海鲜菇中游离氨基酸提取方法与流程

本发明涉及食品加工领域，尤其涉及一种海鲜菇中游离氨基酸提取方法。

背景技术：

海鲜菇又名蟹味菇、真姬菇，其中蛋白质、多糖含量高，脂肪含量低，并富含维生素、矿物质、不饱和脂肪酸和纤维素等多种活性物质。海鲜菇不仅具有较高的营养和保健价值，而且风味独特，海鲜菇中呈味氨基酸谷氨酸和天门冬氨酸含量突出，并居于各菌类之首。

关于游离氨基酸的提取方法很多，包括超声波提取法、酶解提取法、高压热水浸提法、溶剂提取法、微波提取法等。目前应用较多的有高压热水浸提法、超声波提取法、酶解提取法等，郝春喜采用超声波辅助浸提法对蟹味菇中总氨基酸含量进行提取，提取效果比常规方法提高了36％；颜梦秋等分析了酶解鸡腿菇子实体中游离氨基酸的提取工艺，使得游离氨基酸含量提取比常规提取方法提高了23％；王广慧采用高压热水浸提法提取金针菇中游离氨基酸的含量，结果显示提高了1.79％。但游离氨基酸的提取率仍有待提高，本发明旨在为海鲜菇中游离氨基酸的提取及进一步加工利用提供依据。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明设计开发了一种提取率高，污染少的海鲜菇中游离氨基酸提取方法。

本发明提供的技术方案为：

一种海鲜菇中游离氨基酸提取方法，包括：

步骤(1)将海鲜菇粉加入水，海鲜菇粉与水的质量比为1:40～50，再将复合蛋白酶加入至水中，所述复合蛋白酶由果胶酶、纤维素酶和蛋白酶构成，其中，果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:1～2:1～3，所述复合蛋白酶相比于水的质量百分比为0.6％～3.0％，进行酶解，酶解温度为20～50℃，酶解时间为3.0～4.0h；

步骤(2)进行超声提取，超声温度为30～60℃，超声时间为20～40min，超声功率为270～432w。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，海鲜菇粉与水的质量比为1:40。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:1:1。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，所述复合蛋白酶相比于水的质量百分比为1.8％。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，调节溶液ph值为7。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(2)中，超声功率为324w。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，酶解温度47℃，酶解时间3.7h。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(2)中，超声温度55℃，超声时间42min。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，海鲜菇粉的制备过程为：将鲜品的幼菇置于60℃鼓风烘箱中烘至恒重，粉碎，过100目筛，密封保存在干燥器中。

优选的是，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(2)中，在所述超声提取的过程中，分为4～8个循环，在每个循环的开始时刻，超声功率设定为432w，持续时间为5s，之后维持超声功率为324w，直至该循环结束；还包括：步骤(3)在经过所述超声提取之后，暂停1min，再在超声功率为324w，超声温度为55℃的条件下，进行补充提取。

本发明所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法采用超声辅助酶解的方法，研究了超声功率、超声时间、超声温度、料液比、复合酶比例、酶用量、酶解温度、酶解时间和酶解ph值对游离氨基酸提取效果的影响，提高了游离氨基酸的提取率，污染少，重现性好，为海鲜菇中游离氨基酸的提取及进一步加工利用提供依据。

附图说明

图1为本发明所述的l-谷氨酸的标准曲线；

图2为本发明所述的超声功率对游离氨基酸含量的影响曲线；

图3为本发明所述的料液比对游离氨基酸含量的影响曲线；

图4为本发明所述的超声时间对游离氨基酸含量的影响曲线；

图5为本发明所述的超声温度对游离氨基酸含量的影响曲线；

图6为本发明所述的复合酶比例对游离氨基酸含量的影响曲线；

图7为本发明所述的酶添加量对游离氨基酸含量的影响曲线；

图8为本发明所述的酶解温度对游离氨基酸含量的影响曲线；

图9为本发明所述的酶解时间对游离氨基酸含量的影响曲线；

图10为本发明所述的酶解ph对游离氨基酸含量的影响曲线；

图11为本发明所述的超声温度和超声时间交互作用对游离氨基酸含量的响应面分析图；

图12为本发明所述的超声温度和酶解温度交互作用对游离氨基酸含量的响应面分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供一种海鲜菇中游离氨基酸提取方法，包括：

