内生真菌菌株ycef199及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种内生真菌菌株YCEF199，以及其在促进植物生长和降低烟草吸收重金属方面的用途，属于微生物及微生物应用领域。一种内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF199，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC?NO:M2013596，保藏时间2013年11月24日。本发明所述内生真菌菌株Pyrenochaetasp.YCEF199对烟草具有明显的促进生长作用，或增加植株的生物量，简称促生作用。
【专利说明】内生真菌菌株YCEF199及其用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种内生真菌菌株YCEF199，以及其在促进植物生长和降低烟草吸收重金属方面的用途，属于微生物及微生物应用领域。
【背景技术】
[0002]吸烟与健康是国内外广泛关注的热点问题，降低烟草制品有害成分是烟草行业科技发展的焦点。烟叶和烟气中的重金属是最重要的有害成分之一，另外烟草病害也严重影响烟草产量和烤烟品质。而烟草农业对烟叶有害成分和烟叶品质具有重要影响，利用农业生物技术进行调控，尽量减少烟叶有害成分的本底含量，以达到降低烟草制品对人类健康危害的目的。
[0003]烟草中含有多种重金属元素，如砷、镉、铅、汞等，在抽吸过程中，这些重金属可通过主流烟气进入人体，对人体造成潜在的危害。烟草是对镉转移能力极强的作物，烟草中镉含量比其生长的土壤高出许多倍，镉在成熟烟株的不同叶位含量几乎相当，而在根中最低，烟叶中镉的积累量占总吸收量的79-96%。
[0004]内生真菌(endophytic fungi)即至少生活史的一部分能侵染定殖在健康植物组织中，宿主无明显病症的一类真菌(Petrini，1991 ;Wilson，1995)，与菌根真菌只存在于植物根系不同，内生真菌在植株的地下和地上部分的任何组织器官都能存在(Faeth &Fagan, 2002)。内生真菌广泛存在于植物组织内，不受外界环境的影响，对植物生长发育、抵抗病虫害等具有广泛的生物学作用，同时在一些植物及农作物的广泛应用具有重要意义。随着环境问题的持续恶化，植物资源经受着严峻的考验，而内生真菌对植物的影响是多方面的，已经成为当今国内外研究的热点问题之一。在农业生产、生态保护、中药资源开发、医药卫生的发展都有重要的现实意义。近年来，人们发现在植物体存在有益的内生细菌和内生真菌，内源性菌株对植物病害的防治作用及生物开发应用已引起科学家的广泛关注。植物内生真菌主要分布于植物的种子、花、茎、叶和根系中，与植物的关系是互惠共生的，而且植物内生真菌可以提供光合产物及矿物质，内生真菌代谢产物能够刺激寄主植物的生长发育，提高寄主植物的生物应激和非生物胁迫抗性能力，即两者之间存在物质与能量的循环交流,植物内生真菌对寄主植物的积极地促生效应,部分是通过植物内生真菌分泌的活性物质或者次级代谢产物对植物的生长作用的结果。目前研究较多的是根瘤共生体和菌根共生体，内生真菌与植物的共生体是高等植物与微生物共生关系的又一种表现形式。
[0005]内生真菌与植物的互作研究已日益受到研究者的关注，并成为内生真菌研究领域的国际热点。烟草作为我国重要的经济作物，在国民经济中占据着不可替代的地位，烟草产量和品质的提高，是烟草产业健康发展的基础。通过研究内生真菌与烟草的互作关系，对研究内生真菌与烟草的共生体系具有重大意义。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种内生真菌菌株/7JreflocAaeiasp.YCEF199及其用途。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明提供一种内生真菌菌株Pyrenochaetasv.YCEF199，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC Ν0:Μ 2013596，保藏时间 2013 年 11 月 24 日。
[0008]内生真菌菌株YCEF199的特征为:该菌株生长速度较慢，在PDA上25°C暗培养7天的菌落直径为4cm ；PDA培养上初期白色，成熟培养物呈橄榄色或灰色，菌落质地较为坚硬；气生菌丝稠密，菌丝有隔，无色，直径约1.3-1.6 um。分生孢子器、分生孢子均未见。
