制备氨基酸的方法

专利名称：制备氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及在转基因生物中制备氨基酸的方法。
本发明进一步涉及核酸构建体、载体和转基因生物，以及它们的用途。
氨基酸形成所有蛋白质的基本结构单位并因此对于正常细胞功能是必要的。术语“氨基酸”在本领域中是已知的。蛋白原性(proteogenic)氨基酸，这类氨基酸有20种，作为蛋白质结构单位它们通过肽键连接到一起，而非蛋白原性氨基酸(已知有数百种)通常不存在于蛋白质中[见Ullmann′s工业化学百科全书，A2卷，57-97页VCHWeinheim(1985)]。氨基酸能够以D或L构型存在，尽管L-氨基酸是天然存在的蛋白质中所发现的唯一类型。20种蛋白原性氨基酸每一种的生物合成和降解途径都已经在原核和真核细胞中进行了很好的表征(见，例如，Stryer，L.生物化学，第3版，578-590页(1988))。通过简单的生物合成途径将“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)(如此称谓是因为由于它们生物合成的复杂性致使它们必须通过饮食而获得)转化为其它11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)。高等动物具有合成若干这些氨基酸的能力，但必需氨基酸必须从食物获得以进行正常的蛋白质合成。
氨基酸用于多种工业生产，包括人和动物的食物、化妆品、药物和化学工业。因此，例如L-谷氨酸用于灌注液中。诸如D，L-蛋氨酸、L-赖氨酸或L-苏氨酸的氨基酸用于动物食品工业。对于人类和多种有用动物的饮食特别重要的是必需氨基酸缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。因此，例如，赖氨酸不仅对于人类饮食是重要的氨基酸而且对于单胃动物诸如家禽和猪也是重要的。在诸如谷类和小麦的植物中L-赖氨酸是有限氨基酸，这就是说为了能够最佳地利用此种植物食物，明智地是将L-赖氨酸添加至人或动物的食物。谷氨酸是最常使用的滋味添加剂(味精，MSG)并广泛用于食品工业，天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是这样。甘氨酸、L-蛋氨酸和色氨酸全部用于制药工业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于制药工业和化妆品工业。苏氨酸、色氨酸和D/L-蛋氨酸广泛用作动物食物添加剂[Leuchtenberger，W.(1996)氨基酸-技术生产和使用，466-502页，Rehm等(编著)生物技术第6卷，第14a章，VCHWeinheim]。此外，氨基酸作为前体物适用于化学工业以合成合成的氨基酸和蛋白质，例如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨酸和Ullmann′s工业化学百科全书，A2卷，57-97页，VCH，Weinheim，1985中所述的其它物质。
氨基酸的年生产量目前总计超过1百万t/a，其市场价值超过2亿US$。现在通过四种竞争方法对它们进行生产。
1.从蛋白质水解产物中提取，例如L-胱氨酸、L-亮氨酸或L-酪氨酸，2.化学合成，例如D，L-蛋氨酸，3.在酶或细胞反应器中转化化学前体物，例如L-苯丙氨酸，和4.为了生产和分离大量特别期望的分子而研发的通过大规模培养细菌进行发酵制备。特别适于该目的的生物是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，例如其用于制备L-赖氨酸或L-谷氨酸。通过发酵制备的氨基酸的其它例子是L-苏氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸。
已经详细表征了能够产生天然氨基酸的生物例如细菌中这些天然氨基酸的生物合成[关于细菌氨基酸生物合成及其调控的综述，见Umbarger，H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47533-606]。谷氨酸是通过α-酮戊二酸(三羧酸循环中的一个中间体)的还原氨基化作用合成的。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸各自相继从谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成发生于由3-磷酸甘油(一种糖酵解中间体)起始的三步程序并在氧化、转氨基和水解步骤之后而获得该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸各自从丝氨酸产生，前者通过高半胱氨酸与丝氨酸的聚合，而后者通过在由丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中将侧链β碳原子转移至四氢叶酸酯。苯丙氨酸和酪氨酸是由糖酵解途径和磷酸戊糖途径的前体合成的，赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸，在该9-步生物合成途径中仅预苯酸合成后的最后两步不同。同样色氨酸也产生于这两个起始分子，但它是在11-步途径中合成的。在由苯丙氨酸羟化酶催化的反应中酪氨酸也能够由苯丙氨酸产生。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸各自是丙酮酸(糖酵解最终产物)的生物合成产物。天冬氨酸是从草乙酸(三羧酸循环中的中间体)形成的。天冬酰胺、蛋氨酸、苏氨酸和赖氨酸各自通过转化天冬氨酸而产生。异亮氨酸是从苏氨酸形成的。组氨酸是在复杂的9-步途径中从5-磷酸核糖1-焦磷酸(一种活化糖)形成的。
通过棒状杆菌(coryneform bacteria)菌株特别是谷氨酸棒杆菌的发酵作用制备氨基酸是已知的。由于非常重要，不断地有关于改善现存制备方法的工作进行。方法的改善可以涉及发酵技术措施，例如搅拌或氧供应；或者培养基的组成成分，例如发酵过程中的糖浓度；或者积累产物，例如通过离子交换层析；或者微生物本身固有的生产特性。其它属例如埃希氏杆菌属(Escherichia)或芽胞杆菌属(Bacillus)的细菌也用于制备氨基酸。
通过菌株选择已经研发了大量能从系列含硫精细化学品产生各种预期化合物的突变株。根据具体分子的生产，用于改善这些微生物生产特性的方法是诱变、筛选和选择突变株。然而，这是耗时且艰难的过程。EP-A-0066 129通过举例的方式描述了使用棒状杆菌制备苏氨酸的过程。也已经详细说明了制备蛋氨酸的相应过程。以这种方式，例如获得了对抗代谢物具有抗性的菌株，抗代谢物例如蛋氨酸类似物α-甲基蛋氨酸、乙基硫氨酸、正亮氨酸、N-乙酰基正亮氨酸、S-三氟甲基高半胱氨酸、2-氨基-5-heprenoitacid、硒基蛋氨酸、蛋氨酸sulfoximine、methoxine、1-氨基环戊烷羧酸，或者重要调节代谢产物的营养缺陷型并产生含硫精细化品例如L-蛋氨酸的菌株。对于经济上的利用，研发用于制备蛋氨酸的该种类型方法具有产量太低的缺点并且因此它们不能与化学合成相竞争。
Zeh等(Plant Physiol.，127卷，2001792-802)描述了通过使用所谓的反义技术抑制苏氨酸合成而增加马铃薯植物中蛋氨酸含量。这导致苏氨酸合成酶活性降低而不降低植物中苏氨酸含量。该技术的缺点是非常复杂并且如果总体而言，该技术仅能非常有限地应用于工业规模。此外，还必须高度区别性地抑制酶活性，因为，否则，就会产生氨基酸的营养缺陷体并且植物不再生长。
同样重组DNA技术方法已经应用多年以通过扩增个别的氨基酸生物合成基因并检测对氨基酸生产量的影响用于产L-氨基酸棒状杆菌菌株的菌株改进。
超过细胞蛋白质生物合成所需的所有氨基酸不能储存相反而是被降解，以至于给细胞主要代谢途径提供了中间体[参见综述，见Stryer，L.，Biochemistry，第3版，第21章“氨基酸降解和尿素循环”；495-516页(1988)]。尽管细胞能够将不需要的氨基酸转化为有用的代谢中间体，考虑到能量、前体分子和它们合成所需要的酶，氨基酸生产是昂贵的。因此，氨基酸生物合成受到反馈抑制的控制也就不令人惊讶了，本来就存在减慢或完全终止其自身生产的特定氨基酸[参见氨基酸生物合成途径中的反馈机制的综述，见Stryer，L.，Biochemistry，第3版，第24章“氨基酸和亚铁血红素的生物合成”；575-600页(1988)]。因此特定氨基酸的生产量受到细胞中该种氨基酸量的限制。
改进通过发酵进行的精细化学品制备通常与改进底物流入量和生产量相关。在该种关系中重要的是通过中间体或终产物阻止或降低重要合成酶的抑制作用。同样有利的是避免或降低碳流入不需要的产物或副产物的消耗。
如上所述，必需氨基酸是人类和许多哺乳动物例如家畜所必需的。在该种关系中L-蛋氨酸是重要的甲基供体以用于诸如胆碱、肌酸、肾上腺素、碱基、RNA、DNA、组氨酸的生物合成，并用于形成S-腺苷蛋氨酸之后的转甲基作用或者作为硫氢基供体用于形成半胱氨酸。
L-蛋氨酸另外还表现出对阻抑作用具有有益的作用。
因此对人和动物食物进行改善是人和动物食品工业的重要任务。例如，由于植物中诸如L-赖氨酸和L-色氨酸的氨基酸供给给哺乳动物是有限的，所以必须改善食物。对于人和动物食物的质量，尽可能平衡的氨基酸模式是特别有利的，因为一种氨基酸例如L-赖氨酸超过食物中特定含量而大量过量对于食物的利用没有进一步的有益影响，因为其它氨基酸突然变得有限了。食物质量进一步提高可仅通过加入其它在这些条件下有限的氨基酸。因此，在成长的猪体内，赖氨酸最初是有限的。如果食物包含足够的赖氨酸，苏氨酸就变成了有限氨基酸。如果在食物中也加入足够的苏氨酸，下一个有限的氨基酸是色氨酸。对于小鸡，前三种有限氨基酸(limiting aminoacid)的顺序如下蛋氨酸、赖氨酸和然后的苏氨酸。这表明了这些氨基酸对于最适营养具有重要作用并且必须以平衡比率存在于日常饮食中。
因此，为了避免氨基酸失调，必须对合成产品形式中有限氨基酸的特定剂量投以巨大的关注。这是因为添加一种必需氨基酸可刺激蛋白质消化，这可对排在第二或第三位的有限氨基酸引起特定缺陷。
因此，在添加额外剂量蛋氨酸(其在酪蛋白中是有限的)的酪蛋白为例的喂养试验中，已经观察到肝脏的脂肪变性并且仅在添加额外剂量色氨酸后便可消除。
因此，根据生物体的不同而平衡添加多种氨基酸对于高质量的人和动物食物是必需的。上述的发酵和其它合成方法通常使得有可能获得仅仅一种氨基酸。
本发明的目的是研发成本低而效益高的合成氨基酸的方法，其中所述氨基酸有利的是必需氨基酸L-赖氨酸和L-蛋氨酸，它们是2种最常见的有限氨基酸，优选地是L-蛋氨酸。
我们已经发现通过在转基因生物中制备氨基酸有利地为L-蛋氨酸的本发明方法达到了该目的，其中该方法包括以下步骤a)导入编码苏氨酸降解蛋白质和/或赖氨酸降解蛋白质的核酸序列，或者
b)在转基因生物中导入增加苏氨酸降解和/或赖氨酸降解的核酸序列，并且c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所提及的核酸序列。
苏氨酸降解蛋白质有利地是指以下蛋白质，诸如将苏氨酸转化为乙醛和甘氨酸的苏氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.5)或丝氨酸羟甲基转移酶(EC 2.1.2.1)、将苏氨酸转化为L-2-氨基乙酰乙酸并生成NADH+H+的苏氨酸脱氢酶、或者将苏氨酸转化为氧代丁酸盐并去除NH3和水的苏氨酸脱水酶。在本发明方法中苏氨酸醛缩酶有利地用作苏氨酸降解活性蛋白质。能够以多种方式提高上述蛋白质和/或其编码核酸序列的活性。核酸序列有利地在生物体中表达，并因此可以通过增加基因拷贝数和/或增加表达mRNA的稳定性和/或增加基因产物的稳定性来增加其活性。进一步的可能性是改变上述核酸序列的调控以至于增加基因的表达。这能够有利地通过异源调控序列或通过修饰例如通过突变天然存在的调控序列而实现。也能够将这两种有利的方法组合在一起。
本发明方法有利的实施方案是在转基因生物中制备氨基酸有利地是L-蛋氨酸的方法，该方法包括以下步骤a)导入编码苏氨酸降解蛋白质的核酸序列，该苏氨酸降解蛋白质包含以下共有序列H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G，或HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXGb)导入增加转基因生物中苏氨酸降解的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所述的核酸序列。
其中在共有序列中使用了单字母氨基酸代码。在X的位置可以存在任意氨基酸。

图1表示能够有利地用于本发明方法的苏氨酸醛缩酶共有序列。图1中所提及的蛋白质缩写及其登录号意思如下P1；T24108是来自秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的推定蛋白质R102.4b、Q87I10是预测的来自副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的L-别苏氨酸醛缩酶、GLY1_YEAST是来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(焙烤酵母)的低特异性L-苏氨酸醛缩酶、P1；T38302是来自稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的可能的苏氨酸醛缩酶、P1；E75410是来自耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)的L-别苏氨酸醛缩酶、Q9VCK6是指CG10184蛋白质并来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)、Q885J1是来自丁香假单孢菌(Pseudomonas syringae)的低特异性L-苏氨酸醛缩酶。P1；G83533是来自绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的推定蛋白质PA0902、Q83S08是来自弗氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)的预测的芳香基硫酸酯酶、P1；F64825是来自大肠杆菌(Escherichia coli)的L-别苏氨酸醛缩酶，P1；AF0608也是这样，它来自肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)。Q87HF4是来自副溶血性弧菌的L-别苏氨酸醛缩酶。下面的蛋白质也是L-别苏氨酸醛缩酶P1；E82418(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))、P1；T46877(简达气单胞菌(Aeromonas jandaei))、Q9M835(拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)；鼠耳草水芹(mouse-earcress))、Q8RCY7(腾冲高温厌氧杆菌(Thermoanaerobactertengcongensis))、P1；C72215(海栖热袍菌(Thermotoga maritima))、Q896G8(破伤风杆菌(Clostridium tetani))、P1；C84060(耐盐杆菌(Bacillushalodurans))。Q89N26是来自日本短根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的BII4016蛋白质。Q9X8S4是来自活动酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的低特异性L-苏氨酸醛缩酶、P1；D84395是来自盐杆菌属NRC-1种(Halobacterium sp.NRC-1)的L-别苏氨酸醛缩酶。CAA02484是来自PCT申请WO 94/25606的序列33。该序列来自肿囊弯颈霉(Tolypocladiuminflatum)。TOXG_COCCA是来自炭色旋孢腔菌(Cochliobolus carbonum)(玉米长蠕孢菌(Bipolaris zeicola))的丙氨酸消旋酶TOXG，P1；AF1474来自无害李斯特氏菌(Listeria innocua)并且是低特异性L-别苏氨酸醛缩酶。
