方式】：
[0030] 下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，W下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常 规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 实施例1中用到的新疆甘草种植地±壤采集自中国新疆塔城额敏县甘草种植地。
[0032] 实施例中用到的甘草酸单锭盐的纯度为75%，均购自新疆天山制药厂。
[0033] W下实施例中用到的培养基分述如下：
[0034] 筛选平板：甘草酸单锭盐3g/L，NaN〇3 3g/L，K2HP〇4 lg/L，KCl lg/L，MgS〇4 ? 7此0 0.5g/L，化2S04?7出0 0.01g/L，pH5.0，琼脂30g/L。
[0035] 查氏酵母膏琼脂培养基（CYA):化N03 3g/L，K2HP〇4 lg/L，MgS〇4 ? 7出0 0.5g/L，KCl 0.5g/L，FeS04 ? 7出0 O.Olg/L，薦糖20g/L，酵母粉提取物5g/L，琼脂20g/L，自然pH。
[0036] 麦芽汁琼脂培养基(MEA):麦芽提取物20g/L，葡萄糖20g/L，多聚蛋白腺Ig/L，琼脂 20g/L，自然抑。
[0037] 燕麦琼脂培养基(0A)制备方法如下：
[003引取30g燕麦加水至1000血，煮沸1小时后纱布过滤，取滤液加水补足至lOOOmL，加入 20g琼脂，121°C高溫灭菌20min。
[0039] 马铃馨葡萄糖液(固）体培养基制备方法如下：
[0040] 称取去皮马铃馨200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，向滤液中加入20g 葡萄糖、溶解后补足水至lOOOmL，若是需要制成固体培养基，则向其中再添加20g琼脂，自然 抑，121°C高溫灭菌15min。
[0041 ]二级种子培养基：去皮马铃馨200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，取滤 液补足水至1000血后从中取出250血，加入8g葡萄糖，溶解后，加水至1000血，自然抑，121°C 高溫灭菌15min。
[0042] 发酵培养基的制备方法如下：
[0043] 取去皮马铃馨200g，加水800mL，煮沸30分钟左右，纱布过滤，取滤液补足水至 lOOOmL后从中取出200mL，加水至lOOOmUpH 5.0，12rC高溫灭菌15min。
[0044] 本发明中GMG的产率定义为：
[0045]
[0046] 实施例1:嗜松篮状菌Li-93的筛选与鉴定
[0047] 采集新疆甘草种植地±壤10旨，置于lOOmL无菌0.8%化C1溶液中，充分振荡lOmin， 无菌滤纸过滤，取滤液分别稀释1〇1、1〇2、1〇3、1〇4倍，将各个稀释液涂布于筛选平板上，于28 °C培养。每24h观察平板是否长出新的菌落，将新长的菌落进一步划线分离W获得纯种菌 株。从中分离到一株丝状真菌，命名Li-93。
[004引对该菌株Li-93的ITS序列进行测序，结果见SEQ ID No. 1所示。将序列进行BALST 比对，发现该菌与hlaromyces pinophilus NBRClOOSSSTjalaromyces pinophilus NRRL 58691 和hlaromyces pino地ilum NRRL 6420的TIS序列具有99%?上的同源性。
[0049] 将该菌抱子分别接于查氏酵母膏琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、燕麦琼脂培养 基，30°C培养5-7天，观察该菌在各种培养基上生长形成的菌落形态。
[0050] 结果显示:在查氏酵母膏琼脂培养基上于28°C培养7天后，菌落直径约为30mm，菌 丝呈绒状、黄色，质地致密，菌落边缘为白色，距离中屯、点约7mm处形成一圈凹槽，并W此圈 凹槽为起点，向外形成1-5条福射状凹糟，背面为澄红色。在麦芽汁琼脂培养基上于28°C培 养7天后，菌落直径约为40mm，菌丝呈厚绒状、质地相对疏松、颜色从外向内依次为白色、黄 色和深绿色，中间形成约12mm直径的圆形凸起，背面为澄红色。在燕麦琼脂培养基上于28°C 培养7天后，菌落直径约为40mm，菌丝呈絮状，质地疏松，边缘为白色，中间为深绿色，背面无 色或局部呈淡澄色。
[0051] 显微镜下观察:菌丝有隔膜，顶端生有扫靑状的分生抱子头，直立分生抱子梗上有 双轮生小梗、对称型，分生抱子呈串排列在小梗顶端、呈球形或近球形，如图1所示。
[0052] 根据W上结果，鉴定筛选所得菌株为嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilus)，被 命名为Li-93。同时将该菌株Li-93送保藏，并作为本发明请求保护的菌株，其保藏号为 CGMCC No.11765。
[0053] 实施例2、采用本发明所述嗜松篮状菌菌株Li-93制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸
