利用pspG基因缺失菌株通过发酵生产L‑氨基酸的方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，特别涉及一种通过发酵生产l-氨基酸的方法。
背景技术：
：在工业上，目前l-氨基酸的生产方法主要为生物发酵法，即通过具有l-氨基酸生产能力的各种微生物的发酵来生产l-氨基酸，因此具有l-氨基酸生产能力菌株的获得是l氨基酸生产方法的核心。目前获得l氨基酸生产菌株的方法主要有两种，一种是通过对野生型微生物(野生型菌株)进行诱变的方法，使其具有营养缺陷，并使其对某些代谢物产生拮抗作用，从而获得优良的工业生产菌株。近年来随着基因工程技术的发展，重组dna技术已经开始普遍应用于微生物代谢工程改造方面，使其成为另外一种重要的获得l-氨基酸生产菌株的方法。比如，通过提高目标产品合成途径中关键酶的表达，来达到提高微生物l-氨基酸生产能力(cn1305002a)；再比如，通过提高目标产品的分泌蛋白的表达，来达到提高微生物l-氨基酸生产能力(cn1260393a)；或者，通过降低某些基因的表达，来达到提高微生物l-氨基酸生产能力(cn1607246a)；在或者，通过敲除某些基因，使其失活，来达到提高微生物l-氨基酸生产能力(cn1466630a)。pspg的表达产物是一个内膜蛋白，表达受到西格玛(54)-rna聚合酶的调控，并受到噬菌体休克蛋白pspf的激活作用和噬菌体休克蛋白pspa的抑制作用。相关研究表明其过表达会造成细胞的移动性能变慢。目前，对于其对于l氨基酸合成是否有影响还没有相关的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种利用pspg基因缺失菌株通过发酵生产l-氨基酸的方法，以提高l-氨基酸产量和转化率。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种利用pspg基因缺失菌株通过发酵生产l-氨基酸的方法，通过在培养基中培养属于肠杆菌科，并具有l-氨基酸生产能力的细菌，该细菌于培养前进行了修饰，使得pspg基因缺失，并从细菌的培养基或细胞收集l-氨基酸，来生产l-氨基酸。进一步的，采用pspg基因缺失的菌株atcc21151δpspg，通过发酵的方法生产得到l-苏氨酸。所述pspg基因缺失的菌株atcc21151δpspg通过下述方法构建得到：首先，制备菌株atcc21151的感受态细胞；利用质粒pkd46进行转化，获得atcc21151/pkd46菌株；然后，利用基因片段pspgknock1转化atcc21151/pkd46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg1-f/pspg1-r进行验证，验证正确的菌株命名为atcc21151δpspg::sacbcm；最后，利用基因片段pspgknock2转化atcc21151δpspg::sacbcm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg2-f/pspg2-r进行验证，验证正确的菌株命名为atcc21151δpspg，至此l-苏氨酸生产所用的pspg基因缺失的菌株atcc21151δpspg构建完毕。进一步的，采用pspg基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg，通过发酵的方法生产得到l-赖氨酸。所述pspg基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg通过下述方法构建得到：首先，制备菌株atcc21151的感受态细胞；利用质粒pkd46进行转化，获得mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株；然后，利用基因片段pspgknock2转化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg2-f/pspg2-r进行验证，验证正确的菌株命名为mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg::sacbcm；最后，利用基因片段pspgknock2转化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg::sacbcm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg2-f/pspg2-r进行验证，验证正确的菌株命名为mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg，至此l-赖氨酸生产所用的pspg基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg构建完毕。所述菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*通过下述方法构建得到：利用多片段重组的方法构建以低拷贝质粒pwsk29为出发载体，包含dapa基因表达框和lysc基因表达框的质粒pwsk-lysc-dapa；以质粒pwsk-lysc-dapa为基础构建dapa和lysc突变体过表达质粒，得到质粒pwsk-lysc*-dapa*；将质粒pwsk-lysc*-dapa*电转化至大肠杆菌mg1655；获得的菌株命名为mg1655/pwsk-lysc*-dapa*。有益效果：本发明提供的方法，采用pspg基因缺失的大肠杆菌菌株，通过发酵的方法生产得到l-氨基酸，并通过一些列的试验验证，pspg基因的缺失，其功能或者其相关序列的缺失，对于l-氨基酸发酵有利，有助于氨基酸产量和转化率的的提升。附图说明图1为基因片段pspgknock1的构建过程示意图；图2为基因片段pspgknock2的构建过程示意图；图3为基因质粒pwsk-lysc-dapa的构建过程示意图。具体实施方式本发明实施例所用的l-苏氨酸生产菌株为大肠杆菌atcc21151，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(atcc)。本发明实施例所用的l-赖氨酸生产菌株为大肠杆菌mg1655(atcc47076)，来源于美国典型微生物菌株菌种保藏中心(atcc)。dna聚合酶购自北京全式金公司的fastpfu；限制性内切酶及dna连接酶等均购自fermentas公司；酵母粉和蛋白胨购自英国oxoid公司产品；琼脂粉和抗生素购自北京索来宝；葡萄糖、硫酸铵等常用化学试剂均购自国药。