一种黄芪注射液初生代谢成分的含量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物含量检测方法，尤其是一种黄芪注射液的含量检测方法。
【背景技术】
[0002] 黄芪注射液是近几年开发的中药制剂，具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾 利湿之功，主要用于治疗心气虚损、血脉痰之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝 炎。本品作为临床常用药物，国内目前有十几家生产厂家生产。中国药典和部颁标准中黄 芪药材和黄芪注射液的定量指标成分为黄芪甲苷，传统检测黄芪注射液中有效成分的方法 选择高效液相色谱法（HPLC)，尽管该方法具有许多优点，但仍然在以下缺陷：1、色谱分离 损失：常用ODS色谱柱在分离过程损失极性较大的水溶性成分；2、缺乏通用型检测器：只能 在同一张谱图下检测出某类或某几类化学成分；3、标准品难分离：不易获得，为成分的鉴 定和定量分析带来的困难，同时也提高了工业生产成本。
[0003]定量质子核磁共振（quantitative proton nuclear magnetic resonance，c^H-NMR)技术是一种日益成熟的仪器分析方法，现已在化学、食品、农业以及军 事领域有广泛的应用，可用于标准物质的纯度检测，也可用于混合物中各种成分的含量测 定。dH-NMR用于药物分析的最大优势在于可同时提供化合物结构确证的定性信息和含量 测定的定量信息。与HPLC方法相比，该方法无需待测物对照品、样品预处理步骤简单、专属 性强、测试速度快、不破坏样品等优点。dH-NMR常用定量方法为绝对定量法，即以含量已 知的内标物与待测物制成混合溶液同时测定图谱，通过二者峰面积的比值确定待测物的含 量。在对混合物中的成分进行定量分析时，其关键在于定量峰的选择，选择各个成分中完 全独立、无干扰的特征信号峰才可用于该化合物的含量测定。在将iH-NMR指纹图谱技术引 入中药注射液的化学成分表征中所面临的难题是^H-NMR图谱的化学位移值范围通常比较 窄（0-12ppm)，在该区间内质子信号峰相互重叠严重，不易寻找到完全独立的信号峰用于化 合物定量。解卷积（Global Spectral Deconvolution，GSD)是一种新兴的1H-NMR图谱处 理方法，通过对全谱反褶积的精确校正，准确鉴别复杂峰形，为谱图中每个复杂峰整合重叠 信号，分离出重叠的信号峰，并提供完整的峰值和偶合常数J。解卷积处理方法的优势在于 iH-NMR谱在有杂质峰、信号重叠和信噪比不高的情况，仍然可以使用积分面积确定化合物 的浓度。
[0004] 2014年9月3号公开的CN104181186A专利申请中报道有关黄芪注射液的屯-匪1? 指纹图谱的构建方法，仅定性描述了黄芪注射液中的25种成分，但是对各个成分的定量分 析未能阐明。然而特征性成分的含量测定是中药注射液质量控制的重要组成部分。因此， 针对黄芪注射液中的特征性成分，尤其是初生代谢产物，寻找一种高效、准确的定量方法具 有非常重要的应用价值。本发明运用iH-NMR图谱表征黄芪注射液中的初生代谢产物，包括 氨基酸、有机酸和糖类化合物；应用解卷积方法抽提特征性成分的质子信号定量峰；建立 多指标成分的含量测定方法及方法学考察程序；应用该方法测定不同厂家不同批次黄芪注 射液样品的 1H-NMR谱，比较特征性成分的含量差异。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种黄芪注射液初生代谢成分的含量检测 方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007] -种黄芪注射液初生代谢成分的含量检测方法，基于解卷积（GSD)定量核磁共振 技术对黄芪注射液的中药成分进行含量测定，具体步骤为：
[0008] (1)黄芪注射液样品溶液的制备
[0009] 将黄芪注射液样品冻干后精密称取10mg，加入0. 6ml重水（D20,含内标TSP 0. 2078mg/ml)，转移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR测试；
[0010] (2) iH-NMR指纹图谱的测定