[0054] 将嗜松篮状菌Li-93接于斜面马铃馨葡萄糖固体培养基上，于3(TC培养3天。取斜 面上的抱子接种至马铃馨葡萄糖液体培养基上，于3(TC、200rpm的摇床上培养4她，然后W 体积比5%的接种量接于二级种子培养基中，30°C、200rpm的摇床上培养24h，得到二级种子 液。将二级种子液，W体积比10%的接种量接于发酵培养基中，30°C、200rpm摇床上培养12h 后，向其中加入甘草酸单锭盐使其终浓度达到5g/L，于30°C、200rpm摇床上反应。每化取样， 采用高效液相色谱检测甘草酸单锭盐的消耗量和GAMG的生成量，结果显示2地后，甘草酸单 锭盐转化完毕，GAMG再无明显增加，如图2所示。经计算，GAMG的产率达到96.31 %。
[0055] 实施例3、本发明所述用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品
[0056] 本实施例提供一种用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，该制品的活性成分 包括实施例1分离得到的嗜松篮状菌菌株Li-93;和/或，
[0057] 该制品的活性成分是实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[0058] 基于本实施例的所述用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的制品，还包括用于制备 单葡萄糖醒酸基甘草次酸的常规成分和/或用于培养所述的嗜松篮状菌菌株Li-93的培养 基成分。
[0059] 本实施例还提供上述制品的制备方法，包括如下步骤:采用实施例1所述的嗜松篮 状菌菌株Li-93作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或
[0060] 在标有制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有实施例1所述的嗜松 篮状菌菌株Li-93。
[0061 ]实施例4、本发明所述用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌剂
[0062] 本实施例提供一种用于制备单葡萄糖醒酸基甘草次酸的菌剂，特征是，所述菌剂 的活性成分包括实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93;和/或
[0063] 所述菌剂的活性成分是实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
[0064] 所述菌剂还包括用于制备菌剂的常规成分。
【主权项】
1. 一株嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li_93,其保藏编号为:CGMCC No: 11765〇2. 用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分包括 权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。3. 用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，所述制品的活性成分是权 利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。4. 根据权利要求2或3所述的制品，其特征在于，所述制品还包括用于制备单葡萄糖醛 酸基甘草次酸的常规成分和/或用于培养所述的嗜松篮状菌菌株Li-93的培养基成分。5. -种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制备方法，其特征在于，采用权利要求1 所述的嗜松篮状菌菌株Li-93作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或， 在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有权利要求1所述的嗜松篮 状菌菌株Li-93。6. -种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制备单葡萄糖醛酸基甘 草次酸的过程中添加和/或使用权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。7. 用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括 权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。8. 用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分是权 利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。9. 根据权利要求7或8的菌剂，其特征在于，还包括用于制备菌剂的常规成分。10. 权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸方面的应 用。
【文档编号】C12N1/14GK106047713SQ201610245351
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】李春, 徐赢华, 贾锦彤, 冯旭东, 吕波
【申请人】北京理工大学, 南京精微生物科技有限公司