质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自上海生工，多片段重组试剂盒(multisonestepcloningkit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；xl-ⅱ定点突变试剂盒购自天津博鑫生物科技有限公司，相关操作均严格按照说明书执行；质粒构建测序验证和基因缺失测序工作由华大基因完成；dh5α感受态细胞购自北京全式金公司。lb培养基成分：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，固体培养基中添加2％的琼脂粉。抗生素浓度为：氨苄青霉素100ug/ml，卡那霉素30ug/ml，氯霉素15ug/ml。l-苏氨酸和l-赖氨酸检测方法：通过安捷伦液相仪，利用zorbaxeclipseaaa(氨基酸分析)色谱柱对发酵液中的l-赖氨酸和l-苏氨酸进行分析，相关操作均严格按照说明书执行。葡萄糖分析方法采用山东科学院生产的sba-40d生物传感分析仪进行检测。实施例1pspg敲除片段的构建大肠杆菌基因敲除采用经典的red重组方法，因此需要有进行重组的基因片段。相关基因片段构建方法如下：首先，根据ncbi公布的大肠杆菌mg1655的基因组序列设计引物pspgup1-f/pspgup1-r和pspgdown1-f/pspgdown1-r，见表1，以大肠杆菌mg1655基因组为模板pcr扩增得到pspg基因上下游个600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中seqidno.19及seqidno.20所示，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，63℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒ploi4162基因序列，设计引物sacbcm-f/sacbcm-r，见表1，以质粒ploi4162为模板，pcr扩增氯霉素(cm)和蔗糖致死基因(sacb)基因序列，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2min，循环30次；根据质粒puc18基因序列，设计引物puc1-f/puc1-r，见表,1，扩增线性puc18基因片段，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。利用multisonestepcloningkit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除pspg基因的基因片段的载体，具体构建过程见图1。经华大基因公司测序正确后，质粒命名为pspg1。根据质粒pspg1基因序列，设计引物pspg1-f/pspg1-r，以质粒pspg1为模板pcr扩增第一次pspg基因敲除的基因片段pspgknock1，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，58℃20s，72℃3min，循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行pspg基因第一轮敲除。然后，根据ncbi公布的大肠杆菌mg1655的基因组序列设计引物pspgup2-f/pspgup2-r和pspgdown2-f/pspgdown2-r，见表1，以大肠杆菌mg1655基因组为模板pcr扩增得到pspg基因上下游各600-700bp的同源臂基因片段，序列如序列表中seqidno.19及seqidno.20所示，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，62℃20s，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；根据质粒puc18基因序列，设计引物puc2-f/puc2-r，见表1，扩增线性puc18基因片段，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，57℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。利用multisonestepcloningkit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建可用于扩增敲除pspg基因的基因片段的载体，具体构建过程见图2。经华大基因公司测序正确后，质粒命名为pspg2。根据质粒pspg2基因序列，设计引物pspg2-f/pspg2-r，以质粒pspg2为模板pcr扩增第二次pspg基因敲除的基因片段pspgknock2，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，55℃20s，72℃3min，循环30次。获得基因片段通过凝胶电泳回收，用于进行pspg基因第二轮敲除。表1引物实施例2l-赖氨酸生产菌株构建利用大肠埃希氏菌mg1655菌株(atcc47076)来构建一株可以生产l-赖氨酸的菌株。具体方法如下。1.过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapa)和天冬氨酸激酶iii(lysc)基因质粒构建利用多片段重组的方法构建了以低拷贝质粒pwsk29为出发载体，包含dapa基因表达框和lysc基因表达框的质粒。具体方法如下所述：首先，根据ncbi公布的大肠杆菌mg1655的基因组序列设计引物lysc-f/lysc-r和dapa-f/dapa-f，见表2，以大肠杆菌mg1655基因组为模板pcr扩增得到带有自身启动子的dapa和lysc基因片段，序列如序列表中seqidno.22及seqidno.23所示，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，65℃20s，72℃2min，循环30次；72℃延伸10min。根据质粒pwsk29基因序列，设计引物pwsk-f/pwsk-r，扩增线性pwsk29基因片段，pcr扩增参数为98℃2min；98℃20s，60℃20s，72℃3min，循环30次；72℃延伸10min。获得基因片段通过凝胶电泳回收。