赖氨酸降解蛋白质有利地是指以下蛋白质，诸如赖氨酸脱羧酶(EC4.1.1.18)、L-赖氨酸6-单加氧酶(EC 1.14.13.59)、L-赖氨酸2-单加氧酶(EC1.13.12.2)、赖氨酸酮戊二酸还原酶(EC 1.5.1.7)或赖氨酸2，3-氨基变位酶(EC 5.4.3.2)，它们将L-赖氨酸转化为尸胺、N6-羟基-L-赖氨酸、5-氨基戊酰胺、酵母氨酸或(3S)-3，6-氨基己酸。有利地用于本发明方法的赖氨酸降解活性是单独的赖氨酸脱羧酸活性或与苏氨酸降解活性有利地为苏氨酸醛缩酶的组合。能够以多种方式提高上述蛋白质和/或其编码核酸序列的活性。核酸序列有利地在生物体中表达，并因此可以通过增加基因拷贝数和/或增加表达mRNA的稳定性和/或增加基因产物的稳定性来增加其活性。进一步的可能性是改变上述核酸序列的调控以至于改变基因的表达，从而增加基因的表达。这能够有利地通过异源调控序列或通过修饰例如通过突变天然存在的调控序列而实现。也能够将这两种有利的方法组合在一起。
本发明方法一个有利的实施方案是在转基因生物中制备氨基酸有利地是L-蛋氨酸的方法，该方法包括以下步骤a)导入编码赖氨酸降解蛋白质的核酸序列，该苏氨酸降解蛋白质包含以下共有序列G[X]4GIM[X]45M[X]2RK[X]2M[X]11GGXG[X]3E[X]2E[X]3W，或LG[X]9LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE[X]2E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14Fb)导入增加转基因生物中赖氨酸降解的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所述的核酸序列。
其中在共有序列中使用了单字母氨基酸代码。在X的位置可以存在任意氨基酸。图2表示能够有利地用于本发明方法的赖氨酸降解蛋白质的共有序列。图2中所列出的氨基酸序列进行了编号(1、2、3等)并表示以下蛋白质的缩写或其登录号Q871Q6[2]是来自粗糙脉孢菌(Neurospa crassa)的推定蛋白质。Q815T3[3]是来自蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的赖氨酸脱羧酶。Q81XE4[4]编码来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的推定蛋白质，同样P1；D70033[5]编码来自枯草芽胞杆菌(Baccillus subtilis)的推定蛋白质。Q8H7U8[6]是来自稻(Oryza sativa)的预测赖氨酸脱羧酶。Q8L8B8[7]编码来自拟南芥菜的推定蛋白质。Q8XXM6[8]也是来自青枯雷尔菌(Ralstonia solanacearum)的推定蛋白质。以下蛋白质也是推定蛋白质Q88DF4[9](恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida))、P1；A83031[10](绿脓假单胞菌)、Q8PAJ9[11](野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris))和Q8PMA0[12](地毯草黄单胞菌(Xanthomonasaxonopodis))。Q8NN34[13]编码来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的受保护Rossmann折叠核苷酸结合蛋白质(片段1)。P1；AI3438 [14]编码来自羊流产布氏杆菌(Brucella melitensis)的赖氨酸脱羧酶。Q8G289[15]编码来自猪流产布氏杆菌(Brucella suis)的推定蛋白质，Q984W8[16](百脉根根瘤菌(Rhizobium loti))与此相同。P1；B97490[17]是来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的赖氨酸脱羧酶。P1；B83993[18]也编码来自耐盐杆菌的赖氨酸脱羧酶。Q8A2T1[19]是假想的来自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的预测赖氨酸脱羧酶。以下蛋白质编码推定蛋白质Q92R13[20](草木犀根瘤菌(Rhizobiummeliloti))、Q8ETC2[21](Oceanobacillus iheyensis)、Q8NXQ6[22](金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、Q8CTK0[23](真皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis))和P1；F55578[24](聚集红球菌(Rhodococcus fascians))。Q839D0[25]编码来自粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的脱羧酶家族蛋白质。P1；D84035[26]是来自耐盐杆菌的推定蛋白质。Q8EZ03[27]是来自问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)的赖氨酸脱羧酶。Q89NP4[28]是来自日本短根瘤菌的推定蛋白质，Q8RFZ1[29](具核梭杆菌(Fusobacterium nucleotum))与其相同。方括弧内的数字表示图2中所示的编号并因此而表示蛋白质的序列。有利地用于本发明方法的克隆YJL055w的编号为1。共有序列示于编号30中。
在本方法的另一个实施方案中，是用于在转基因生物中制备氨基酸有利地是L-蛋氨酸的方法，该方法包括以下步骤a)导入编码苏氨酸降解蛋白质的核酸序列，该序列包含以下共有序列H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G，或
HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG并且导入编码赖氨酸降解蛋白质的核酸序列，该序列包含以下共有序列G[X]4GIM[X]45M[X]2RK[X]2M[X]11GGXG[X]3E[X]2E[X]3W，或LG[X]9LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE[X]2E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F，或者b)导入编码增加转基因生物中苏氨酸降解和赖氨酸降解的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所述的核酸序列。
在用于在转基因生物中制备氨基酸优选地为L-蛋氨酸方法的一个优选的实施方案中，该方法包括在上述方法步骤(a)中导入这样的核酸序列，所述序列选自以下核酸序列i)具有SEQ ID NO1；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中所描述序列的核酸序列；ii)通过SEQ ID NO2；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ IDNO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中所描述的氨基酸序列反向翻译的由于遗传密码简并性而获得的核酸序列，和iii)SEQ ID NO1；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中所描述的核酸序列的衍生序列；该序列编码在氨基酸水平与SEQ ID NO2；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24或SEQID NO26中所描述的氨基酸序列具有至少50％同源性的多肽并在多肽的生物学活性方面具有可忽略的降低；以及随后在转基因生物中表达这些核酸序列。
在转基因生物中制备氨基酸优选地为L-蛋氨酸的方法的更加优选的实施方案是这样的方法，其中在上述方法步骤(a)或(b)中，三者相互组合或与其它能够增加转基因生物中L-赖氨酸和/或L-苏氨酸合成的核酸序列相组合。除了编码中心代谢物例如在糖酵解或柠檬酸循环中对诸如葡萄糖的糖利用的基因以外，这些基因还包括起始于天冬氨酸，并参与氨基酸合成的基因。
因此，该在转基因生物中制备氨基酸优选地为L-蛋氨酸方法的优选实施方案显示如下a)导入选自以下的核酸序列i)具有SEQ ID NO1；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23和/或SEQ ID NO25中所描述序列的核酸序列；ii)通过SEQ ID NO2；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24和/或SEQ ID NO26中所描述的氨基酸序列反向翻译的由于遗传密码简并性而获得的核酸序列，和iii)SEQ ID NO1；SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23和/或SEQ ID NO25中所描述的核酸序列的衍生序列；该序列编码在氨基酸水平与SEQ ID NO2；SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中所描述的氨基酸序列具有至少50％同源性的多肽并在多肽的生物学活性方面具有可忽略的降低；以及b)在转基因生物中表达(a)中所述核酸序列。
在转基因生物中制备氨基酸优选地为L-蛋氨酸的方法的更加优选的实施方案是这样的方法，该方法包括在上述步骤(a)中导入一条或多条选自以下核酸序列的核酸序列
i)通过反向翻译SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中所描述氨基酸序列的由于遗传密码简并性而获得的核酸序列；ii)核酸序列的衍生物，它是通过反向翻译SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQID NO9或SEQ ID NO10中所描述的氨基酸序列所获得的并且在氨基酸水平上与上述氨基酸序列具有至少70％同源性，多肽生物活性具有可忽略的降低；以及随后在转基因生物中表达这些核酸序列。
当导入并表达用于本发明方法的核酸序列之后，转基因生物有利地进行培养并随后进行收获。当转基因生物是微生物，例如真核生物诸如真菌、藻类、酵母、或者原核生物诸如细菌，如埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属、棒杆菌属或短杆菌属的细菌，将后者培养于技术人员已知并通常用于特定生物的固体或液体培养基中。培养之后，根据需要收获生物体。然后氨基酸能够直接进一步加工于人或动物的食物中或者对于其它应用，例如如此处引用作为参考的EP-B-0 533 039或EP-A-0 615 693中所述，或者进行进一步纯化，以常规的方法通过提取和沉淀或结晶或在离子交换器上纯化或者这些方法的组合。这些多种平台的产物是仍然以多种量含有氨基酸或氨基酸组成成分的发酵液和细胞，有利地在0-100％重量范围内，优选地为从1-80％重量，特别优选地为5-50％重量之间，非常特别优选地为5-40％重量之间。
在本发明优选的实施方案中，生物是其氨基酸含量通过导入核酸序列而进行了有利修饰的植物。这对于植物育种者而言是重要的，因为，例如，对于单胃动物而言植物的营养价值受到某些必需氨基酸诸如赖氨酸或蛋氨酸的限制。苏氨酸也在该关系中具有重要作用。导入用于本发明方法的核酸或核酸组合物之后，以该种方式产生的这种转基因植物生长在或生长于营养培养基或固体培养基中，例如固体培养并随后收获。然后植物能够直接用作人或动物食物，或进行进一步加工。在这种情况下也可能以常规方式通过提取、结晶和/或沉淀或在离子交换器上纯化或这些方法的组合进一步纯化氨基酸。这些多种平台的产物是仍然以多种量含有氨基酸或氨基酸组成成分的植物，有利地在0-100％重量范围内，优选地为从20-80％重量，特别优选地为50-90％重量之间，非常特别优选地为80-99％重量之间。优选地是立即使用植物而不进行进一步的加工。
在本发明进一步实施方案中，生物体是微生物，诸如棒杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属或芽孢杆菌属的细菌。棒杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属和芽孢杆菌属的微生物是优选使用的。这些微生物有利地用于发酵方法。
除了SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23和/或SEQ ID NO25中所述的序列、能够从序列SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10得到的核酸序列或者其衍生物之外，对其它在生物体中表达或突变的基因也是有利的。至少一个L-赖氨酸、L-苏氨酸和/或L-蛋氨酸生物合成途径的其它基因额外表达于诸如植物或微生物的生物体中，和/或其调控已经修饰以进行表达的基因是特别有利的。已经以此种方式修饰了天然基因的调控从而使该基因和/或其基因产物不再受生物体中控制系统的控制也是可能的和有利的。由于，例如，反馈调控不再存在或不再以相同的程度存在，这导致预期氨基酸合成增强。本发明的方法有利地产生氨基酸，诸如L-赖氨酸、L-苏氨酸和/或L-蛋氨酸，优选地为L-蛋氨酸。
因此，在本发明方法的进一步实施方案中，生物体是生长的，优选地是棒杆菌属、短杆菌属、芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌或植物，其中同时过量表达至少一种核酸或编码选自以下基因产物的蛋白质的基因之一，基因产物包括天冬氨酸激酶(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰转移酶、N-琥珀酰-L-二氨基庚二酸谷氨酸转氨基酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶、二氨基庚二酸脱羧酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶(gap)、3-磷酸甘油酸酯激酶(pgk)、丙酮酸羧化酶(pyc)、磷酸丙糖异构酶(tpi)、高丝氨酸O-乙酰转移酶(metA)、胱硫醚γ-合酶(metB)、胱硫醚γ-裂解酶(metC)、胱硫醚β-裂解酶、蛋氨酸合酶(metH)、丝氨酸羟甲基转移酶(glyA)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(metY)、亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)、磷丝氨酸氨基转换酶(serC)、磷丝氨酸磷酸酶(serB)、丝氨酸乙酰转移酶(cysE)、半胱氨酸合酶(cysK)、高丝氨酸脱氢酶(hom)、高丝氨酸激酶、高胱氨酸S-甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸合酶(metX)。