[0011] 将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定黄芪注射液样品溶液的 iH-NMR指纹图谱和对照品溶液的 1H-NMR图谱，其中测试参数及条件为：抑水峰序列zgcppr， 观测频率600. 23MHz，测定温度298K，谱宽7211. 5Hz，90°脉冲宽度13. 8700 y s，采样数据 点65536,扫描次数16次，延迟时间15s，接受增益114 ;
[0012] (3)质子信号峰的定性鉴别
[0013] 黄芪注射液溶液的1H-NMR图谱上质子信号峰分布在S 0-5. 5之间，其中 S 0. 0-3. 2是氨基酸和有机酸质子特征信号区，S 3. 3-5. 5是糖基质子特征信号区，根据质 子信号峰的化学位移值和偶合裂分情况，结合黄芪注射液的二维核磁图谱信息，共鉴定出 20种初生代谢成分和4种次生代谢成分，分别为
[0014] 表1黄芪注射液初生代谢成分1H-NMR归属
[0015]
【主权项】
1. 一种黄芪注射液中初生代谢成分的含量检测方法，其特征在于：基于定量核磁共振 技术和解卷积处理方法对黄芪注射液中的多种成分同时进行含量测定，具体步骤为： (1) 黄芪注射液样品溶液的制备 将黄芪注射液样品冻干后精密称取l〇mg，加入0.6ml含内标TSPO. 2078mg/ml的D20， 转移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR测试； (2) 4-鳩?指纹图谱的测定 将核磁管置于核磁共振仪中，采用水峰抑制脉冲序列测定黄芪注射液样品溶液的iH-NMR指纹图谱和对照品溶液的1H-NMR图谱，其中测试参数及条件为：抑水峰序列zgcppr， 观测频率600. 23MHz，测定温度298K，谱宽7211. 5Hz，90°脉冲宽度13. 8700ys，采样数据 点65536,扫描次数16次，延迟时间15s，接受增益114 ; (3) 质子信号峰的定性鉴别 黄芪注射液溶液的1H-NMR图谱上质子信号峰分布在S0-5. 5之间，其中S〇. 0-3. 2是 氨基酸和有机酸质子特征信号区，S3. 3-5. 5是糖基质子特征信号区，根据质子信号峰的化 学位移值和偶合裂分情况，结合黄芪注射液的二维核磁图谱信息，共鉴定出20种初生代谢 产物和4种次生代谢成分； (4) iH-NMR多成分的含量测定 以3-(三甲基甲硅烷基）丙酸-d4钠盐为内标化合物，应用以下公式测定黄芪注射液 中8种初生代谢成分乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、丙二酸、甘氨酸、葡萄糖、蔗糖、甲酸的浓度：
其中Px和PTSP分别为化合物和TSP的浓度，Ax和ATSP分别是化合物定量峰和TSP甲基 峰的积分面积，队和NTSP分别代表化合物定量峰和TSP甲基峰的质子个数，MMTSP分别是 化合物和TSP的分子量； (5) iH-NMR谱的处理和解卷积参数设置 采用MetresNova软件对得到的屯-匪1?指纹图谱依次进行相位调整、基线校正、定标和 解卷积处理，解卷积参数设置中J-Tolerance的设定值为0. 4Hz，即可根据步骤（4)所述方 法测定黄芪注射液8种初生代谢成分的含量。
2. 根据权利要求1所述的黄芪注射液中初生代谢成分的含量检测方法，其特征在于： 所述步骤（3)中20种初生代谢成分和4种次生代谢成分，分别为：
CN10469802：1A ，丨入，丨，T 3/3 贝
【专利摘要】本发明提供了一种黄芪注射液初生代谢成分的含量检测方法，基于定量核磁共振技术和解卷积(GSD)处理方法对黄芪注射液中的多种初生代谢成分同时进行含量测定，具体步骤为：(1)黄芪注射液样品溶液的制备；(2)1H-NMR指纹图谱的测定；(3)质子信号峰的定性鉴别；(4)1H-NMR多成分的含量测定；(5)1H-NMR谱的处理和解卷积参数设置；所述方法具有简便易行、稳定性好、精密度高、重现性好、专属性强等特点，在全面检测黄芪注射液质量方面具有广阔的应用前景。
【IPC分类】G01N24-08
【公开号】CN104698021
【申请号】CN201510031725
【发明人】姜苗苗, 王跃飞, 陈燕燕, 李晓男
【申请人】天津中医药大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年1月22日