然后，利用multisonestepcloningkit对上述获得片段进行连接，具体方法参见试剂盒说明。构建过表达二氢吡啶二羧酸合酶(dapa)和天冬氨酸激酶iii(lysc)基因质粒pwsk-lysc-dapa，具体构建过程见图3。经华大基因公司测序正确后进行下一步试验。2.dapa和lysc突变体过表达质粒的构建野生型的dapa基因和lysc基因是受到l-赖氨酸的反馈抑制的，因此为了解除l-赖氨酸对其的反馈抑制，增加其在细胞内的酶活力，对其进行了点突变，以pwsk-lysc-dapa为基础构建了dapa和lysc突变体过表达质粒。具体方法如下所述。首先，设计利用stratagene系列xl-ⅱ定点突变试剂盒，通过引物lysct352if/lysct352ir(见表2)对质粒pwsk-lysc-dapa进行pcr引入突变位点，获得的质粒基因片段经过pcr产物回收，除去pcr体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后，采用dpni酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒dna，处理后的质粒转入感受态细胞tran10(购自北京全式金生物技术有限公司)，经测序验证，所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysc*-dapa，携带的lysc突变体核苷酸序列如序列表中seqidno.24所示。然后，设计利用stratagene系列xl-ⅱ定点突变试剂盒，通过引物dapae84t-f/dapae84t-r(见表2)对质粒pwsk-lysc*-dapa进行pcr引入突变位点，获得的质粒基因片段经过pcr产物回收，除去pcr体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后，采用dpni酶37摄氏度酶切1h除去甲基化的模板质粒dna，处理后的质粒转入感受态细胞tran10，经测序验证，所获得的正确突变质粒命名为pwsk-lysc*-dapa*，携带的dapa突变体核苷酸序列如序列表中seqidno.25所示。3.l-赖氨酸生产菌株shg01的构建及发酵验证将前面构建好的质粒pwsk-lysc*-dapa*电转化至大肠杆菌mg1655；获得的菌株命名为mg1655/pwsk-lysc*-dapa*。然后，对其进行l-赖氨酸发酵能力的验证。发酵培养基如下：葡萄糖40g/l，硫酸铵10g/l，磷酸0.6ml/l，氯化钾0.8g/l，甜菜碱0.4g/l，硫酸镁1.2g/l，硫酸锰0.03g/l，硫酸亚铁0.03g/l，玉米浆有机氮0.4g/l，5％消泡剂0.5ml/l，苏氨酸0.2g/l，卡那霉素50ug/ml。利用500ml装入30ml发酵培养基的三角瓶进行发酵实验，接种2mllb过夜培养的菌液，在37℃、200rpm条件下发酵。利用稀释的氨水控制ph6.8，发酵32h。菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*发酵32h后，l-赖氨酸产量为4.7g/l。表2引物名称序列pwsk-fgctgcctgtagttctgacgaagcataaagtgtaaagcctggggtgccpwsk-rgcgctagcgcaggttgcagcacatccccctttcgclysc-fggatgtgctgcaacctgcgctagcgcaggcclysc-rggagaagagttcacgtttattatataaagacgctggttaacagagtacaggctcgdapa-fctctgttaaccagcgtctttatataataaacgtgaactcttctcccagcdapa-rccaggctttacactttatgcttcgtcagaactacaggcagcglysct352i-fgtggcattaatccttgataccaccggttcaacctccactglysct352i-rgtatcaaggattaatgccacgctcacttctgacgtggtgadapae84t-fcgctaacgctactgcgaccgccattagcctgacgdapae84t-rcgtcaggctaatggcggtcgcagtagcgttagcg实施例3pspg基因缺失菌株构建1.l-苏氨酸生产菌株atcc21151δpspg基因缺失突变株构建l-苏氨酸生产菌株atcc21151基因敲除方法采用经典的red重组方法，参考相关文献进行。具体操作过程如下：首先，制备菌株atcc21151的感受态细胞，具体感受态细胞制备和转化过程参考j.萨姆布鲁克(sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》；利用质粒pkd46进行转化，获得atcc21151/pkd46菌株；然后，利用基因片段pspgknock1转化atcc21151/pkd46菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg1-f/pspg1-r进行验证，验证正确的菌株命名为atcc21151δpspg::sacbcm。最后，利用基因片段pspgknock2转化atcc21151δpspg::sacbcm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg2-f/pspg2-r进行验证，验证正确的菌株命名为atcc21151δpspg，至此l-苏氨酸生产菌株atcc21151δpspg基因缺失突变株构建完毕。2.l-赖氨酸生产菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg基因缺失突变株构建l-赖氨酸生产菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*基因敲除方法采用经典的red重组方法，参考相关文献进行。具体操作过程如下：首先，制备菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*的感受态细胞，具体感受态细胞制备和转化过程参考j.