在本发明方法另一个优选的实施方案中，用于本方法的生物体是那些其中至少一个上述基因或上述核酸之一同时发生突变从而使相应蛋白质的活性与未突变蛋白质相比受到代谢产物较小程度的影响或不受影响，并且尤其是这并不损害氨基酸根据本发明方法的产量，或者以至于使其特异酶活性增加。较小的影响在上下文中意思是与起始生物体相比，酶活性的调控即通过代谢产物影响酶活性减小至少10％、优选地为至少20、30或40％，特别优选地为至少50、60或70％，并因此使酶活性与起始生物体相比以上述这些数字程度增加。酶活性的增加意思是指与起始生物体相比酶活性增加至少10％、优选地为至少20、30或40％，特别优选地为至少50、60或70％。这导致一种目的氨基酸或多种目的氨基酸的产量增加。
在本发明方法另一个优选的实施方案中，用于本方法的生物体是那些其中至少一个编码选自以下酶活性的基因同时减弱尤其是通过降低相应基因的表达率的生物体，其中酶活性选自高丝氨酸激酶(thrB)、苏氨酸脱水酶(ilvA)、苏氨酸合酶(thrC)、内消旋二氨基庚二酸D-脱氢酶(ddh)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck)、葡萄糖-6-磷酸6-异构酶(pgi)、丙酮酸氧化酶(poxB)、二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)和二氨基吡啶甲酸脱羧酶(lysA)。
在本发明方法的另一个实施方案中，用于本方法的生物体是那些其中至少一种上述核酸或至少一种上述基因同时突变，以此种方式使相应蛋白质的酶活性部分降低或完全阻滞的生物体。酶活性的降低意思是指与起始生物体相比酶活性降低至少10％，优选地为至少20、30或40％，特别优选地为至少50、60或70％。
以反应速率降低或增加或者改变(降低或增加)对底物的亲和力方式能够影响酶活性。
棒杆菌属或短杆菌属的微生物或植物优选地应用于本发明方法。
通过上述方法也有可能制备化学纯的氨基酸或氨基酸组合物。为了该目的，以已知的方式，从诸如微生物或植物的生物体或生物体生长在其内或其上的培养基中，或者从生物体和培养基中分离这些氨基酸或氨基酸组合物。这些化学纯氨基酸或氨基酸组合物优选地应用于食品工业、化妆品工业或药品工业领域。
氨基酸，诸如蛋氨酸、赖氨酸或其混合物，优选地为蛋氨酸，优选地是通过本发明方法制备的。
此外，在本发明方法中，与野生型生物体相比，有可能以至少3倍，优选地以至少5倍，特别优选地以至少10倍，非常特别优选地以至少50倍增加上述氨基酸。如果组合使用编码苏氨酸醛缩酶或苏氨酸醛缩酶样蛋白质或赖氨酸脱羧酶或赖氨酸脱羧酶样蛋白质，对于本发明方法中氨基酸产量具有特别有利的作用。
通过本发明方法基本上能够以两种方式增加在用于本方法的生物体中制备的氨基酸。在蛋白质中增加通过本方法制备的游离氨基酸库和/或一定比例的氨基酸可能是有利的。本发明的方法有利地增加转基因生物中游离氨基酸库。在优选的微生物发酵的例子中，氨基酸在培养基中富集。
所有能够合成蛋氨酸和/或赖氨酸的真核或原核生物都原则上适用于本发明的方法。用于本方法的生物体优选地为诸如细菌、真菌、酵母或藻类的微生物或者诸如双子叶或单子叶植物的植物，诸如槭树科(Aceraceae)、漆树科(Anacardiaceae)、伞形科(Apiaceae)、紫菀科(Asteraceae)、芸苔科(Brassicaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、忍冬科(Caprifolaceae)、茜草科(Rubiaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、蓼科(Polygonaceae)、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)的植物，优选地为选自伞形科、紫菀科、芸苔科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。
用于本发明方法的优选的转基因微生物是例如诸如麦角菌属(Claviceps)或曲霉属(Aspergillus)真菌或诸如芽孢杆菌属、棒杆菌属、微球菌属(Micrococcus)、短杆菌属、红球菌属(Rhodococcus)、诺卡氏菌属(Nocardia)、乳酪杆菌属(Caseobacter)或节杆菌属(Arthrobacter)的革兰阳性菌或者诸如埃希氏菌属、黄杆菌属(Flavobacterium)或沙门氏菌属的革兰阴性菌或者诸如红酵母属(Rhodotorula)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)的酵母。特别优选的生物体选自棒杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、沙门氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属、红酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、麦角菌属或黄杆菌属。非常特别优选的用于本发明方法的微生物选自以下属和物种异常汉森酵母(Hansenula anomala)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、麦角菌(Claviceps purpurea)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、芽孢杆菌属的种、白短杆菌(Brevibacterium albidum)、Brevibacterium album、多角短杆菌(Brevibacterium cerinum)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、产谷氨酸短杆菌(Brevibacterium glutamigenes)、碘短杆菌(Brevibacteriumiodinum)、酮式谷氨酸短杆菌(Brevibacterium ketoglutamicum)、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、扩展短杆菌(Brevibacteriumlinens)、粉红短杆菌(Brevibacterium roseum)、解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)、短杆菌属的种、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)、乙酰谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)、谷氨酸棒杆菌(＝谷氨酸微球菌(Micrococcusglutamicum))、栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)、棒杆菌属的种或大肠杆菌，尤其是大肠杆菌K12和大肠杆菌的经描述菌株。
用于本发明方法的优选的转基因植物选自一组有用的植物。植物选自诸如花生(peanut)、油菜籽(oilseed rape)、卡诺拉油菜(canola)、向日葵(sunflower)、红花(safflower)、橄榄(olive)、芝麻(sesame)、榛子(hazelnut)、苦扁桃(almond)、酪梨(avocado)、月桂树(bay)、西葫芦(pumpkin)、亚麻(flax)、大豆(soybean)、阿月浑子树(pistachio)、琉璃苣(borage)、玉米(corn)、小麦(wheat)、黑麦(rye)、燕麦(oats)、谷子(millet)、黑小麦(triticale)、稻(rice)、大麦(barley)、木薯(cassava)、马铃薯(potato)、甜菜(sugar beet)、食用甜菜(feedbeet)、茄子(aubergine)和多年生草本植物和食用作物、油椰(oil palm)、蔬菜(芸苔(brassicas)、根类、根茎类、豆类、果实、蔬菜、球茎、叶和茎类蔬菜)、荞麦(buckwheat)、菊芋(Jerusalem artichoke)、蚕豆(broad bean)、巢菜(vetches)、扁豆(lentil)、矮黄豆(dwarf bean)、紫花苜蓿(alfalfa)、羽扇豆(lupin)、三叶草(clover)和苜蓿(lucerne)。
用于本方法在转基因生物体中制备氨基酸的核酸序列优选地来自真核生物(复数意思包括单数，反之亦然)，但是也可以来自原核生物，诸如选自以下属的细菌短杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属或肠杆菌属。核酸序列优选地来自诸如选自以下植物科的植物槭树科、漆树科、伞形科、芸苔科、紫菀科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、忍冬科、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科，优选地为选自伞形科、紫菀科、芸苔科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物，诸如曲霉属、青霉属(Penicillium)或麦角菌属的真菌或者诸如毕赤酵母属(Pichia)、球拟酵母属(Torulopsis)、汉逊酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、假丝酵母属、红酵母属或酵母属的酵母。序列特别优选地来自诸如毕赤酵母属、球拟酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、假丝酵母属、红酵母属或酵母属的酵母，非常特别优选地来自酵母菌科的酵母，诸如优选的酵母属并且特别优选的酿酒酵母。
用于本发明并具有序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO13和/或SEQ IDNO15的核酸序列编码苏氨酸醛缩酶。该醛缩酶(SEQ ID NO1)与来自棉阿舒囊霉(A.gossypii)[阿氏假囊酵母菌(Eremothecium ashbii)，棉假囊酵母菌(Eremothecium gossypii)]的GLY1蛋白质呈现最高的同源性(EMBL数据库登录号AJ005442、CAA06545.1、GENSEQ_PROTAAY25338，在氨基酸水平与SEQ ID NO1呈现76％的同一性)。与来自稻、大豆、小麦并公布于US 2002123118 A1的苏氨酸醛缩酶也具有高度的同源性。此外还可能发现与大量核酸具有同源性。苏氨酸醛缩酶来自酵母诸如白色假丝酵母(Candida albicans)(EMBL数据库登录号AF009967、AAB64198.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有56％同一性)、来自稷酒裂殖酵母(EMBL数据库登录号Z99163、CAB16235.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有49％同一性)，或者来自细菌诸如简达气单胞菌(EMBL数据库登录号No.AF169478，AAD47837.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有41％同一性)、绿脓假单胞菌(EMBL数据库登录号No.AF011922，AAC46016.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有38％同一性)、霍乱弧菌(EMBL数据库登录号No.AE004405，AAF96663.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有38％同一性)、大肠杆菌(EMBL数据库登录号No.AB005050，BAA20882.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有38％同一性)、耐辐射奇异球菌(EMBL数据库登录号No.AE001978，AAF10885.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有38％同一性)、耐盐芽孢杆菌(EMBL数据库登录号No.AP001518，BAB07002.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有34％同一性)、盐杆菌属的种(EMBL数据库登录号No.AE005124，AAG20528.1)、海栖热袍菌(EMBL数据库登录号No.AE001813，AAD36809.1，在氨基酸水平与SEQID NO1具有40％同一性)或植物拟南芥菜(EMBL数据库登录号No.AF325033、AAG40385.1、AC022287、AAF63783.1、AC003981、AAC14037.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1分别具有40、42或37％同一性)或来自非人类动物诸如秀丽隐杆线虫(EMBL数据库登录号No.Z70309，CAA94358.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有41％同一性)或黑腹果蝇(EMBL数据库登录号No.AE003744，AAF56152.1，在氨基酸水平与SEQID NO1具有39％同一性)，或者丙氨酸消旋酶，来自真菌诸如炭色旋孢腔菌/玉米长蠕孢菌(EMBL数据库登录号No.AF169478，AAD47837.1，在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有38％同一性)。因此用于本发明方法的核酸序列和所编码蛋白质优选的是来自假丝酵母属、汉逊酵母属、红酵母属、裂殖酵母属或酵母属的酵母。此外，优选地用于本发明方法的醛缩酶与SEQID NO3(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有35％同一性)、SEQ ID NO4(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有35％同一性)、SEQ ID NO5(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有27％同一性)、SEQ ID NO6(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有43％同一性)、SEQ ID NO7(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有39％同一性)、SEQ ID NO8(在氨基酸水平与SEQ IDNO1具有32％同一性)、SEQ ID NO9(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有35％同一性)或SEQ ID NO10(在氨基酸水平与SEQ ID NO1具有36％同一性)中所述序列和来自大豆(SEQ ID NO3-5)、稻(SEQ ID NO6和7)和卡诺拉油菜(SEQ ID NO8-10)呈现高同一性。用于本方法的核酸序列可能且优选地来自氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ IDNO9或SEQ ID NO10。
