一株吡啶降解菌株A6及其生产的菌剂和应用的制作方法

本发明涉及环境污染微生物修复，具体涉及一株吡啶降解菌株A6及其生产的菌剂和应用。

背景技术：

工业化快速阶段导致大批量使用各种各样的人工合成化学物质，被认为是异生物质，导致环境污染。目前工业生产每天都产生和排放大量的芳香族化合物,这其中大约有2/3都是杂环化合物。杂环化合物被广泛应用于工业溶剂、染料、炸药、医药及农药等领域。吡啶就是其中一种典型的含氮杂环化合物。吡啶，含氮杂环化合物，可以看做苯分子中的一个(CH)被N取代的化合物，故又称氮苯，无色或微黄色液体，有恶臭。吡啶及其同系物存在于骨焦油、煤焦油、煤气、页岩油、石油中。吡啶广泛用于化工、医药工业以及农药生产等行业，具有毒性大、致畸性、致癌性强和难生物降解等特点。

异生化合物的生物降解被认为是具有挑战性的任务之一。而作为异生化合物的典型代表吡啶，由于水溶性和扩散性都较好，已成为土壤和废水中常见的污染物，生物降解是解决该类问题的有效方法。生物降解和物理化学降解有很大不同，它是一个自然的过程，是微生物利用有机污染物质进行生长和自身的生理代谢过程。利用从环境中筛选的降解微生物能够有效去除环境中杂环和苯环类等污染物质。

吡啶对人体能产生损伤，它具有强烈刺激性，浓度较低时，可麻醉中枢神经系统，同度较高时，轻者有欣快或窒息感，继之出现抑郁、肌无力、呕吐等症状，重者意识丧失、大小便失禁、强直性痉挛、血压下降、误服可致死。长期吸入出现头晕、头痛、失眠、步态不稳及消化道功能紊乱，可发生肝肾损害，还可引起皮炎。据相关研究显示，吡啶对男性损伤极大，长期接触会影响精子活性进而导致男性不育症。

国内外关于吡啶降解菌的研究已屡见不鲜。主要集中在2个方面:1、代谢途径,学者们根据对不同细菌或真菌在不同条件下(好氧、厌氧)的研究,提出了多种微生物降解吡啶途径。2、生物强化去除作用,直接向废水处理系统中投加吡啶高效降解菌株或固定化这些菌株细胞来实现污染物的去除。自20世纪70年代，学者陆陆续续分离到一些吡啶降解菌，其中大部分是细菌，如假单胞菌属、脂肪杆菌属、芽孢杆菌属、无色杆菌属、黄杆菌属、混沌红球菌属、节杆菌属等。也有放线菌和真菌，如白腐真菌。但用于实际生物修复有高成效的鲜有出现，本发明 希望分离和鉴定到高效吡啶降解菌的，探寻高效降解菌的种属关系，为吡啶污染土壤的生物修复提供理论支持。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，发明提供一株吡啶降解菌株A6，用于降解土壤或水体环境中残留的吡啶；本发明的另一目的是提供该吡啶降解菌生产的菌剂；该菌株制备的降解菌剂可在短时间内使土壤或水体环境中残留的吡啶降解。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株吡啶降解菌株A6，经鉴定为放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCC NO:M 2016592。该菌株是发明人从安徽省皖北药业股份有限公司的药厂废水生化处理池的活性污泥中分离到的。降解菌株A6主要生物学特性为：革兰氏阴性菌，在含3000mg/L的吡啶LB固体培养基上培养2-3天后，A6菌落呈圆形，边缘整齐，呈透明至淡黄色。

本发明所述的菌株A6在降解吡啶中的应用。

作为优选，所述菌株A6在降解土壤或水体环境中吡啶的应用。

本发明所述的菌株A6在生产吡啶降解菌剂中的应用。

一种利用上述菌株A6生产的降解菌剂。

所述的降解菌剂，通过以下步骤所制成：

1)将降解菌株A6培养到对数期的试管液按0.5-1.5％体积比的接种量接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按5-10％体积比的接种量接种入种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；

3)将种子液按8-10％体积比的接种量接入生产罐的培养基中培养；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:(0.8-1.5)，搅拌速度为180-250rpm，培养温度为25-32℃，全流程培养时间为36-48小时，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。

上述的降解菌剂在降解吡啶中的应用。

作为优选，所述降解菌剂在降解土壤或水体环境中吡啶的应用。

本发明试剂和仪器：

吡啶Pyridine(上海展云化学公司)，含量≥99.5％

甘油glycerinum(医药集团上海化学试剂公司)，含量≥99.9％

蛋白胨Peptone(安琪生物公司)

酵母膏Yeast extract(安琪生物公司)

盐NaCl(安琪生物公司)

硫酸铵(NH₄)₂SO₄(上海德川生物试剂公司)

磷酸二氢钾KH₂PO₄(上海德川生物试剂公司)