萨姆布鲁克(sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》；利用质粒pkd46进行转化，获得mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株；然后，利用基因片段pspgknock2转化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*(pkd46)菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg2-f/pspg2-r进行验证，验证正确的菌株命名为mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg::sacbcm。最后，利用基因片段pspgknock2转化mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg::sacbcm菌株的感受态细胞，获得的转化子利用引物pspg2-f/pspg2-r进行验证，验证正确的菌株命名为mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg，至此l-赖氨酸生产菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg基因缺失突变株构建完毕。实施例4pspg基因缺失对l-苏氨酸发酵的影响为了验证pspg基因缺失对于l-苏氨酸发酵的影响，利用摇瓶发酵的方法对菌株atcc21151和菌株atcc21151δpspg进行发酵验证，具体过程如下：发酵培养基如下表3所示：表3将上述l-苏氨酸生产菌株单菌落分别接种5mllb液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照初始od为0.2转接装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶，37℃，220rpm培养32h，检测l-苏氨酸的浓度。菌株最终产量结果如表4所示，对照菌株atcc21151中l-苏氨酸产量为5.3g/l，pspg基因缺失的菌株atcc21151δpspg中l-苏氨酸产量为6.2g/l，比出发菌株提高了17.0％，表明在大肠杆菌中部分或全部缺失pspg内膜蛋白能够提高l-苏氨酸的产量。表4菌株l-苏氨酸g/latcc211515.3atcc21151δpspg6.2实施例5pspg基因缺失对l-赖氨酸发酵的影响为了验证pspg基因缺失对于l-赖氨酸发酵的影响，利用摇瓶发酵的方法对菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*和菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg进行发酵验证，具体过程如下：发酵培养基如下表5所示：表5成分浓度g/l葡萄糖50硫酸铵8磷酸二氢钾3七水合硫酸镁1.5酵母粉4七水合硫酸亚铁0.03一水合硫酸亚锰0.03将上述l-赖氨酸生产菌株单菌落分别接种5ml含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃，220rpm培养12h。按照10％的接种量转接装有20ml发酵培养基的500ml三角瓶，37℃，220rpm培养36h，检测l-赖氨酸的浓度。菌株最终产量结果如表6所示，对照菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*中l-赖氨酸产量为4.5g/l，pspg基因缺失的菌株mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg中l-赖氨酸产量为6.0g/l，比出发菌株提高了27.7％，表明在大肠杆菌中部分或全部pspg内膜蛋白能够提高l-赖氨酸的产量。表6菌株l-赖氨酸g/lmg1655/pwsk-lysc*-dapa*4.7mg1655/pwsk-lysc*-dapa*δpspg6.0以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>徐州工程学院<120>利用pspg基因缺失菌株通过发酵生产l-氨基酸的方法<130>2017<160>35<210>1<211>34<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc1-f<400>1gccacgcgcccgccgggtaccgagctcgaattcg34<210>2<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc1-r<400>2aaccccgaaagccgggatcctctagagtcgacctgca37<210>3<211>31<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgup1-f<400>3tctagaggatcccggctttcggggttaagcc31<210>4<211>54<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgup1-r<400>4cgataactcaaaaaatacggcatgacaaaaaagccaatcacaaaaagtagttcc54<210>5<211>51<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物sacbcm-f<400>5tggcttttttgtcatgccgtattttttgagttatcgagattttcaggagct51<210>6<211>42<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物sacbcm-r<400>6gcgcaatagtgacagcagcctgaatcaggcatttgagaagca42<210>7<211>42<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgdown1-f<400>7ctgattcaggctgctgtcactattgcgcctctaacagattca42<210>8<211>38<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgdown1-r<400>8aattcgagctcggtacccggcgggcgcgtggcaggtta38<210>9<211>34<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc2-f<400>9gccacgcgcccgccgggtaccgagctcgaattcg34<210>10<211>37<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物puc2-r<400>10aaccccgaaagccgggatcctctagagtcgacctgca37<210>11<211>31<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgup2-f<400>11tctagaggatcccggctttcggggttaagcc31<210>12<211>53<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgup2-r<400>12gaggcgcaatagtgacaggcatgacaaaaaagccaatcacaaaaagtagttcc53<210>13<211>46<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgdown2-f<400>13tggcttttttgtcatgcctgtcactattgcgcctctaacagattca46<210>14<211>38<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspgdown2-r<400>14aattcgagctcggtacccggcgggcgcgtggcaggtta38<210>15<211>14<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspg1-f<400>15tttcggggttaagc14<210>16<211>19<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspg1-r<400>16ggcgggcgcgtggcaggtt19<210>17<211>15<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspg2-f<400>17ctttcggggttaagc15<210>18<211>18<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：引物pspg2-r<400>18gcgggcgcgtggcaggtt18<210>19<211>640<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：pspg上游同源臂基因序列<400>19ggctttcggggttaagcccgaaagaaaaccgtgaaatcccgccgctcgattatccgcgtgtgtatcaactgaagcgtgactttccgcatctgacaatgtcgattaacggtggtatcaagtcgctggaagaggccaaagcacacctgcaacatatggatggcgtgatggtcgggcgcgaggcgtatcagaatccgggtattctggcggcggtagaccgggagatctttggttcctcggataccgatgccgatccggtggcggtagtgcgcgccatgtatccgtacattgagcgtgaactcagccaggggacgtatctcggccatattacccggcatatgttgggcttgttccagggtattcctggcgcgcggcagtggcggcgttatttaagtgaaaatgcccataaagcgggtgcagacattaatgtgctggaacacgcgctcaaactggtggcggataagcgttaacttttcaccaaaaagtagtcaaattcaccacgccctgcgcaccgtcgcggggcgttttgctgttaaatcaatagattatttttggcatgattcttgtaatgccagcaagagatttcatatttgggagagcatcatgctggaactactttttgtgattggcttttttgtcatgc640<210>20<211>533<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：pspg下游同源臂基因序列<400>20ctgtcactattgcgcctctaacagattcatcgtgctgtaccctacatacagccgaactataaaaagaaagggcttcccaggtggaagccctatttcttttatggaatcagcaggctggaaccttgcgtcgcccggctttccagaatctcatgcgcacgctgcgcatccttcagcggatatttctgctgctcggcgacatcgaccttaatcacaccgctggcaatcaaagagaacagttcattactggcctcggttaattcctcccgcgtggtgatatagccttgcagggaagggcgtgtcacatacaacgagcctttttgattgagaatgcctaagttcacaccggtaaccgcacctgatgagttgccaaaactgaccattaagccgcggcgttgcaggcaatccagcgaccgttcccaggtgtctctgcccacggaatcgtacaccacgcgcactttcttaccgccggtgatctcttttaaccgctcgaccagatcctcttcacgatagttaataacctgccacgcgcccgc533<210>21<211>2546<212>dna<213>人工序列<223>人工序列的描述：sacbcm基因序列<400>21cgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgctagatctaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagttcctgaattcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacagctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaacgtatcaaaatgtacagcagttcatcg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