用于本发明方法并具有序列SEQ ID NO11、SEQ ID NO17、SEQ IDNO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的核酸序列及其衍生物编码赖氨酸脱羧酶或赖氨酸脱羧酶样蛋白质。优选的赖氨酸脱羧酶(SEQ ID NO11)与来自粗糙脉孢菌(Neurospora crasa)的蛋白质(EMBL数据库登录号No.TREMBL_NEWCAD70937，在氨基酸水平与SEQ IDNO11最大长度231个氨基酸＝AA具有45％同一性)呈现最高同一性。赖氨酸脱羧酶来自稻(Oryza sative)(EMBL数据库登录号No.SPTREMBLQ9FWG6，TREMBL_NEWAAO19380，在氨基酸水平与SEQID NO11分别呈现41％和37％同一性)和来自拟南芥菜的蛋白质(EMBL数据库登录号No.SPTREMBLQ9ASW6，PIRT45885，SPTREMBLQ9FNH8，PIRH84789，PIRT48348，SPTREMBLQ9FYM7，PIRT48554，PIRT04966和PIR，在氨基酸水平与SEQ ID NO11分别呈现42％、42％、41％、39％、39％、39％、39％、39％和35％同一性)或者来自细菌诸如青枯雷尔菌[＝青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)](EMBL数据库登录号No.SPTREMBLQ8XXM6，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现43％同一性)、恶臭假单胞菌(EMBL数据库登录号No.TREMBL_NEWAAN70440，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现40％同一性)、绿脓假单胞菌(EMBL数据库登录号No.PIRA83031，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现40％同一性)、多形拟杆菌(EMBL数据库登录号No.TREMBL_NEWAAO78330，在氨基酸水平与SEQ IDNO11呈现39％同一性)、羊流产布氏杆菌(EMBL数据库登录号No.PIRAI3438，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现43％同一性)、枯草芽孢杆菌(EMBL数据库登录号No.PIRD70033，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现36％同一性)、百脉根瘤菌(Rhizobium loti)或苜蓿根瘤菌(Rhisobium meliloti)(EMBL数据库登录号No.STREMBLQ984W8或STREMBLQ92R13，在氨基酸水平与SEQ ID NO11分别呈现39％和36％同一性)、耐盐芽孢杆菌(EMBL数据库登录号No.PIRB83993，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现37％同一性)、根瘤农杆菌(EMBL数据库登录号No.PIRAI2707或PIRB97490，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现41％同一性)、金黄色葡萄球菌(EMBL数据库登录号No.PIRA89839，在氨基酸水平与SEQ ID NO11呈现34％同一性)，也与根据本发明使用的赖氨酸脱羧酶序列SEQ ID NO11呈现同源性。因此优选的是用于本发明方法的核酸序列和其编码的蛋白质来自假丝酵母属、汉逊酵母属、红酵母属、裂殖酵母属或酵母属的酵母。此外，优选的用于本发明方法的赖氨酸脱羧酶还与来自油菜籽、稻和玉米的序列SEQ ID NO21(在氨基酸水平上与SEQ ID NO11呈现42％同一性)、SEQ ID NO23(在氨基酸水平上与SEQ ID NO11呈现43％同一性)或SEQ ID NO25(在氨基酸水平上与SEQ ID NO11呈现37％同一性)呈现高同一性。用于本方法的核酸序列可有利地衍生自氨基酸序列SEQ ID NO11、SEQ ID NO17、SEQ IDNO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25并具有赖氨酸脱羧酶活性。
优选的用于本发明方法并编码具有苏氨酸醛缩酶活性或赖氨酸脱羧酶活性的核酸序列能够在通常可进入的数据库中发现。在此上下文中特别提及通用基因数据库例如EMBL数据库(Stoesser G.等，Nucleic Acids Res2001，29卷，17-21)、GenBank数据库(Benson D.A.等，Nucleic Acids Res2000，Vol.28，15-18)或PIR数据库(Barker W.C.等，Nucleic Acids Res.1999，Vol.27，39-43)。
此外也可使用生物体特异的基因数据库以发现有利的序列，例如对于酵母优选地为SGD数据库(Cherry J.M.等，Nucleic Acids Res.1998，Vol.26，73-80)或MIPS数据库(Mewes H.W.等，Nucleic Acids Res.1999，Vol.27，44-48)，对于大肠杆菌优选地为GenProtEC数据库(http//web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)，对于拟南芥为TAIR数据库(Huala，E.等，Nucleic Acids Res.2001 Vol.29(1)，102-5)或MIPS数据库。
为了改善本方法的转基因生物体中核酸序列的导入和序列的表达，将核酸序列插入核酸构建体和/或载体。除了上述用于本发明方法的序列，其它核酸序列，优选地为本方法产生的氨基酸的生物合成基因，可以存在于核酸构建体中或载体中并一起插入到生物体中。然而，这些额外的序列也可以直接插入或通过其它独立的核酸构建体或载体插入到生物体。将编码苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶的基因单独或组合导入生物体优选地导入微生物或植物是有利的。
用于本发明方法的核酸序列是编码具有苏氨酸醛缩酶活性或赖氨酸脱羧酶活性的多肽的经分离核酸序列。
核酸在本发明方法中意思是指DNA或RNA序列，它们可以是单链或双链或者，根据需要，可以含有能够掺入DNA或RNA的合成的、非天然的或修饰的核苷酸碱基。
术语“表达”意思是指编码基因片段或基因的转录和/或翻译。所得到的产物通常是蛋白质。然而，产物也包括功能性RNA，例如核酶。表达可以在全身或在局部发生，例如限于特定细胞类型、组织或器官。
用于本发明方法的核酸例如编码性基因片段(ORF)及其调控元件的表达产物，能够根据其功能进行表征。此处包括，例如，在代谢、能量、转录、蛋白质合成、蛋白质加工、细胞转运和转运机制、细胞通讯和信号转导、细胞救援、细胞防御和细胞毒性、细胞环境调节和细胞与其环境的相互作用、细胞命运、转位因子、病毒蛋白质和质粒蛋白质、细胞组织监测、亚细胞定位、蛋白质活性调节、具有结合功能蛋白质或辅助因子需求和转运促进领域中具有的功能。相同功能的基因组合在一起成为所谓的功能基因家族。
通过作用于用于本发明方法并编码具有苏氨酸醛缩酶活性或赖氨酸脱羧酶活性的多肽的核酸的生物学活性有可能改善和/或增加所制备的不同氨基酸及其制备物。根据对本发明方法所用生物体的筛选，例如微生物或植物，能够制备多种氨基酸的混合物。在本发明方法中有L-赖氨酸和/或L-蛋氨酸作为氨基酸或氨基酸混合物的优选制备方法。L-蛋氨酸是本方法中特别优选地制备的。这些制备的氨基酸可以作为游离氨基酸或结合入蛋白质而存在于转基因生物体的细胞中。
本发明方法中转基因生物当涉及植物时意思是指进行生长以制备氨基酸的植物细胞、组织、诸如根、芽、茎、种子、花、块茎或叶的器官或者完整植株。生长意思是指，例如，在营养培养基上或营养培养基中培养转基因植物细胞、组织或器官或者在基质例如水栽培物中、花盆土壤或田地上或基质内培养完整植株。
如果植物被选择作为本发明方法中的供体生物体，原则上该植物有可能与受体植物具有任意系统发生关系。因此，供体和受体植物可以属于相同的科、属、种、变种或品系，且所整合核酸序列和受体植物基因组相应部分之间的同源性增加。在微生物作为供体和受体生物体时也同样适用。
用于本发明方法的核酸序列优选的是具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23和/或SEQ ID NO25中所描述的序列、来自氨基酸序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的核酸序列或者编码仍然具有酶活性或生物学活性的多肽的其衍生物或同源序列。这些序列单独或组合克隆入表达构建体。这些表达构建体使得本发明方法中所产生的氨基酸发生最佳合成。
在优选的实施方案中，该方法另外还包括获得包含用于本方法并编码具有苏氨酸醛缩酶活性或赖氨酸脱羧酶活性的酶的核酸序列的细胞的步骤，其中细胞用核酸序列、基因构件体(＝核酸构建体)或载体进行转化，这引起醛缩酶或脱羧酶核酸单独表达或与其它基因或序列组合表达。在更加优选的实施方案中该方法还包括从培养物和/或生物体获得氨基酸或氨基酸混合物的步骤。以这种方式制备的细胞，优选的是与上述一样有利的植物的细胞或微生物的细胞。
诸如植物或转基因微生物的转基因生物意思是指在生物体的基因组中为了本发明的目的用于本方法的核酸不位于其天然的位点，并且所表达的核酸可能是同源表达或异源表达。然而，转基因也是指在生物体的基因组中本发明的核酸位于其天然位置，但是与天然序列相比该序列已经进行了修饰和/或天然序列的调控序列已经进行了修饰。转基因优选的是指用于本发明方法的核酸在基因组中非天然位置的表达，即可以是核酸的同源或优选的是异源表达。而且表达可以瞬时发生，或者从稳定整合于基因组的序列进行表达。优选的转基因植物是，例如，选自以下科的植物槭树科、漆树科、伞形科、紫菀科、芸苔科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、忍冬科、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科，优选地为选自以下科的植物伞形科、紫菀科、芸苔科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科。更加有利的优选的是选自以下属的有用植物花生、油菜籽、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、杏树、鳄梨树、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、茄子、紫花苜蓿和多年生草本植物和食用谷类、油椰、蔬菜(芸苔、根类、根茎类、豆类、果实、蔬菜、球茎、叶和茎类蔬菜)、荞麦、菊芋、蚕豆、巢菜、扁豆、矮黄豆、羽扇豆、三叶草和苜蓿。
所使用的术语“转基因植物”根据本发明也指转基因植物的后代，例如T1-、T2-、T3-和随后的植物后代或者BC1-、BC2-、BC3-和随后的植物后代。因此，本发明的转基因植物能够生长并与自身或其它个体杂交以得到本发明其他转基因植物。转基因植物还能够通过无性繁殖转基因植物细胞获得。本发明还涉及可来源于根据本发明的转基因植物的群体的转基因植物材料。该转基因植物材料包括植物细胞和某些组织、器官和所有其展现出来的植物部分，例如种子、叶、花药、纤维、根毛、茎、胚胎、愈伤组织、胎盘母面绒毛小叶、叶柄、收获物、植物组织、再生组织和细胞培养物，其来自真正转基因植物和/或能够用于产生转基因植物。
含有本发明方法中合成的氨基酸的转基因植物能够直接投入市场而无需分离所合成的化合物。植物意思是指本发明方法中所有植物部分、诸如叶、茎、根茎或种子的植物器官或者完整植株。种子在本文中包括所有种子部分，诸如种子外壳、表皮和种子细胞、胚乳或胚组织。然而，本发明方法中制备的氨基酸或者优选制备的氨基酸L-蛋氨酸也可以从这些植物以其游离氨基酸或结合入蛋白质的形式分离得到。通过从其生长的培养物中或者从田地中收获生物体能够收获通过本方法制备的氨基酸。通过对植物部分，优选的为植物种子、果实、块茎等等，进行压榨、碾磨和/或提取、盐沉淀和/或离子交换层析能够进行收获。
以该方式有可能分离多于50％重量，有利的为多于60％重量，优选的为多于70％重量，特别优选的是多于80％重量，非常特别优选的是多于90％重量的本方法中制备的氨基酸。然后以该种方式获得的氨基酸能够进一步进行纯化，如果期望能够与其它活性成分，诸如维生素、氨基酸、糖类、抗生素等混合并且如果适当能够制成制剂。
根据本发明进一步的实施方案是本发明方法中所制备的氨基酸或转基因生物体用于动物或人食物、化妆品或药物的用途。
用于本方法的核酸在导入植物细胞或植物后可位于质粒基因组中或者优选地整合入宿主细胞基因组，并且瞬时表达是可能的，并能够有利的被使用。通过诸如用重组病毒进行病毒感染而生产也是可能的，并且在这种情况下，优选的增加单个基因或者多个基因的表达。当整合入基因组时，整合可以是随机的或通过重组而发生，以致于使导入的拷贝代替天然基因，从而调解细胞目的化合物的产生，或者通过反式使用基因以致于这些基因功能性地连接于功能表达单元，该单元包含至少一个保证该基因表达的序列和至少一个保证功能性转录基因的多聚腺苷酸化的序列。通过多重表达盒或构建体有利地将核酸导入植物以进行基因的多平行表达。在进一步优选的实施方案中，将单一表达盒或单一构建体即不含其它不同的核酸序列中的核酸序列导入植物。优选地导入异源核酸序列。
通过在植物和植物转化体中使用克隆载体诸如在植物分子生物学和生物技术(CRC出版社，Boca Raton，Florida)，第6/7章，71-119页(1993)；F.F.White，用于高等植物中基因转移的载体；在转基因植物，第1卷，工程和应用，Kung和R.Wu编辑，学术出版社，1993一书中的15-38；B.Jenes等，基因转移技术，在转基因植物，第1卷，工程和应用，Kung和R.Wu编辑，学术出版社(1993)一书中的128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225中所公开和引用的那些克隆载体使得有可能使用核酸遗传操作多种植物从而使后者成为更好或更有效的本发明方法所制备氨基酸的生产者。通过该操作的直接作用或该操作的间接作用能够引起改善氨基酸或由其衍生的产物例如经修饰蛋白质的产生或产生的有效性。
存在大量基于修饰蛋白质的机制，通过这些机制对用于本发明方法的苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶蛋白质的修饰能够直接影响来自转基因植物或诸如酵母、真菌或细菌的微生物之一的氨基酸的产量、产生和/或产生效率。能够增加苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶蛋白质或基因的数量或活性以至于该酶活性导致大量目的蛋白质重新制备，因为在导入相应基因之前生物体缺乏例如所导入酶的活性并因此缺乏提高生物合成能力。然而，天然存在于生物体内的基因的表达也能够提高，如通过一种基因的修饰调节，或者mRNA的稳定性或基因产物的稳定性，即醛缩酶或脱羧酶的稳定性，其表达得以提高。相应的陈述适用于与其它用于从生物合成代谢中合成氨基酸的酶相组合。多种不同序列即在DNA水平上不同的那些序列的使用在本上下文中也是有利的，或使用用于基因表达的启动子，使在不同时间的基因表达成为可能。