步骤(1)将海鲜菇粉加入水，海鲜菇粉与水的质量比为1:40～50，再将复合蛋白酶加入至水中，所述复合蛋白酶由果胶酶、纤维素酶和蛋白酶构成，其中，果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:1～2:1～3，所述复合蛋白酶相比于水的质量百分比为0.6％～3.0％，进行酶解，酶解温度为20～50℃，酶解时间为3.0～4.0h；

步骤(2)进行超声提取，超声温度为30～60℃，超声时间为20～40min，超声功率为270～432w。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，海鲜菇粉与水的质量比为1:40。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，果胶酶、纤维素酶和蛋白酶的质量比为1:1:1。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，所述复合蛋白酶相比于水的质量百分比为1.8％。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，调节溶液ph值为7。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(2)中，超声功率为324w。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，酶解温度47℃，酶解时间3.7h。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(2)中，超声温度55℃，超声时间42min。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(1)中，海鲜菇粉的制备过程为：将鲜品的幼菇置于60℃鼓风烘箱中烘至恒重，粉碎，过100目筛，密封保存在干燥器中。

在一个优选的实施例中，所述的海鲜菇中游离氨基酸提取方法中，所述步骤(2)中，在所述超声提取的过程中，分为4～8个循环，在每个循环的开始时刻，超声功率设定为432w，持续时间为5s，之后维持超声功率为324w，直至该循环结束；还包括：步骤(3)在经过所述超声提取之后，暂停1min，再在超声功率为324w，超声温度为55℃的条件下，进行补充提取。

本发明通过超声波和复合酶解的单因素试验，优化出较好的工艺参数，并在此基础上开展响应面分析，建立海鲜菇中游离氨基酸提取预测模型，优化最优工艺参数，该发明将为海鲜菇的加工利用提供良好的理论依据。

为了进一步说明本发明的技术方案，现说明本发明确定各参数的过程。

一、超声波提取海鲜菇中游离氨基酸

1.样品的制备：将鲜品的幼菇置于60℃鼓风烘箱中烘至恒重。粉碎，过100目筛，密封保存在干燥器中，备用。

2.游离氨基酸含量的测定：称取海鲜菇粉1.0g(精确至0.01g)，置于500ml烧杯中，加入4.5g氧化镁及300ml沸水，在沸水浴中浸提20min(每隔5min摇晃一次)。浸提结束后，将浸提液趁热减压抽滤，将滤液移入500ml容量瓶，冷却后定容至刻度，混匀，待测。试验均平行3次，并做空白对照。样品中总游离氨基酸采用茚三酮比色法测定。准确吸取样液2.0ml，注入25ml比色管中，加水至6.0ml，然后加2％茚三酮溶液和磷酸缓冲液(ph＝8.04)各1ml，摇匀，置沸水中加热15min。取出，迅速冷却至室温，加水至刻度25ml处，摇匀，静置15min后在564nm处测定吸光度(游离氨基酸标准曲线图如图1所示)。

3.超声条件对游离氨基酸提取效果的影响：在超声波提取游离氨基酸中，以茚三酮比色法测得总游离氨基酸含量为优化参数，对料液比(1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80)、超声功率(54、108、162、216、270、324、378、432w)、超声温度(15℃、30℃、45℃、60℃、75℃)及超声时间(10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min)四个因素进行工艺参数优化。将超声提取后的溶液，进行离心(4000r/min，15min)，上清液移入100ml容量瓶，定容，摇匀，待测(结果如图2，3，4，5所示)。

图2展示了超声功率对游离氨基酸含量的影响，从图2中可知，超声功率在324w时游离氨基酸含量达到最大。图3展示了料液比对游离氨基酸含量的影响，从图3中可知，料液比在1:40时游离氨基酸含量达到最大。图4展示了超声时间对游离氨基酸含量的影响，超声时间在20～40min时均相对较高，在30min时游离氨基酸含量达到大。图5展示了超声温度对游离氨基酸含量的影响，从图5中可知，超声温度在30～60℃时游离氨基酸含量均相对较高，超声温度在40℃时游离氨基酸含量达到最大。

