一种改进的测定氨基酸含量的方法
【专利摘要】本发明提出了一种改进的测定氨基酸含量的方法，首先对试样进行处理，试样与盐酸在安瓿瓶中混合后消化，消化冷却后加入乙醇消泡，加水稀释后过滤待用；用柠檬树钠将标样稀释25倍后待用，配置流动相A、流动相B和流动相C，然后配置反应液A和反应液B，再在高效液相色谱仪上对试样和标样分别测试分析，根据出峰时间可以鉴定样品中氨基酸的种类，将样品峰面积与标样对比，计算样品中各种氨基酸含量。本发明方法加入乙醇既可消泡，因此不会影响定容刻度的判断，又不会结果对结果产生影响，本发明方法步骤简单，易于操作。
【专利说明】一种改进的测定氨基酸含量的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种氨基酸含量测定方法，特别是指一种改进的测定氨基酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]氨基酸在医学上具有防病治病的作用，也可作为营养型化妆品的有效成分合成药物、表面活性剂及其他工业产品等原料。因此，氨基酸分析是工业、农业生产及生命科学研究中最重要的技术之一。
[0003]用盐酸水解饲料中的蛋白质使其成为游离氨基酸进而采用高效液相色谱柱后衍生测定氨基酸的方法分析其组成。传统方法在样品前处理时加盐酸溶解，容易产生泡沫，定容时会影响判定终点。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明提出一种改进的测定氨基酸含量的方法，该方法可以消除泡沫，不会对结果产生影响，定容时不会影响判定终点。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的技术采用以下技术方案:
一种改进的测定氨基酸含量的方法，包括以下步骤:
(1)准确称取试样0.1OOOg于1ml安瓿瓶中，然后向瓿瓶中准确加1+1的盐酸5ml，将安瓶瓶封口，冷却后，用胶布包好安瓶瓶，防止在恒温消化时安瓶瓶破裂，置于恒温干燥箱中消化；
(2)消化完成后取出安瓿瓶冷却至室温，切开安瓿瓶，过滤消化液，立即准确移取ImL滤液于50mL容量瓶中，此时容量瓶内很多泡沫，加2-3滴乙醇消泡，然后加水稀释至刻度；
(3)稀释液通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤，得到的滤液待用；滤液可在4°C条件下存放4小时；
(4)标样的稀释处理
用ρΗ2.20的0.07mol/L柠檬酸钠稀释2.5 μ mol/mL的标样25倍，得浓度为0.1 μ mol/mL的标样待用，所述稀释标样可在4°C条件下保存I个月；
(5)配制流动相
流动相A液:称取58.8g柠檬酸钠，溶解于2.5L水中，加乙醇210mL，加高氯酸50mL，加水稀释至3L，将该稀释液用60%高氯酸或4mol/L氢氧化钠，准确调节pH值至3.20,并通过0.45mm孔径的滤膜过滤；
流动相B液:称取柠檬酸钠58.8g和硼酸12.4g溶解于800mL水中，加4mol/L氢氧化钠溶液30mL，加水稀释至1L，将该稀释液用60%高氯酸或4mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为10.00并通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤；
流动相C液:称取氢氧化钠4g，加水稀释至500mL，并通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤；以上三种流动相不用时均应在4°C环境中存放； (6)反应液的配制
硼酸-碳酸钠缓冲溶液:称取122.1g无水碳酸钠、56.4g硫酸钾和40.7g硼酸加水至
3L ；
A反应液:用量筒量取500mL硼酸-碳酸钠缓冲溶液倒入试剂瓶中,加0.2mL氯酸钠溶液，混合均匀；
B反应液:称取邻苯二甲醛400mg，加乙醇7mL、2-巯基乙醇lmL、10%的十二烷基聚乙二醇醚2mL，用硼酸-碳酸钠缓冲溶液定容至500ml ;以上A、B反应液可在4°C条件下保存7天；
(7)上机分析
用微量注射器注入10 μ L试样及标样于高效液相色谱仪上进入分析，得色谱图；根据出峰时间鉴定样品中氨基酸的种类，将样品峰面积与标样对比，计算样品中各种氨基酸含量。
[0006]进一步地，所述步骤(I)中于消化条件为110°C恒温干燥箱中消化12小时。
[0007]进一步地，所述步骤(4)中标样为17种氨基酸2.5Mmol/L混标溶液。
[0008]进一步地，所述17种氨基酸分别为:天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸
1+1的盐酸溶液，即I体积的盐酸+1体积的水混合得到的溶液。
[0009]本发明与现有技术相比具有的有益效果为:本发明方法加入乙醇既可消泡，因此不会影响定容刻度的判断，又不会结果对结果产生影响，本发明方法步骤简单，易于操作。
【具体实施方式】
[0010]为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将对本发明作进一步的说明。
[0011]一种改进的测定氨基酸含量的方法，包括以下步骤:
(1)准确称取试样0.1OOOg于1ml安瓿瓶中，然后向瓿瓶中准确加1+1的盐酸5ml，将安瓿瓶封口，冷却后，用胶布包好安瓿瓶，防止在恒温消化时安瓿瓶破裂，置于110°C恒温干燥箱中消化12小时；
(2)取出安瓿瓶冷却至室温，切开安瓿瓶，过滤消化液，立即准确移取ImL滤液于50mL容量瓶中，此时容量瓶内很多泡沫，加2-3滴乙醇消泡，然后加水稀释至刻度；