通过将一种苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶或多种醛缩酶和/或脱羧酶基因单独或与其他基因组合导入生物体不仅有可能增加流向最终产物的生物合成，而且可增加、改变或从头产生生物体中存在的产物组合物。如下所述，而且有可能增加氨基酸生物合成所必需的细胞营养物的输入和输出中其他基因的数量或活性，以致于这些前体、辅助因子或中间体在细胞内或储存腔室内的浓度增加，从而进一步增加细胞产生氨基酸的能力。通过最适化活性或增加苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶核酸序列和/或其他参与氨基酸生物合成的基因的数量，或者通过破坏参与氨基酸降解的一个或多个基因的活性能够增加诸如植物或微生物的宿主生物体中氨基酸的产量、产生和/或产生效率。
通过这种代谢的影响有可能在本发明方法中制备其他含有至少一个共价结合的硫原子的含硫化合物。此类化合物的例子除了蛋氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、半胱氨酸、优选的为蛋氨酸和S-腺苷蛋氨酸。对于本发明的目的，术语“L-蛋氨酸”、“蛋氨酸”、“高半胱氨酸”和“S-腺苷蛋氨酸”也包括相应的盐，例如蛋氨酸盐酸盐或蛋氨酸硫酸盐。术语蛋氨酸或苏氨酸也用于包括术语L-蛋氨酸或L-苏氨酸。还包括其中本方法中所制备的蛋氨酸是结合的蛋白质。
用于本发明方法的经分离核酸序列编码蛋白质或其部分，其中多个蛋白质或个别蛋白质或其部分包含与序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的氨基酸序列充分同源从而使其蛋白质或部分保留苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列。由核酸分子编码的蛋白质或其部分优选地具有基本的酶活性或生物学活性以及参与植物或微生物中氨基酸代谢的能力，并且通常参与植物或微生物代谢或跨膜分子的转运。由核酸分子编码的蛋白质优选地与序列SEQID NO2的氨基酸序列具有至少大约30％、35％、40％、45％或50％，优选地为至少大约60％并且更加优选地为至少大约70％、80％或90％并且最优选地为至少大约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。蛋白质优选地为全长蛋白质，其基本上部分与SEQ ID NO2、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26(其来自于示于SEQ ID NO1， SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO15，SEQ ID NO17，SEQ ID NO19，SEQ ID NO21，SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中的开放阅读框)的全部氨基酸序列同源。更加有利的其它用于本发明方法的核酸序列来自于SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ IDNO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氨基酸序列。由这些衍生核酸分子编码的蛋白质优选地与由它们编码的核酸序列或者与序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氨基酸序列具有至少大约70％或75％，优选地为大约至少80％或85％，更加优选地为至少大约90％、91％、92％或94％并且最优选地为至少大约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。对于本发明的目的同源性或同源的意思是指同一性或同一的。
所使用的酶的基本酶或生物学活性意思是指与由具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或者由序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10得到的序列以及其衍生物的序列所编码的蛋白质/酶相比，它们仍然至少具有至少10％、优选地为20％，特别优选地为30％且非常优选地为40％的酶或生物学活性并且从而能够参与植物或微生物细胞必需化合物的氨基酸的代谢或跨膜分子的转运，其中氨基酸优选地指蛋氨酸或赖氨酸。
能够用于本方法的核酸优选地来自诸如酵母科的酵母，例如优选的酵母属或诸如假丝酵母属、汉逊酵母属、红酵母属或裂殖酵母属的酵母，并且特别优选的种为酿酒酵母。其序列以EMBL登录号Z49330、Y13136或YJL055W，作为“假想26.9kDa蛋白质”保藏于EMBL数据库，或者以U18779、L10830和U00092登录号作为产物Gly1p(甘氨酸原养型所需要的蛋白质)保藏于EMBL数据库，CDS与蛋白质ID＝″AAB64996.1″和db_xref＝″GI603634″互补(14603..15766)。
对于用于本发明方法另一个可能性是分离编码假定醛缩酶或脱羧酶的核苷酸序列并且这些序列与SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的核苷酸序列杂交，或者在另一个优选的实施方案中，与来自序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ IDNO10的序列杂交，例如在严格条件下杂交。杂交将优选地与长度为至少200bp，有利地为至少400bp，优选地为至少600bp，特别优选地为至少800bp，非常特别优选地为至少1000bp的片段进行。在特别优选的实施方案中，杂交为与全长核酸序列进行杂交。
将用于本方法的核酸序列优选地导入表达盒(＝核酸构建体)，这使得核酸在生物体优选地在植物或微生物中的表达成为可能。
为了导入，以已知方式优选地将编码基因片段进行扩增和连接。方法优选地基于Pfu DNA聚合酶实验设计或Pfu/Taq DNA聚合酶实验设计。基于所扩增的序列选择引物。对引物将进行适当地选择从而使扩增子包括从起始密码子到终止密码子的全部编码序列。扩增后，适当分析扩增子。分析可能涉及诸如通过凝胶电泳分离后的质量和数量。然后按照标准方法(例如Qiagen)纯化扩增子。然后将一份纯化的扩增子用于随后的克隆。适当的克隆载体通常是技术人员所熟知的。这尤其包括能够在细菌系统中复制的载体，即尤其是保证在大肠杆菌中有效克隆的载体并且其为使得稳定转化植物成为可能的载体。尤其可提及的是多种适于T-DNA-介导的转化的二元载体系统和共整合载体系统。该种类型的载体系统通常表征为至少包含农杆菌属介导的转化所必需的vir基因以及T-DNA边界序列(bordersequence)。这些载体系统优选地还包括其它顺式调控区域，例如启动子和终止子和/或筛选标记，具有该筛选标记使得能够鉴定适当转化的生物体。然而在共整合载体系统中vir基因和T-DNA序列排列于相同的载体上，双元载体系统基于至少两个载体，其中一个含有vir基因但不含T-DNA，而第二个含有T-DNA而不含vir基因。这使得后一载体相对较小，易于操作并易于在大肠杆菌和农杆菌中复制。这些双元载体包括pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明优选使用的是Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。在Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451中给出了双元载体的综述及其用途。对于载体制备，最初可用限制性内切酶将载体线性化并且然后以适当的方式修饰载体。随后纯化载体，并将一份用于克隆。在克隆中，使用连接酶将酶切的并且根据需要将纯化的扩增子克隆入同样制备的载体片段中。而且，对于特定核酸构建体或载体或质粒构建体，有可能含有一个或一个以上编码基因片段。这些构建体中的编码基因片段优选地功能性连接于调控序列。调控序列尤其包括诸如上述启动子和终止子的植物序列。构建体优选地能够在筛选条件下在微生物尤其在大肠杆菌和根瘤农杆菌中稳定增殖，并且异源DNA有可能转移入植物或其它微生物。在特定的实施方案中，构建体是基于双元载体(双元载体综述于Hellens等，2000)。后者通常包含诸如复制起始点的调控序列和用于在诸如大肠杆菌和根瘤农杆菌的微生物中复制的筛选标记，以及用于将DNA转移进入植物基因组目的的农杆菌T-DNA序列。在完整的农杆菌T-DNA序列中，至少包含大约25个碱基对的右边界序列是需要的。本发明的载体构建体通常包含来自右侧和来自左侧边界区域的T-DNA序列，该序列适当地包含位点特异性酶的识别位点并由部分vir基因所编码。适当的宿主生物体是技术人员熟知的。优选的生物体是本申请中上述的生物体。这些生物体尤其包括细菌宿主，其中一些上面已经提及的与供体微生物相关，例如微生物为诸如麦角菌属或曲霉属的真菌或者诸如芽孢杆菌属、棒杆菌属、细球菌属、短杆菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、乳酪杆菌属或曲霉属的革兰阳性细菌或者诸如埃希氏菌属、黄杆菌属或沙门氏菌属的革兰阴性细菌或者诸如红酵母属、汉逊酵母属或假丝酵母属的酵母。特别优选的生物体选自棒杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属、红酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、麦角菌属或黄杆菌属。用于本发明方法非常特别优选的微生物选自以下属和物种，包括异常汉森酵母、产朊假丝酵母、麦角菌、环状芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、芽孢杆菌属的种、白短杆菌、Brevibacterium album、多角短杆菌、黄色短杆菌、产谷氨酸短杆菌、碘短杆菌、酮式谷氨酸短杆菌、乳发酵短杆菌、扩展短杆菌、粉红短杆菌、解糖短杆菌、短杆菌属物种、嗜乙酰乙酸棒杆菌、乙酰谷氨酸棒杆菌、产氨棒杆菌、谷氨酸棒杆菌(＝谷氨酸微球菌)、栖糖蜜棒杆菌、棒杆菌属的种或大肠杆菌，尤其是大肠杆菌K12和大肠杆菌的经描述菌株。根据本发明有利优选的是埃希氏菌属宿主生物体(尤其是大肠杆菌)和农杆菌属(尤其是根瘤农杆菌)、或者为选自槭树科、漆树科、伞形科、紫菀科、芸苔科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、忍冬科、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科的植物，优选地为选自伞形科、紫菀科、芸苔科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。其它有利优选的植物是优选地选自以下属的有用植物花生、油菜籽、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、杏树、鳄梨树、月桂树、西葫芦、莴苣、亚麻、大豆、阿月浑子树、紫草科、玉米、小麦、黑麦、燕麦、谷子、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、食用甜菜、茄子和多年生草本植物和食用作物、油椰、蔬菜(芸苔、根类、根茎类、豆类、果实、蔬菜、球茎、叶和茎类蔬菜)、荞麦、菊芋、蚕豆、巢菜、扁豆、紫花苜蓿、矮黄豆、羽扇豆、三叶草和苜蓿。为了将本发明方法中所用的核酸导入植物中，已经证明最初将它们转移入中间体宿主例如细菌是有利的。在本文中已经证明转化入大肠杆菌是适用的，并且能够以本身已知的方式进行，例如通过热休克法或电穿孔法。因此，能够观察转化的大肠杆菌克隆的克隆效率。这能够借助PCR进行。而且，基于通过将一份克隆进行所述PCR而确定的克隆数，有可能检测质粒构建体的特性和完整性。用于该目的的引物通常是来自载体序列的通用引物，位于起始ATG上游的正向引物和位于编码基因片段终止密码子下游的反向引物。通过电泳分离扩增子并估计其数量和质量。适当大小片段的检出导致阳性鉴定。所检测的质粒根据需要随后用于转化植物。为了该目的最初必须获得来自中间体宿主的构建体。例如，基于常规的质粒分离方法，能够从细菌宿主获得作为质粒的构建体。已知有多种转化植物的方法。由于根据本发明将异源DNA稳定整合入植物基因组是有利的，已经证明T-DNA-介导的转化特别适合。为了该目的，最初必须用编码基因片段或相应质粒构建体转化适当运载工具，尤其是农杆菌。这能够以本身已知的方式进行。例如，通过电穿孔法或热休克法能够将根据上面陈述产生的质粒构建体转化入感受态农杆菌。在这种关系中一方面共整合载体的形成和用双元载体进行转化之间基本上必须存在区别。在第一种选择中，包括编码基因片段的载体构建体不含T-DNA序列；相反，通过载体构建体与T-DNA同源重组在重组质粒转化农杆菌中形成共整合载体。T-DNA以Ti或Ri质粒形式存在于重组质粒转化农杆菌中，其中已经用外源DNA对癌基因进行了适当的替换。当使用双元载体时，有可能通过细菌结合转移它们或直接转移至农杆菌。这些重组质粒转化农杆菌已经适当地含有携带vir基因的载体(通常称为辅助Ti(Ri)质粒)。与质粒构建体和T-DNA一起也可适当使用一种或多种标记，使用标记有可能筛选转化的农杆菌和转化的植物细胞。已经研发了大量标记用于该目的。这些包括，例如，那些赋予氯霉素、卡那霉素、氨基葡糖苷G418、潮霉素等抗性的标记。对于质粒构建体通常期望T-DNA位于编码基因片段的一侧或两侧。这在根瘤农杆菌或生根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)基因物种的细菌用于转化时是特别有用的。根据本发明优选的方法是使用根瘤农杆菌进行转化。然而，在本发明方法中生物弹射击(biolistic)方法也能够有利地用于导入序列，并且使用PEG的导入也是可能的。转化的农杆菌能够以本身已知的方式进行培养并因此有利地用于植物转化。所转化的植物或植物部分进行生长或以常规方式提供。然后将植物或植物部分暴露于转化的农杆菌直到达到足够的转化效率。植物和植物部分能够以多种方式暴露于农杆菌。例如，能够使用形态发生的植物细胞或组织培养物。T-DNA转移之后，通常使用抗生素清除细菌，并诱导植物组织再生。最初的愈伤组织形成后，为了促进嫩枝形成，适当的植物激素特别用于该目的。有利的转化方法是植物原位(in planta)转化。为了该目的，例如可将植物种子暴露于转化的农杆菌，或者将转化的农杆菌接种植物分生组织。已经证明根据本发明特别适当的是将完整植株或至少花原基暴露于转化的农杆菌悬液。然后将前者进一步生长直到获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。为了选择转化的植物，通常将从转化获得的植物材料置于选择条件下以至于转化的植物能够与未转化的植物区别开。例如，以上述方式获得的种子能够重新播种并且，在生长之后，进行适当的喷雾筛选。其它可能性是将种子生长，根据需要在灭菌之后生长于琼脂平板上，以此种方式使用适当的筛选剂以至于仅转化的种子能够生长成为植株。其它有利的植物转化方法是技术人员所熟知的并在下面进行描述。