[0009]菌株/sp.YCEF199来源于烟草的内生真菌，属于真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,座囊菌纲Dothideomycetes,格孢腔菌目Pleosporales,格孢腔菌科Pleosporaceae,棘壳抱属 Pyrenochaeta。
[0010]内生真菌菌株YCEF199的内转录间隔区核糖体DNA的全序列如SEQ ID NO:1所
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[0011]本发明还提供上述内生真菌菌株/7JreflocAaeiasp.YCEFl99的用途:促进植物生长或增加生物量。
[0012]本发明所述的促进植物的生长或增加生物量包括烟草。
[0013]本发明所述内生真菌菌株/YCEF199对烟草具有明显的促进生长作用，或增加植株的生物量，简称促生作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为Pyrenochaetas1Q.YCEF199在PDA培养基上的菌落形态。
[0015]图2为Pyrenochaetasp.YCEF199与云烟87共培养两周的照片，与对照相比，Pyrenochaeiasp.YCEF199具有明显的促生作用。
[0016]图为Pyrenochaeta邠.YCEF199移入盆栽的生长2个月的照片，与对照相比，Pyrenochaetas^.YCEF199具有明显的促进植物生长作用或增加生物量。
[0017]生物保藏声明
内生真菌菌株/7JreflocAaeiasp.YCEF199,保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC Ν0:Μ 2013596，保藏时间2013年11月24曰。
【具体实施方式】
[0018]参照上述附图，对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。
[0019]备注说明:下述所有的培养基使用前均需要按照常规方式进行高温高压的灭菌处理(121°C、0.24 MPa、20 分钟)。
[0020]实施例1、内生真菌菌株YCEF199分离获得
2%麦芽汁琼脂培养基(malt extract agar, MEA):在麦芽浸出粉20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000 mL ;然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121°C下灭菌20min)。
[0021]马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar, PDA):在马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g中加蒸馏水定容至1000 mL ;然后进行常规的高温灭菌(1.1个大气压，121°C下灭菌 20min)。
[0022]以云南烟草品种园区采集TenneSSee86 (美国白肋烟栽培种)为植物材料，将采集的烟草用自来水漂洗干净，烟草根茎在75% (v/v)酒精溶液中消毒30秒，然后在1% (v/v)次氯酸钠溶液中消毒10分种，无菌水漂洗3次。用无菌刀片将根切成约0.6cm长的片段，置于含50μ8.πι1-1氨苄青霉素和50μ8.πι1-1链霉素的2%麦芽汁琼脂培养基(MEA)平皿上，25°C暗培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA培养基；分离得到菌落，25°C暗培养，在PDA培养基上连续三次接种，确认为单菌落，没有其他真菌或者细菌共同生长，认为是获得纯培养，命名为YCEF199。
[0023]菌株编号为/YCEF199,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC NO:M 2013596，保藏时间2013年11月24曰。[0024]实施例2、内生真菌菌株YCEF199的形态鉴定
本发明的/7JT洲ocAaeiasp.YCEF199 (即/YCEF199 CCTCC NO:M2013596)具有如下特性-.Pyrenochaeta邓.YCEF199在PDA培养基上的形态如图1所示。该内生真菌在PDA培养基上的适宜生长温度为25°C，具有以下特征:该菌株属于真菌界Fungi,子囊菌门 Ascomycota,座囊菌纲 Dothideomycetes,格抱腔菌目 Pleosporales,格抱腔菌科Pleosporaceae,棘壳孢属。该菌株生长速度较慢，在PDA上养?天的菌落直径为4cm ；PDA培养上初期白色，成熟培养物呈橄榄色或灰色，菌落质地较为坚硬；气生菌丝稠密，菌丝有隔，无色，直径约1.3-1.6 um。分生孢子器、分生孢子均未见。