二、复合酶解提取海鲜菇中游离氨基酸

1.样品的制备：将鲜品的幼菇置于60℃鼓风烘箱中烘至恒重。粉碎，过100目筛，密封保存在干燥器中，备用。

2.游离氨基酸含量的测定：称取海鲜菇粉1.0g(精确至0.01g)，置于500ml烧杯中，加入4.5g氧化镁及300ml沸水，在沸水浴中浸提20min(每隔5min摇晃一次)。浸提结束后，将浸提液趁热减压抽滤，将滤液移入500ml容量瓶，冷却后定容至刻度，混匀，待测。试验均平行3次，并做空白对照。样品中总游离氨基酸采用茚三酮比色法测定。准确吸取样液2.0ml，注入25ml比色管中，加水至6.0ml，然后加2％茚三酮溶液和磷酸缓冲液(ph＝8.04)各1ml，摇匀，置沸水中加热15min。取出，迅速冷却至室温，加水至刻度25ml处，摇匀，静置15min后在564nm处测定吸光度。

3.条件对游离氨基酸提取效果的影响：选取纤维素酶、果胶酶和蛋白酶作为复合酶类，在酶解提取游离氨基酸中，以茚三酮比色法测得总游离氨基酸含量为优化参数，对复合酶比例(果胶酶、纤维素酶、蛋白酶为1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、1:2:3)、复合酶添加质量(0.6％、1.2％、1.8％、2.4％、3.0％)、酶解温度(20℃、35℃、50℃、65℃、80℃、95℃)、酶解时间(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h)和酶解ph(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)五个因素进行工艺参数优化。酶解提取结束后，在沸水浴中灭酶10min，离心(4000r/min，15min)，上清液移入100ml容量瓶，定容，摇匀，待测(结果如图6，7，8，9，10所示)。

图6展示了复合酶比例对游离氨基酸含量的影响，在所给定的复合酶比例范围中，游离氨基酸含量的变化不大。图7展示了酶添加量对游离氨基酸含量的影响，在所给定的复合酶添加量范围中，游离氨基酸含量的变化不大，但在复合酶添加量为1.8％时游离氨基酸含量最大。图8展示了酶解温度对游离氨基酸含量的影响，酶解温度在50℃时游离氨基酸含量最大。图9展示了酶解时间对游离氨基酸含量的影响，酶解时间在3.0～4.0h时游离氨基酸含量相对较大，并且在4.0h最大。图10展示了酶解ph对游离氨基酸含量的影响，在酶解ph值为7时游离氨基酸含量最大。

实施例一：超声辅助酶解提取海鲜菇中游离氨基酸

1.样品的制备：将鲜品的幼菇置于60℃鼓风烘箱中烘至恒重。粉碎，过100目筛，密封保存在干燥器中，备用。

2.游离氨基酸含量的测定：称取海鲜菇粉1.0g(精确至0.01g)，置于500ml烧杯中，加入4.5g氧化镁及300ml沸水，在沸水浴中浸提20min(每隔5min摇晃一次)。浸提结束后，将浸提液趁热减压抽滤，将滤液移入500ml容量瓶，冷却后定容至刻度，混匀，待测。试验均平行3次，并做空白对照。样品中总游离氨基酸采用茚三酮比色法测定。准确吸取样液2.0ml，注入25ml比色管中，加水至6.0ml，然后加2％茚三酮溶液和磷酸缓冲液(ph＝8.04)各1ml，摇匀，置沸水中加热15min。取出，迅速冷却至室温，加水至刻度25ml处，摇匀，静置15min后在564nm处测定吸光度。

3.超声辅助酶解响应面法优化游离氨基酸的提取：以超声提取游离氨基酸和复合酶解提取游离氨基酸的单因素优化实验结果，利用design-expert软件的b-b方法进行超声辅助酶解提取幼菇中游离氨基酸的响应面实验设计。称取1.0g(精确至0.0001g)样品，加入40ml蒸馏水，调节溶液ph至7.0，再分别将果胶酶、纤维素酶、蛋白酶按照1:1:1的质量比加入1.8％；先在一定温度的水浴中酶解一段时间后，再进行超声提取。响应面实验中超声温度(30～60℃)、超声时间(20～40min)、酶解温度(20～50℃)、酶解时间(3.0～4.0h)。

(1)模型的建立及显著性检验

表2响应面试验设计与结果

注：a—超声温度，℃；b—超声时间，min；c—酶解温度，℃；d—酶解时间，h

表2中1—24号是析因试验，25、26、27、28、29号是中心试验以估计误差。29个试验点为分析因点和零点，其中析因点为自变量取值在a、b、c、d所构成的三维顶点；零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。