在本发明方法中，编码用于本发明方法的苏氨酸醛缩酶和/或赖氨酸脱羧酶的核酸序列功能性连接于一个或多个调控信号上，有利地为了增加基因表达。这些调控序列用于使基因的特异性表达和蛋白质表达成为可能。例如，根据宿主生物体(＝转基因生物体，例如植物或微生物)，调控序列意思可以是指该基因仅在诱导之后表达或过量表达，或者是立即表达或过表达。这些调控序列的例子是诱导或抑制结合并因此调控核酸表达的序列。除了这些新的调控序列或者替代这些序列之外，这些序列的天然调控仍然有可能存在于实际的结构基因前面并且根据需要已经进行了修饰以至于天然调节已经关闭并且基因的表达已经增加。然而，表达盒(＝表达构建体＝基因构建体＝核酸构建体)还可以具有简单的结构，即在核酸序列或其衍生物前面未插入额外的调控信号，并且对其具有调控作用的天然启动子并未删除。相反，天然调控序列已经突变以至于不再发生调节和/或基因表达增加。这些修饰的启动子也能够以部分序列(＝具有部分本发明核酸序列的启动子)的形式单独放置于天然基因前面以增加活性。基因构建体还可以额外优选地包含一个或多个功能性连接至启动子上的所谓“增强子序列”，这使得增加核酸序列的表达成为可能。其它有利的序列也能够插入DNA序列的3’末端，例如其它调控元件或终止子。编码苏氨酸醛缩酶蛋白质的核酸序列可以以一个或多个拷贝存在于表达盒(＝核酸构建体)。每个基因仅一个拷贝存在于表达盒是有利的。该核酸构建体或多个核酸构建体可以一起表达于宿主生物体。而且一个核酸构建体或多个核酸构建体可插入有利地插入一个或多个载体中并游离存在于细胞中或插入到基因组中。关于植物，可实施整合入质体基因组或优选地整合入细胞基因组。如果所表达的基因一起存在于一个基因构建体，这对多个基因插入宿主基因组是有利的。
调控序列通常位于上游(5’)、中间和/或下游(3’)，这与特定基因或特定编码基因片段有关。具体而言，它们控制编码基因片段的转录和/或翻译，以及转录本的稳定性，根据需要，调控序列可与细胞固有的其它功能系统，诸如细胞蛋白质生物合成器官合作发挥作用。
调控序列尤其包括位于上游(5’)的序列，具体而言其与转录起始的调控有关，例如启动子，并尤其包括位于下游(3’)的序列，具体而言其与转录终止的调控有关，例如多腺苷酸化信号。
能够应用的启动子基本上是那些能够刺激诸如微生物、植物或非人动物的生物体中基因的转录的启动子。适当的能够在这些生物体中行使功能的启动子通常是已知的。它们可以是组成型或诱导型启动子。适当的启动子在多细胞真核生物中可以使得发育-和/或组织-特异性表达成为可能，并且因此可在植物中优选地使用叶-、根-、花-、种子-、保卫细胞-或果实特异性启动子。
而且，如上所述，调控序列或因子优选地具有积极影响，并因此增加所导入基因的表达。因此，通过使用诸如启动子和/或增强子的强转录信号能够在转录水平优选地增强调控元件。然而，除此之外，例如也可能通过导入翻译增强子序列或提高mRNA的稳定性而增强翻译。
本发明的另一个实施方案是包含一个或多个SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25所述核酸序列并编码SEQ ID NO2、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中所呈现多肽的一个或多个核酸构建体。本发明另一个有利的实施方案是一个或多个包含能够从本发明序列SEQID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10衍生的一个或多个核酸序列的核酸构建体。所述多肽优选地具有苏氨酸醛缩酶活性。同样适用于与一个或多个调控信号功能性连接并优选地增加基因表达的这些核酸构建体的同源物、衍生物或类似物。
例如用于本发明新方法的优选调控序列存在于诸如cos、tac、rha、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子的启动子中，这些启动子有利地用于革兰氏阴性细菌。其它有利的调控序列例如存在于革兰氏阳性启动子amy、dnaK、xylS和SPO2，存在于酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、UASH、MCB、PHO、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH或者存在于植物启动子CaMV/35S[Franck等，Cell 21(1980)285-294，US 5,352,605]、PRP1[Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、PGEL1、OCS[Leisner和Gelvin(1988)ProcNatl Acad Sci USA 85(5)2553-2557]、lib4、usp、mas[Comai等，(1990)PlantMol Biol 15(3)373-381]、STLS1、ScBV[Schenk等(1999)Plant Mol Biol39(6)1221-1230]、B33、SAD1或SAD2(Flachspromotoren，Jain等，CropScience，39(6)，19991696-1701)或nos[Shaw等(1984)Nucleic Acids Res.12(20)7831-7846]。使用多种来自拟南芥[Callis等(1990)J.Biol Chem.，26512486-12493；Holtorf S等(1995)Plant.Mol.Biol.，29637-747]、松属、谷物[(Ubil und Ubi2)，US 5,510,474；US 6,020,190和US 6，054574]或欧芹(parsley)[Kawalleck等，Plant Molecular Biology，21，1993673-684]的泛素启动子或菜豆蛋白启动子也是可能的和优选的。在这种关系中，诱导型启动子诸如EP-A-0 388 186(苯甲磺酰胺可诱导的)、Plant J.2，1992397-404(Gatz等，四环素可诱导的)、EP-A-0 335 528(脱落酸可诱导的)或WO 93/21334(乙醇或环己烯醇可诱导的)中所述的启动子同样也是有利的。其它适当的植物启动子是胞核嘧啶FBP酶启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等，EMBO J.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖基焦磷酸氨基转移酶启动子(Genbank登录号No.U87999)或描述于EP-A-0 249 676的结节特异性启动子。特别有利的启动子是使在特异性组织中表达成为可能或在某种组织中优先表达的启动子。诸如实施方案的USP启动子的种子特异启动子也是有利的，而且其他启动子例如LeB4、DC3、SAD1、菜豆蛋白或napin启动子也是有利的。其它特别有利的启动子是种子特异启动子，它们能够用于单子叶或双子叶植物并描述于US 5,608,152(油菜籽napin启动子)、WO 98/45461(拟南芥油质蛋白启动子)、US 5,504,200(菜豆(Phaseolusvulgaris)菜豆蛋白启动子)、WO 91/13980(芸苔Bce4启动子)，以及Baeumlein等，Plant J.，2，2，1992233-239所描述启动子(豆科植物LeB4启动子)，这些启动子都适用于双子叶植物。例如以下启动子适于单子叶植物大麦lpt-2或lpt-1启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)、大麦大麦醇溶蛋白启动子、谷物泛素蛋白启动子以及其他WO 99/16890中所描述的适当启动子。
基本上可将全部具有其调控序列的天然启动子例如上述的启动子用于本发明的新方法。额外或单独使用合成启动子同样也是可能的和有利的，特别是如果这些启动子介导例如如WO 99/16890中所述的种子特异表达时。
为了获得转基因植物中特别有效含量的苏氨酸醛缩酶和/或赖氨酸脱羧酶蛋白质，所编码的生物合成基因能够在植物中有利地组成型表达和/或种子-、果实-或块茎-特异性表达。然而，在另一个有利的实施方案中，它们也可以是可诱导表达的，从而它们被诱导，并且然后表达，特别是表达于植物的预期生长期。为了该目的可使用种子特异启动子或者在胚和/或在胚乳中有活性的启动子。种子特异的启动子原则上能够从双子叶植物和单子叶植物分离得到。下面列出了有利的优选启动子USP(＝未知种子蛋白质)和豌豆球蛋白(蚕豆(Vicia faba))[Bumlein等，Mol.Gen Genet.，1991，225(3)]、napin(油菜籽)[US 5,608,152]、酰基载体蛋白(油菜籽)[US5,315,001和WO 92/18634]、油质蛋白(拟南芥菜)[WO 98/45461和WO93/20216]、菜豆球蛋白(菜豆)[US 5,504,200]、Bce4[WO 91/13980]、豆科植物B4(LegB4启动子)[Bumlein等，Plant J.，2，2，1992]、Lpt2和lpt1(大麦)[WO 95/15389和WO95/23230]、来自稻、谷物和小麦的种子特异启动子[WO 99/16890]、来自Amy32b、Amy 6-6和aleurain[US 5,677,474]、Bce4(油菜籽)[US 5,530,149]、大豆球蛋白(大豆)[EP 571 741]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(大豆)[JP 06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO 98/08962]、异柠檬酸裂解酶(油菜籽)[US 5,689,040]或α-淀粉酶(大麦)[EP 781 849]的启动子。
通过化学可诱导启动子也能够促进植物基因表达(参见综述于Gatz1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，4889-108)。当期望基因表达以时间特异方式发生时，化学可诱导启动子是特别适当的。此类启动子的例子是水杨酸可诱导启动子WO 95/19443)、四环素可诱导启动子(Gatz等(1992)Plant J.2，397-404)和乙醇可诱导启动子。
在裸子植物和被子植物中特异表达原则上也是可行的。
为了保证用于本发明方法的核酸序列与其它生物合成基因一起稳定整合入转基因植物超过几代，每个用于本方法并编码醛缩酶和/或脱羧酶的核酸将在其自身的优选地为不同的启动子的控制下进行表达，因为重复序列基序可以导致T-DNA或重组事件不稳定或基因沉默。表达盒的结构有利地为启动子后面是适当的切割位点以便插入所表达的核酸，有利地为随后是多接头，根据需要终止子定位于多接头的后面。这种依次的排列是多次重复的，优选地为三次、四次或五次，以至于多至五个基因能够组合入构建体并因此导入转基因植物以进行表达。依次的排列有利地重复至三次。通过适当的切割位点将核酸序列插入，例如插入启动子后面的多接头内，以进行表达。对于每种核酸序列有利地是具有自身的启动子和根据需要其自身的终止子。然而，也可将多个核酸序列插入到启动子后面，根据需要插入到终止子前面。所插入核酸的插入位点或顺序排列在表达盒中不是至关重要的，这意思是指核酸序列能够插入盒的第一和最后位置而表达几乎不受影响。在表达盒中使用不同的启动子，例如，来自欧芹的USP、LegB4、DC3或泛素启动子和不同的终止子是可能的和有利的。然而，在表达盒中也可仅使用一种类型的启动子。然而，这可以导致不需要的重组事件或沉默效应。更加有利的能够与用于本方法的序列和/或上述生物合成基因组合表达的核酸序列是编码WO 01/20009中所述的ATP/ADP转位蛋白的序列。该ATP/ADP转位蛋白导致必需氨基酸赖氨酸和/或蛋氨酸优选地为蛋氨酸的合成增加。
如上所述，所导入的基因的转录将优选地由适当的终止子在所导入基因的3’末端(终止子之后)终止。为了该目的，可使用诸如OCS1终止子。正如启动子一样，不同的终止子序列将用于此处的每个基因。
如上所述，基因构建体也可以包括其它被导入生物体的基因。对于调控基因，例如诱导物、抑制物或酶的基因，它们通过其酶活性参与一个或多个生物合成途径基因的调控，将调控序列导入宿主生物体并在其中表达是可能的和有利的。这些基因可以是异源的或同源的。核酸构建体或基因构建体也可以有利地包含其它生物合成基因，或者这些基因可以定位于另一个或其它核酸构建体上。所使用的生物合成基因优选地为氨基酸代谢的基因、糖酵解的基因、三羧酸代谢的基因或其组合。
而且，可将上述多肽或酶与其它基因组合克隆入核酸构建体或载体并借助例如农杆菌转化微生物或植物。
而且，如上所述，这些调控序列或因子优选地具有积极影响，并因此增加所导入基因的基因表达。因此，通过使用诸如启动子和/或增强子的强转录信号能够在转录水平有利地加强调控元件。然而，除此之外，通过例如导入翻译增强序列或提高mRNA稳定性也可能增强翻译。表达盒原则上能够直接用于导入植物中，或者将其导入载体中。
这些有利的载体，优选地为表达载体，包含用于本方法并编码苏氨酸醛缩酶和/或赖氨酸脱羧酶蛋白质的核酸，或者为核酸构建体，其含有所使用的核酸，其单独或与其它基因例如氨基酸代谢生物合成基因相组合。如此处所使用，术语“载体”涉及能够将另一个核酸转运至其连接处的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其代表额外DNA片段能够连接入其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，在这种情况下额外的片段能够连接入病毒基因组。某些载体能够在其已经导入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起始区的细菌载体)。当导入细胞后，其它优选的载体有利地整合入宿主细胞基因组并因此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够控制功能性连接至其上的基因的表达。这些载体此处称为“表达载体”。如上所述，它们能够自主复制或者整合入宿主基因组。适于DNA重组技术的表达载体通常是质粒形式的。在本说明书中“质粒”和“载体”能够互换使用，因为质粒是最通常使用的载体形式。然而，本发明旨在包括这些其它表达载体形式，例如病毒载体，其执行相似的功能。术语载体还旨在包括技术人员已知的其它载体，例如噬菌体、诸如SV40、CMV、TMV的病毒、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、线性或环状DNA。
有利地用于本方法的重组表达载体包括本发明的核酸或本发明以适于在所用宿主细胞中进行核酸表达的形式而存在的核酸构建体，意思是指重组表达载体包括一个或多个基于用于表达的宿主细胞所选择的调控序列，其功能性连接至所表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“功能性连接”意思是指以一种方式将目的核酸序列连接至调控序列以至于使核酸序列的表达成为可能并且它们相互连接从而这两个序列具有各序列的预测功能(例如在体外转录/翻译系统中或者在当栽体导入宿主细胞后的宿主细胞中所具有的功能)。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。这些调控序列描述于，例如，Goeddel基因表达技术酶学方法185，学术出版社，San Diego，CA(1990)，或者参见Gruber和Crosby，植物分子生物学和生物技术方法，CRC出版社，Boca Raton，Florida，编辑Glick和Thompson，第7章，89-108，包括其中的参考文献。调控序列包括那些在多种类型宿主细胞中控制核苷酸序列组成型表达的调控序列和那些仅在特定宿主细胞中在特定条件下控制核苷酸序列，指导其表达的调控序列。技术人员注意到表达载体的设计可以依赖于一些因素，例如所转化宿主细胞的选择、目的蛋白质表达程序等等。