[0025]实施例3、内生真菌菌株YCEF199的分子鉴定
用真菌基因的快速提取法提取DNA。采用ITS扩增的通用引物ITS-4( ‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ )和 ITSl (5，-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ )进行 PCR扩增，PCR 扩增反应采用 50ul 的反应体系:ddH2039.5ul、10*PCR Buffer (withMg2+) 5ul、lOmmol/L dNTP 0.4ul、20 μ mol/L Primer-F 0.8ul、20 μ mol/L Primer-R 0.5ul、DNA 模板3ul、5U/ul Taq聚合酶0.8ul。PCR体系为:PCR反应条件为:94°C预变性4min，94°C变性30s，59°C退火40s，72°C延伸608，35个循环后，721:延伸IOmin0反应结束后用1.0%琼脂糖凝胶分析扩增产物。PCR产物回收后经上海生工生物工程有限公司测序，得到其ITS序列，内生真菌菌株YCEF199的内转录间隔区核糖体DNA的全序列如SEQ ID NO:1所示。测序结果在GenBank数据库中进行同源序列搜索以进一步确定其分类地位。
[0026]实施例4、内生真菌菌株/YCEF199对植物的促生作用
MS培养基(IL):硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650 mg/L，硫酸镁370 mg/L，磷酸二氢钾170 mg/L,氯化钙440 mg/L,硫酸猛22.3 mg/L,硫酸锌8.6 mg/L,硼酸6.2 mg/L,碘化钾
0.83 mg/L，钥酸钠 0.25 mg/L，硫酸铜 0.025 mg/L，氯化钴 0.025 mg/L，硫酸亚铁 27.8 mg/L，Na2EDTA37.3 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，盐酸吡哆醇0.5 mg/L，烟酸
0.5 mg/L,肌醇 100 mg/L，30g 鹿糖，琼脂粉 8g，H2O 定容至 IL ;pH 值 5.8。
[0027](I)选择烟草品种云烟87的种子，无菌水浸泡48h后，搓种2(T30min。种子用70%的酒精灭菌lmin，2% (质量％)的次氯酸钠灭菌lOmin，无菌水冲洗5飞次后点在MS培养基上，于25°C、16h光照80 μ mm-2sec-l与22°C、8h黑暗交替下萌发两周(约长至4片叶)，备用。[0028](2)挑选大小一致烟草苗用于同供试菌株的共培养。将长至4片叶的烟草幼苗转移至10*10 (厘米)的方形1/2MS培养基上(3株/皿)，为保持烟草的良好长势，将茎叶部分的培养基去掉，根部舒展在1/2MS培养基上。挑取培养一周左右的内生真菌菌丝,置于烟草苗根部下方Icm左右进行共培养。空白对照不接菌丝，平皿封口后置于25°C、16h光照80ymm-2sec-l与22°C、8h黑暗的条件下培养两周左右。备注说明:1/2 MS培养基即为大量元素(硝酸钾、硝酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙)减半，其余元素含量不变的MS培养基。
[0029](3)共培养两周后，供试菌株表现出良好的促生效果(如图2所示)。将烟草苗从平皿中取出，叶片和根部分开，分别置于1.5ml的离心管中，烘箱中烘干，精密天平称重统计。
[0030]
【权利要求】
1.内生真菌iFyrenochaetasi1.)菌株YCEF199,其特征是:该菌株的保藏名称为:Pyrenochaeta^.YCEF199，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学；保藏日期:2013年11月24日，保藏编号:CCTCC NO:M 2013596。
2.根据权利要求1所述的内生真菌菌株YCEF199的用途，其特征在于:该用途用于促进烟草生长或增加生物量。
【文档编号】C12R1/645GK103834579SQ201410071743
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】徐清泉, 章初龙, 林福呈, 刘宏玉, 冯晓晓, 夏琛, 程昌合, 金慧清, 刘化冰, 张晓兵, 何文苗, 慕继瑞 申请人:浙江中烟工业有限责任公司