(3)稀释液通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤，得到的滤液待用；滤液可在4°C条件下存放4小时；
(4)标样的稀释处理
用ρΗ2.20的0.07mol/L柠檬酸钠稀释2.5 μ mol/mL的标样(17种氨基酸2.5Mmol/L混标溶液(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸))25倍，得浓度为
0.1 μ mol/mL的标样待用，所述稀释标样可在4°C条件下保存I个月；
(5)配制流动相
流动相A液:称取58.8g柠檬酸钠，溶解于2.5L水中，加乙醇210mL，加高氯酸50mL，加水稀释至3L，将该稀释液用60%高氯酸或4mol/L氢氧化钠，准确调节pH值至3.20,并通过0.45mm孔径的滤膜过滤；
流动相B液:称取柠檬酸钠58.8g和硼酸12.4g溶解于800mL水中，加4mol/L氢氧化钠溶液30mL，加水稀释至1L，将该稀释液用60%高氯酸或4mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为10.00并通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤；
流动相C液:称取氢氧化钠4g，加水稀释至500mL，并通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤；以上三种流动相不用时均应在4°C环境中存放；
(6)反应液的配制
硼酸-碳酸钠缓冲溶液:称取122.1g无水碳酸钠、56.4g硫酸钾和40.7g硼酸加水至
3L ；
A反应液:用量筒量取500mL硼酸-碳酸钠缓冲溶液倒入试剂瓶中,加0.2mL氯酸钠溶液，混合均匀；
B反应液:称取邻苯二甲醛400mg，加乙醇7mL、2-巯基乙醇lmL、10%的十二烷基聚乙二醇醚2mL，用硼酸-碳酸钠缓冲溶液定容至500ml ;以上A、B反应液可在4°C条件下保存7天；
(7)上机分析
用微量注射器注入10 μ L试样及标样于高效液相色谱仪上进入分析，得色谱图；根据出峰时间鉴定样品中氨基酸的种类，将样品峰面积与标样对比，计算样品中各种氨基酸含量。
[0012]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种改进的测定氨基酸含量的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)准确称取试样0.1OOOg于1ml安瓿瓶中，然后向瓿瓶中准确加1+1的盐酸5ml，将安瓶瓶封口，冷却后，用胶布包好安瓶瓶，防止在恒温消化时安瓶瓶破裂，置于恒温干燥箱中消化； (2)消化完成后取出安瓿瓶冷却至室温，切开安瓿瓶，过滤消化液，立即准确移取ImL滤液于50mL容量瓶中，此时容量瓶内很多泡沫，加2-3滴乙醇消泡，然后加水稀释至刻度； (3)稀释液通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤，得到的滤液待用；滤液可在4°C条件下存放4小时； (4)标样的稀释处理 用ρΗ2.20的0.07mol/L柠檬酸钠稀释2.5 μ mol/mL的标样25倍，得浓度为0.1 μ mol/mL的标样待用，所述稀释标样可在4°C条件下保存I个月； (5)配制流动相 流动相A液:称取58.8g柠檬酸钠，溶解于2.5L水中，加乙醇210mL，加高氯酸50mL，加水稀释至3L，将该稀释液用60%高氯酸或4mol/L氢氧化钠，准确调节pH值至3.20,并通过0.45mm孔径的滤膜过滤； 流动相B液:称取柠檬酸钠58.8g和硼酸12.4g溶解于800mL水中，加4mol/L氢氧化钠溶液30mL，加水稀释至1L，将该稀释液用60%高氯酸或4mol/L氢氧化钠溶液调节其pH值为10.00并通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤； 流动相C液:称取氢氧化钠4g，加水稀释至500mL，并通过0.45 μ m孔径的滤膜过滤；以上三种流动相不用时均应在4°C环境中存放； (6)反应液的配制 硼酸-碳酸钠缓冲溶液:称取122.1g无水碳酸钠、56.4g硫酸钾和40.7g硼酸加水至3L ； A反应液:用量筒量取500mL硼酸-碳酸钠缓冲溶液倒入试剂瓶中,加0.2mL氯酸钠溶液，混合均匀； B反应液:称取邻苯二甲醛400mg，加乙醇7mL、2-巯基乙醇lmL、10%的十二烷基聚乙二醇醚2mL，用硼酸-碳酸钠缓冲溶液定容至500ml ;以上A、B反应液可在4°C条件下保存7天； (7)上机分析 用微量注射器注入10 μ L试样及标样于高效液相色谱仪上进入分析，得色谱图；根据出峰时间鉴定样品中氨基酸的种类，将样品峰面积与标样对比，计算样品中各种氨基酸含量。
2.根据权利要求1所述的改进的测定氨基酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(I)中于消化条件为110°C恒温干燥箱中消化12小时。
3.根据权利要求2所述的改进的测定氨基酸含量的方法，其特征在于:所述步骤(4)中标样为17种氨基酸2.5Mfl1l/L混标溶液。
4.根据权利要求3所述的改进的测定氨基酸含量的方法，其特征在于:所述17种氨基酸分别为:天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸。
【文档编号】G01N30/06GK104165946SQ201410403269
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】张玉良, 陈凯松 申请人:广州衡创测试技术服务有限公司