所使用的重组表达载体可以进行特别设计以在原核和真核细胞中表达用于本方法的核酸序列。这是有利的，因为为了简化，载体构建的中间步骤通常在微生物中进行。例如，氨基酸基因即赖氨酸脱羧酶基因和/或苏氨酸醛缩酶基因表达于细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母和其它真菌细胞[见Romanos，M.A.等(1992)“外源基因在酵母中表达综述”，Yeast 8423-488；van den Hondel，C.A.M.J.J.等(1991)“丝状真菌中异源基因的表达”，于真菌中更多基因操作，J.W.Bennet和L.L.Lasure，著者，396-428页学术出版社San Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.，和Punt，P.J.(1991)“研发用于丝状真菌的基因转移系统和载体”，于真菌的应用分子遗传学，Peberdy，J.F.等，著者，1-28页，剑桥大学出版社Cambridge]、藻类[Falciatore等，1999，Marine Biotechnology.1，3239-251]转化过程所用载体如WO 98/01572中所述，并且优选地用于多细胞植物的细胞中[见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)“根瘤农杆菌-介导的拟南芥菜叶子和子叶外植体高效转化”Plant Cell Rep.583-586；植物分子生物学和生物技术，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，71-119页(1993)；F.F.White，B.Jenes等，基因转移技术，于转基因植物，第1卷，能量和利用，著者Kung和R.Wu，学术出版社(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225(以及其中引用的参考文献)]。在Goeddel，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，San Diego，CA(1990)中还讨论了适当的宿主细胞。另外重组表达载体的序列可以进行体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。
原核细胞中蛋白质的表达通常使用含有控制融合或非融合蛋白质表达的组成型或可诱导启动子的载体而进行的。典型的融合表达载体尤其是pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白质和蛋白质A分别融合于重组靶蛋白。
适当的可诱导型非融合大肠杆菌表达载体尤其是pTrc(Amann等(1988)Gene 69301-315)和pET11d[Studier等，基因表达技术酶学方法185，学术出版社，San Diego，California(1990)60-89]。从pTrc载体表达靶基因是基于由宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子进行转录。从pET11d载体表达靶基因是基于从T7-gn10-lac融合启动子进行转录，这是通过共表达病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的。该病毒聚合酶是由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供的，通过含有在lacUV5启动子控制下的T7gn1基因的住留(resident)λ-噬菌体进行的。
其它适于原核生物的载体是技术人员已知的，这些载体为例如在大肠杆菌中为pLG338、pACYC184、诸如pBR322的pBR系列、诸如pUC18或pUC19的pUC系列、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，在链霉菌属为pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌属为pUB110、pC194或pBD214，在棒杆菌属为pSA77或pAJ667。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酵母酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYe去饱和酶c1(Baldari等(1987)Embo J.6229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，SanDiego，CA)。用于构建适于用于其它真菌诸如丝状真菌的载体和方法包括那些详细描述于van den Hondel，C.A.M.J.J.和Punt，P.J.的载体和方法[(1991)“研发用于丝状真菌的基因转移系统和载体”，于真菌应用分子遗传学，J.F.Peberdy等，著者，1-28页，剑桥大学出版社Cambridge；或者于真菌中更多基因操作；J.W.Bennet和L.L.Lasure，著者，396-428页学术出版社San Diego]。其它适当的酵母载体是，例如，2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。
其它以举例的方式提及的载体是真菌中的pALS1、pIL2或pBB116或者植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。
另外一种可能性是使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达核酸序列。用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol..32156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 17031-39)。
上述载体仅提供了可适用载体的小综述。其它质粒是技术人员已知的并且描述于例如克隆载体(著者Pouwels，P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)。对于其它用于原核或真核细胞的适当表达系统，见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16和17章。
在本发明另一个优选的实施方案中，核酸序列可表达于单细胞植物(例如藻类)，见Falciatore等，1999，海洋生物工程1(3)239-251及其中引用的参考文献，以及可表达于来源于高等植物的植物细胞(例如谷物的种子植物)。植物表达载体的例子包括那些在Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，和Masterson，R.[(1992)，“具有位于左侧边缘的选择性标记物的新的植物双元载体”，Plant Mol.Biol.201195-1197]和Bevan，M.W.[(1984)”用于植物转化的双元农杆菌属载体”，Nucl.Acids Res.128711-8721；用于在高等植物中进行基因转移的载体；在转基因植物，第1卷，工程学和利用，著者Kung和R.Wu，学术出版社，1993，15-38页]中有详述的载体。也可以在Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，(2000)，农杆菌双元载体指南，Trendsin Plant Science，第5卷，第10期，446-451中找到双元载体及其用途的综述。
植物表达盒优选地包含能够在植物细胞中控制基因表达并功能性连接以致于每一序列能够实现其功能的调节序列，例如诸如多聚腺苷酸化信号的终止和转录。优选的多聚腺苷酸化信号是那些来自根瘤农杆菌T-DNA的多聚腺苷酸化信号，例如已知作为Ti质粒pTiACH5的章鱼碱合酶的基因3(Gielen等，EMBO J.3(1984)835ff.)或其功能等同物，但是所有在植物中有功能活性的其它终止子也是适当的。
由于植物基因表达在转录水平通常不受限制，植物表达盒优选地包含其它功能性连接的序列，例如翻译增强子，如包含来自烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)的5’-非翻译前导序列的过驱动(overdrive)序列，该序列增加蛋白质/RNA比率(Gallie等，1987，Nucl.Acids Research158693-8711)。
如上所述，为了在植物中表达，核酸序列必须功能性连接至适当的启动子，该启动子以适时的细胞-或组织-特异性方式进行基因表达。能够使用的启动子是组成型启动子(Benfey等，EMBO J.8(1989)2195-2202)，例如那些来源于植物病毒，诸如35S CAMV(Franck等，Cell 21(1980)285-294)、19S CaMV(也见US 5352605和WO 84/02913)、34S FMV(Sanger等，Plant.Mol.Biol.，14，1990433-443)的启动子、欧芹泛素启动子或者植物启动子诸如US 4,962,028中所描述的二磷酸核酮糖羧化酶小亚基的植物启动子。
另一个用于在植物基因表达盒中进行功能性连接的优选序列是那些用于指导基因产物进入其恰当细胞腔室例如进入液泡、细胞核、所有类型质体例如造粉体、叶绿体、色质体、细胞外间隙、线粒体、内质网、造油体、过氧化物酶体和植物细胞的其它腔室所必需的靶向序列(参见综述Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423并且此处引用作为参考)。
如上面所描述，植物基因的表达还可以通过使用化学诱导启动子得以促进(见综述Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，4889-108)。当期望实现时间特异的基因表达时，化学诱导启动子特别合适。此类启动子的实例是水杨酸诱导的启动子(WO 95/19443)、四环素诱导的启动子(Gatz等1992)Plant J.2，397-404)和乙醇诱导的启动子。
能够对生物或非生物的应激条件做出反应的启动子也是合适的启动子，例如病原体诱导的PRP1基因启动子Ward等，Plant.Mol.Biol.22(1993)361-366)、热诱导的番茄hsp80启动子(US 5,187,267)、冷诱导的马铃薯α淀粉酶启动子(WO 96/12814)或者能够被创伤诱导的pinII启动子(EP-A-0375 091)。
特别优选的启动子是那些能够引起基因在发生氨基酸生物合成的组织和器官中如胚乳和处于发育中胚的细胞的种子细胞中表达的启动子。适合的启动子是油菜籽napin基因启动子(US 5,608,152)、蚕豆USP启动子(Baeumlein等，Mol Gen Genet，1991，225(3)459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆菜豆球蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔Bce4启动子(WO 91/13980)、黄豆arc5启动子、胡萝卜DcG3启动子或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等，1992，Plant Journal，2(2)233-9)和引起在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等的种子特异表达的启动子。有利的种子特异启动子是蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)、菜豆球蛋白启动子和napin启动子。值得注意的合适启动子是大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或那些在WO 99/16890中描述的启动子(来源于大麦大麦蛋白基因、稻谷蛋白基因、稻oryzin基因、稻醇溶蛋白基因、小麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白基因、玉米玉蜀黍蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因、黑麦黑麦醇溶蛋白基因的启动子)。
具体而言，预期在该方法中所使用的核酸单独或与其它基因或核酸组合在一起，得到多重平行表达。此类表达盒可以通过同时转化多种单个表达构建体或优选的通过在一个构建体中组合多个表达盒的方式导入。也可将每一个载体均含有多个表达盒的多种载体转化并且被转入宿主细胞。
能够引起质体特异表达的启动子也是特别合适的。合适的启动子例如病毒RNA聚合酶启动子在WO 95/16783和WO 97/06250中有所阐述，并且拟南芥clpP启动子在WO 99/46394中有所阐述。
为了在尽可能多的组织特别是包括叶中强表达异源序列，除了多种上述的病毒和细菌启动子外，特别优选使用肌动蛋白或泛素基因的植物启动子如稻肌动蛋白1启动子。甜菜V-ATP酶启动子(WO 01/14572)代表着组成型植物启动子的另一例子。将要提及的合成的组成型启动子的例子是超启动子(WO 95/14098)和来源于G盒的启动子(WO 94/12015)。在一些情况下，使用化学诱导启动子也是进一步可能的，比较EP-A 388186、EP-A 335528、WO 97/06268。对于在植物中进行基因表达也有用的是在DE-A 19644478中有所描述的叶特异启动子，或诸如豌豆petE启动子的光调节启动子。
关于多聚腺苷酸化信号，特别提及的是来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的ocs基因或nos基因的Poly-A附加序列。根据需要其它适用的调节序列也包括那些能够控制表达产物转运和/或定位(靶向)的序列。在本文中，尤其可提及的是信号肽-或转运肽编码序列本身。例如，借助质体转运肽编码序列指导表达的产物进入植物细胞的质体是可能的。特别优选的作为受体植物的植物，如上所述，是那些能够以一种有利的方式被转化的植物。这些植物包括单子叶和双子叶植物。特别值得注意的是诸如谷类和草类的作物植物，例如小麦属(Triticum spp.)、大麦(Hordeum vulgare)、Hafer、黑麦(Secale cereale)、稻(Oryza sativa)、御谷(Pennisetum glaucum)、高粱(Sorghum bicolor)、黑小麦、剪股颖属的种(Agrostis spp.)、Cenchrus ciliaris、鸭芽(Dactylis glomerata)、苇状羊芽(Festuca arundinacea)、黑麦草属(Lolium spp)、苜蓿属(Medicago spp.)和甘蔗属(Saccharum spp.)，和诸如豆类和油料种子的作物，例如芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)、落花生(Arachis hypogaea)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、向日葵(Helianthus annuus)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、白芥(Sinapis alba)、白车轴草(Trifolium repens)和野碗豆(Vicia narbonensis)，和诸如蔬菜和水果的作物，例如香蕉、葡萄、番茄(Lycopersicon esculentum)、芦笋、卷心菜、西瓜、kiwis、马铃薯(Solanum tuberosum)、甜菜(Betavulgaris)、木薯和菊苣，和诸如树类，例如咖啡物种、柑桔属、桉树属、去杉属(Picea spp.)、松属和白杨属(Populus spp.)，和药用植物和树类，和花。在一个特别的实施方案中，本发明还涉及拟南芥属例如拟南芥菜和稻属的转基因植物。