利用design-expert对表2数据进行多元二次回归非线性拟合，得到以提取液中游离氨基酸总含量为响应值(y)，与超声温度(a)、超声时间(b)、酶解温度(c)、酶解时间(d)的回归方程：

y＝149.12+5.32a+1.1b+3.9c+0.44d+2.95ab-0.4ac+0.43ad+3.05bc+0.75bd+0.15cd-7a2-2.86b2-3.84c2+1.72d2

表3回归模型方差分析

注：*差异不显著(p＞0.05)，**差异显著(p＜0.05)，***差异极显著(p＜0.01)

*nosignificantdifferent(p＞0.05),**significantdifferent(p＜0.05),***extremelysignificantdifferent(p＜0.01)

根据表3对回归模型进行方差分析结果表明：模型p值为0.0007，回归模型极显著(p＜0.01)，说明模型在研究的整个回归区域拟合很好。

由回归方程方差分析可知：a、c、a2、c2是极显著因素，对提高游离氨基酸含量有很大的影响作用；其余因素对实验结果的影响不显著。由f检验得到各因子对提取小菇中游离氨基酸含量影响的顺序是a(超声温度)＞c(酶解温度)＞b(超声时间)＞d(酶解时间)。

(2)响应面交互作用分析和优化

利用designexpert软件对各个因素间的交互作用进行响应面分析，并绘制出图10的以提取游离氨基酸含量为响应值的趋势图。响应面反映各试验因子对相应值影响的大小，由等高线图得到最优条件下各试验因子的取值。如果一个响应曲面坡度非常的陡峭，表面游离氨基酸提取率对于各试验因子的改变非常敏感；反之，如果一个响应曲面坡度相对平缓，表明游离氨基酸提取得率可以忍受试验因子的变异，而不影响响应值的大小。等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著。在a恒定不变时，随着b的升高，游离氨基酸的提取效果呈上升的变化趋势，b在20～35min范围内，游离氨基酸提取含量逐渐增加并达到最大值，到达峰值后呈逐渐下降的趋势。在a恒定不变时，随着c的升高，游离氨基酸的提取效果呈上升的变化趋势，到达一定值后游离氨基酸含量变化缓慢。利用designexpert软件，对建立的模型进行参数的最优化分析，得到优化工艺条件为：超声温度55℃，超声时间42min，酶解温度47℃，酶解时间3.7h，理论幼菇中提取的游离氨基酸含量为150.229mg/g。按照模型的优化条件，重复进行3次平行实验，幼菇中游离氨基酸的提取含量为148.3mg/g，提取率比水提法提高了39.4％，与预测值相差1.28％，证明该数学模型的方程与试验设计的拟合性很好(结果如图11和图12所示)。

实施例二

1.样品的制备：将鲜品的幼菇置于60℃鼓风烘箱中烘至恒重。粉碎，过100目筛，密封保存在干燥器中，备用。

2.游离氨基酸含量的测定：称取海鲜菇粉1.0g(精确至0.01g)，置于500ml烧杯中，加入4.5g氧化镁及300ml沸水，在沸水浴中浸提20min(每隔5min摇晃一次)。浸提结束后，将浸提液趁热减压抽滤，将滤液移入500ml容量瓶，冷却后定容至刻度，混匀，待测。试验均平行3次，并做空白对照。样品中总游离氨基酸采用茚三酮比色法测定。准确吸取样液2.0ml，注入25ml比色管中，加水至6.0ml，然后加2％茚三酮溶液和磷酸缓冲液(ph＝8.04)各1ml，摇匀，置沸水中加热15min。取出，迅速冷却至室温，加水至刻度25ml处，摇匀，静置15min后在564nm处测定吸光度。

3.超声辅助酶解响应面法优化游离氨基酸的提取：称取1.0g(精确至0.0001g)样品，加入40ml蒸馏水，调节溶液ph至7.0，再分别将果胶酶、纤维素酶、蛋白酶按照1:1:1的质量比加入1.8％；先在酶解温度47℃的水浴中酶解3.7h后，再进行超声提取，超声温度为55℃，超声时间为42min，在所述超声提取的过程中，分为4～8个循环，在每个循环的开始时刻，超声功率设定为432w，持续时间为5s，之后维持超声功率为324w，直至该循环结束；在经过所述超声提取之后，暂停1min，再在超声功率为324w，超声温度为55℃的条件下，进行补充提取。幼菇中游离氨基酸的提取含量为155.9mg/g。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。