磷酸氢二钾K₂HPO₄(上海德川生物试剂公司)

七水硫酸镁MgSO₄·7H₂O(上海华臣生物公司)

琼脂(安琪生物公司)

Agar A(安琪生物公司)

超净工作台(上海汇佳生物仪器)

恒温培养箱HZQ-X100(哈尔滨东联电子技术开发公司)

立式压力蒸汽灭菌器LDZX-50FBS(哈尔滨东联电子技术开发公司)

台式高速离心机(上海金鹏分析仪器有限公司)

PCR仪(BIO-RAD Laboratories-Segrate(Milan)Italy)

凝胶成像分析仪(BIO-RAD Laboratories-Segrate(Milan)Italy)

分光光度计UV-2100(上海第三分析仪器厂)

微量紫外分光光度计UV-1700(岛津)

培养基和培养条件：

固体基础盐培养基中加入大约1.5％琼脂，121℃高压灭菌30min。

固体LB培养基中加入大约1.5％琼脂，121℃高压灭菌30min。

做特性检测时，用LB培养基，需要测试盐浓度对菌生长的影响时，控制NaCl的量，需要测试pH时，则加入HCl或者NaOH调节酸碱度。

发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2-7.5。

有益效果：由现有技术相比较，本发明经分离筛选获得吡啶降解菌株A6(Rhizobium radiobacter A6)，用于降解土壤或水体环境中残留的吡啶；该菌株制备的降解菌剂能降解吡啶，本菌剂可在短时间内使土壤残留的吡啶的降解率达95％以上，使高浓度的吡啶废水中吡啶降解率达98％以上，解决残留吡啶对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

本发明的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理土壤和水体环境中吡啶的污染；本发明对于保护生态环境，保护人体的身体健康具有重要的意义。

附图说明

图1为菌株A6 3天降解吡啶的紫外图谱；

图2为菌株A6菌落照片；

图3为菌株A6的系统进化树；

图4为菌株A6不同盐浓度下的生长图谱；

图5为菌株A6不同pH下的生长图谱；

图6为菌株A6不同温度下的生长图谱。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

菌株A6的分离和鉴定：

用来富集吡啶降解菌株的富集基质取自安徽省皖北药业股份有限公司的药厂废水生化处理池的活性污泥，取活性污泥5.0g加入基础盐培养基中，加入50mg·L^-1的吡啶，30℃，150rpm培养7d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次，梯度稀释富集液，取10^-4-10^-7稀释度的富集液各0.1mL涂布于加有100mg·L^-1吡啶的固体基础盐培养基平板上，30℃培养3d后，挑取长出的单菌落接种于含200mg·L^-1吡啶基础盐培养基中，30℃，180rpm培养3d，验证其降解菌液的降解效果。

含吡啶的基础盐培养基中吡啶的降解与否，可通过观察培养液由澄清变混浊的现象进行初步判断。

降解效果的验证方法：采用UV-1700微量紫外分光光度计测定吡啶的质量浓度。往待测降解菌液中加入等量体积的二氯甲烷，剧烈振荡5-10min，然后静置直到水相和有机相完全分层，吸取上层水相，保留有机相，上层水相再一次用等体积的二氯甲烷萃取，两次得到的有机相经无水硫酸钠去除残留的水分 后，于紫外-可见分光光度计上在波长200-350nm范围内进行扫描。通过吡啶在200nm-350nm处的特征吸收峰峰值的高低来判断降解液中吡啶浓度的高低。

从富集液中，分离到1株吡啶降解菌，命名为A6，该菌在3d内对5000mg·L^-1的吡啶的降解紫外图谱，如图1所示。其中处理为在基础盐培养基中加入终浓度为5000mg·L^-1的吡啶，按1％体积比的接种量接入对数期的菌株A6菌液，对照为在基础盐培养基中加入终浓度为5000mg·L^-1的吡啶，按1％体积比的接种量接种灭活的对数期的菌株A6菌液，结果表明，加入菌株A6的处理3d内对5000mg·L^-1吡啶的降解率达到98％以上。

菌株A6在固体LB培养基上生长3d后，A6菌落呈圆形，边缘整齐，呈透明至淡黄色，如图2所示。

以菌株A6的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1348bp的16S rDNA基因序列，如SEQ ID No：1所示。在EzTaxon数据库(www.ezbiocloud.net)中进行Blast，结果表明菌株A6与根瘤菌(Rhizobium)菌株的同源性最近，与模式菌株与Rhizobium radiobacter ATCC 19358^T(AJ389904)的同源性达到99.7％，建立系统发育树如图3所示，结合形态和生理生化特征，将菌株a6初步鉴定为放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)，命名为放射根瘤菌A6(Rhizobium radiobacter A6)。将该菌株A6送交位于中国武汉，中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏时间为2016年10月24日，保藏编号为CCTCC NO:M 2016592。

实施例2

不同盐浓度菌株A6生长量的分析：

取5支洁净试管分别加入2mL LB培养液，以盐浓度0％、1％、2％、3％、4％，探究不同盐浓度对吡啶降解菌A6的生长影响。培养条件为30℃、150r/min恒温摇床振荡培养，培养24h后用分光光度计测定在600nm时培养液的光密度。结果如图4所示，当盐浓度在0-1％时A6可以生长，在此范围内增加盐浓度对菌的生长影响很小，并且在1％时达到最高峰。但随着盐浓度的进一步提高，A6生长均呈现下降趋势.当盐浓度达到4％时没有菌生长。

不同pH菌株A6生长量的分析：

取7支洁净试管分别加入2mL LB培养液，调节其pH使其分成4、5、6、7、8、9、10七个梯度以探究不同pH对吡啶降解菌A6的生长影响，培养条件为30℃、150r/min恒温摇床培养，培养24h后用分光光度计测定在600nm时培养液的光密度。结果如图5所示，A6在pH为6-9之间长势较好，在pH为7时略有降低，但A6总体趋势从6-8均呈现上升趋势，在pH为8时达到峰值，当pH继续提高 时，菌生长呈减弱趋势，当pH到达10时，基本没有菌的生长。

不同温度菌株A6生长量的分析：

取5支洁净试管分别加入2ml LB培养液，以15℃、20℃、30℃、37℃、42℃的探究不同温度对吡啶降解菌A6的生长影响，培养条件为30℃、150r/min，上述不同温度摇床振荡培养，培养24h后用分光光度计测定在600nm时培养液的光密度。结果如图6所示，A6在温度为30-37℃之间生长旺盛，尤其30℃附近生长到达顶峰，从20℃之后两种菌生长均呈现上升趋势，从30℃之后呈下滑趋势，到达42℃已无菌生长。

实施例3

菌株A6的降解菌剂的制备

1)将降解菌株A6培养到对数期的试管液按0.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按5％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种入装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养，培养至对数生长期，制得种子液；

3)将种子液按9％(v/v，以培养基体积为基准，下同)的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养。

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.5，搅拌速度为250rpm，培养温度为25℃，整个工艺流程培养时间为36小时，发酵结束后菌体数量达到10亿/mL以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶分装成液体剂。

实施例4

菌株A6的降解菌剂的制备

1)将降解菌株A6培养到对数期的试管液按1.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按8％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种入装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养，培养至对数生长期，制得种子液；

3)将种子液按8％(v/v，以培养基体积为基准，下同)的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养。

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8，搅拌速度为180rpm，培养温度为32℃，整个工艺流程培养时间为48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿/mL以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶分装成液体 剂。

实施例5

菌株A6的降解菌剂的制备

1)将降解菌株A6培养到对数期的试管液按1％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按10％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种入装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养，培养至对数生长期，制得种子液；

3)将种子液按10％(v/v，以培养基体积为基准，下同)的接种量接入装液量为70％的生产罐的培养基中培养。

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为220rpm，培养温度为30℃，整个工艺流程培养时间为42小时，发酵结束后菌体数量达到10亿/mL以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶分装成液体剂。

试验例1

菌株A6降解菌剂对土壤中吡啶的降解试验：

采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，取一定量的吡啶溶于水中，将其均匀拌入1000g土壤中，使土壤中吡啶终浓度均为3000mg·kg^-1，准备9份相同的土样，将实施例3、4、和5制备的菌株A6降解菌剂，以5％的接种量(体积/重量)分别接入到上述1000g土壤中，每个做三个平行实验，于30℃恒温黑暗培养箱中培养，设不接菌的相同土壤作为对照，期间土壤的持水量保持在60％，培养5天后，利用高效液相色谱测定残留量。测定结果为实施例3、4和5的降解菌剂在5天内对土壤中吡啶降解率分别达到96.4％、98.6％、99.5％。

试验例2

菌株A6降解菌剂对废水中吡啶的降解试验：

采取药厂废水生化处理池中含有吡啶的废水作为试样，废水中的吡啶终浓度均为5000mg·L^-1。将废水分成9份，每份废水为5L,将实施例3、4、和5制备的菌株A6降解菌剂，以5％的接种量(体积比)分别接入到上述5L废水中，每个做三个平行实验，于常温黑暗培养，设不接菌剂的相同废水作为对照，培养5天后，利用高效液相色谱测定残留量。测定结果为实施例3、4和5的降解菌剂在5天内对废水中吡啶降解率分别达到98.5％、98.2％、99.3％。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一株吡啶降解菌株A6及其生产的菌剂和应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1348

<212> DNA

<213> 根瘤菌属（Rhizobium radiobacter）

<400> 1

gtcgaacgcc ccgcaagggg agtggcagac gggtgagtaa cgcgtgggaa catacccttt 60

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