通过常规的转化或转染技术，可以将载体DNA导入原核或真核细胞。如此处所使用的，术语“转化”和“转染”、结合和转导包括用于将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞的大量本领域熟知的过程，包括磷酸钙和氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、PEG-介导的转染、脂质体转染、天然感受态、化学介导的转移、电穿孔和粒子轰击。适于转化或转染进入包括植物细胞在内的宿主细胞的过程可以在Sambrook等(分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他诸如分子生物学方法，1995，第44卷，农杆菌属操作步骤，著者Gartland和Davey，Humana出版社，Totowa，New Jersey中找到。
如此处所使用，术语“核酸(分子或序列)”可额外包括位于基因编码区3’和5’末端的非翻译序列编码区5’端上游至少500，优选的为200，特别优选的为100个核苷酸和编码区3’端下游至少100，优选的为50，特别优选的为20个核苷酸。只将编码区进行克隆和表达是有利的。“分离的”核酸分子是从存在于核酸天然来源中的其他核酸分子中分离出来的。分离的”核酸分子优选的是不具有天然位于此核酸所来源的生物体基因组DNA中的核酸两侧的序列(例如位于核酸5’和3’末端的序列)。在多种实施方案中，在本发明过程中使用的分离的核酸分子包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的、天然位于该核酸所来源的细胞基因组DNA中核酸分子两侧的核酸序列。
在本发明方法中所使用的核酸分子，例如具有核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或其部分的核酸分子，能够使用分子生物学标准技术进行分离并且在此处提供了序列信息。借助于比较算法可鉴定出例如在DNA或氨基酸水平的同源序列或同源的、保守序列区。这些序列可以用作杂交探针和标准的杂交技术(例如，在Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，Cold Spring Harbor，NY，1989中所描述)用来进一步分离该过程中有用的核酸序列。此外，含有SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25全序列或其部分的核酸分子可以通过聚合酶链式反应使用基于此序列或其部分的寡核苷酸引物得到分离(例如包含全序列或其部分的核酸分子能够通过聚合酶链式反应并使用基于该相同序列的构建的寡核苷酸引物进行分离)。例如，mRNA可以从细胞中分离(例如，通过Chirgwin等(1979)Biochemistry 185294-5299的硫氰酸胍提取法)并且cDNA可以通过使用逆转录酶来制备(例如来源于Gibco/BRL，Bethesda，MD的莫洛尼MLV逆转录酶或者来源于Seikagaku America公司，St.Petersburg，FL的AMV逆转录酶)。用于使用聚合酶链式反应进行扩增的合成的寡核苷酸引物是基于描述于SEQ IDNO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中的核酸序列，或借助于描述于SEQ ID NO2、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中的氨基酸序列而设计的。通过对多种生物体来源的苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶进行蛋白质序列比较，分离保守区域，反过来从该保守区域衍生出简并引物，也是进一步可能的。此种简并引物可以来源于共有序列H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G，HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG，G[X]4GIM[X]45M[X]2RK[X]2M[X]11GGXG[X]3E[X]2E[X]3W，或LG[X]9LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE[X]2E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F。这些简并引物然后可以用来通过PCR方法从其它生物体中扩增新的苏氨酸醛缩酶和/或赖氨酸脱羧酶的片段。进而，这些片段可以用作杂交探针用于分离全基因序列。一种替代的可能是用RACE-PCR的方法分离缺少的5’和3’序列。使用cDNA或者可选择地使用基因组DNA作为模板并且使用适当的寡核苷酸引物用标准的PCR扩增技术可以扩增本发明中的核酸。用该方法扩增的得到的核酸可以克隆入适当的载体并且用DNA序列分析进行特征鉴定。本方法中使用的对应于核苷酸序列的寡核苷酸可以通过标准的合成方法，例如使用自动DNA合成仪，进行制备。
优选的用于本发明方法中的核酸分子可以基于它们与此处所公开的核酸的同源性，使用序列或其部分作为杂交探针使用标准的杂交技术并在严格的杂交条件下，进行分离。在这些情况下，可例如使用长度至少15个核苷酸并且在严格条件下与含有核苷酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的核酸分子杂交的经分离核酸分子。也可以使用至少25、50、100、250或更多核苷酸的核酸。如此处所使用，术语“严格条件下杂交”意思是描述在该条件下一个具有与另一个核苷酸序列至少60％同源性的核苷酸仍与其保持杂交的杂交和洗膜条件。该条件优选的是那些与另一个有着至少约65％、更加优选的约70％和甚至更加优选的至少约75％或更高同源性序列并仍能够杂交的条件。为了本发明的目的，同源或同源性意思是指相同或同一性。这种严格条件被本领域技术人员所熟知并且在分子生物学当前实验方法(John Wiley和Sons，N.Y.(1989))一书中能够找到。一个特别优选的、非限制性的严格杂交条件的实例是在6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)、约45℃条件下杂交，随后在0.2xSSC、0.1％SDS、50-65℃条件下进行一次或多次洗膜的步骤。技术人员应该注意到，至于温度和缓冲液浓度的杂交条件会根据核酸类型的不同和例如有机试剂存在与否而有所不同。例如在“标准杂交条件”下，在浓度为0.1-5xSSC(pH7.2)液体缓冲液的条件下，根据核酸类型的不同，温度会在42℃-58℃之间发生变化。如果在上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度为约42℃。用于DNA:DNA杂交的杂交条件优选的为例如0.1x SSC和20℃-45℃，优选的为介于30℃和45℃之间。用于DNA:RNA杂交的杂交条件优选的为例如0.1xSSC和30℃-55℃，优选的为介于45℃和55℃之间。上述的杂交温度意欲例如用于没有甲酰胺存在条件下的长度为约100bp(＝碱基对)并且G+C含量为50％的核酸。技术人员应该注意到从诸如上述的教科书或来源于下述的Sambrook等“分子克隆”，冷泉港实验室，1989；Hames和Higgins(著者)1985，“核酸杂交”实践方法，在Oxford University出版社的IRL出版社，Oxford；Brown(著者)1991，“基本分子生物学”实践方法，在Oxford University出版社的IRL出版社，Oxford的教科书中可确定如何决定必需的杂交条件。
为了确定两个氨基酸序列(例如SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中的序列)或两个核苷酸序列(例如SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中的序列)的同源性(＝同一性)百分数，将序列进行比对以实现最佳比较目的(例如为了与另一个蛋白质或核酸序列产生最佳的比对，在蛋白质或核酸序列中引入缺口)。当一个序列中的一个位置被另一个序列中相应位置中的同一氨基酸残基或同一核苷酸占据时，则在该位置分子是同源的(即，如此处所使用氨基酸或核酸“同源性”等同于氨基酸或核酸“同一性”)。两个序列间同源性的百分数为序列共同拥有的相同位置的数量的函数(即％同源性＝相同位置的数量/位置总数×100)。因此认为术语同源性和同一性是同义词。
通过向核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中，或来源于上述氨基酸序列的核酸序列中引入一个或多个核苷酸替代、增加或删除以致于将一个或多个氨基酸替代、增加或删除引入到所编码的蛋白质中，来产生编码与蛋白质序列SEQID NO2、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26或序列SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10同源的编码苏氨酸醛缩酶或赖氨酸脱羧酶的分离的核酸分子。通过标准的技术，如定点突变和PCR介导的突变，可以将突变引入到SEQ IDNO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25之一的序列中。优选地，在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处产生保守的氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是一种氨基酸残基被另一个有着相似侧链的氨基酸进行替代的替代。据有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域已被确定。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在诸如SEQ IDNO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的蛋白质序列中预期的非必需氨基酸残基优选地被相同侧链家族的其它氨基酸残基所替代。可选择地，在另一个实施方案中，为了鉴定仍保持生物学活性或能提高生物学活性的突变，例如通过饱和诱变沿着全部或部分编码序列随机引入突变并且对所得到的突变体进行生物学活性即氨基酸产生的筛选。当将序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或来源于上述序列的核酸序列之一进行突变后，编码的蛋白质能够重组性地表达，并且蛋白质的活性可以用例如此处所描述的测定法进行确定。
用于序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或来源于序列SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的核酸序列的核酸序列同源物意思是指例如与示于SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或上述来源的核酸序列或它们的同源物、衍生物或类似物或其部分之一的序列有着至少约30-50％、优选的至少约50-70％、更加优选的至少约70-80％，80-90％或90-95％并且更加优选的至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高同源性的等位基因变异体。此外，具有与示于SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的核苷酸序列、衍生的核酸序列或其部分之一杂交的核苷酸序列的经分离核酸分子是例如能够在严格条件下杂交的分子。等位基因变异体特别包括能够通过从/在描述于SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中的序列或其衍生的序列中进行核苷酸删除、插入或替代所得到的功能变体，但是对于具有插入的一个或多个基因，源于所合成蛋白质的酶活性或生物学活性有利地被保留。仍具有必需的苏氨酸醛缩酶酶活性的蛋白质，即它们的活性的降低可以忽略不计，意思是指与SEQ ID NO2、SEQ ID NO12、SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO22、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26所编码的蛋白质相比较，具有原始生物学活性或酶活性的至少10％、优选的20％、特别优选的30％、非常特别优选的40％的蛋白质。
序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或其衍生序列的同源物也指例如细菌、真菌和植物的同源物、截短序列、编码或非编码DNA序列的单链DNA或RNA。
序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25或其衍生序列的同源物也指例如启动子变异体的衍生物。通过一个或多个核苷酸的替换、然而并不损伤启动子功能或活性的插入和/缺失，可以将所述核苷酸上游的启动子进行修饰。通过修饰它们的序列使启动子活性增加，或甚至用异源生物体的活性更强的启动子对它们进行完全替代也是进一步可能的。
上述核酸和具有参与氨基酸代谢的苏氨酸醛缩酶活性和/或赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质分子用来提高目的化合物生产的产率、产量和/或效率，或用来降低不需要化合物生产的产率、产量和/或效率。
本发明方法所使用的生物体的生长或培养以本领域技术工人熟知的依赖于宿主生物体的方式进行。当将微生物在氧气中传代时，微生物通常生长于温度在0℃-100℃之间、优选的在10℃-60℃之间的、含有碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以诸如酵母提取液的有机氮的形式或诸如硫酸铵的盐的形式)、诸如铁、锰、镁盐的微量元素、和根据需要还含有维生素的液体培养基中。在此过程中，培养液的pH值保持在固定值，即在培养过程中控制或不控制。培养可以通过分批发酵、半分批发酵或持续发酵进行。营养物可以在发酵开始加入或者随后半连续或连续的加入。产生的氨基酸可以用本领域技术人员熟知的方法从生物体中分离。例如通过提取、盐沉淀和/或离子交换层析。为了本目的生物体也可以预先被打断。
当宿主生物体是微生物时，本发明方法有利的是在温度在0℃-95℃之间、优选的在10℃-85℃之间、特别优选的在15℃-75℃之间、非常特别优选的在15℃-45℃之间进行。
在该过程中，pH有利的维持在pH4-12之间、优选的在pH6-9之间、特别优选的在pH7和8之间。
本发明方法可以以分批发酵、半分批发酵或持续发酵的方式进行操作。已知培养方法的概要可以从Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中找到。
所使用的培养基必须以适当的方式满足各个菌株的要求。用于培养多种微生物的培养基的描述存在于美国细菌学会的″普通细菌学方法手册″(Washington D.C.，USA，1981)的手册中。
根据本发明能过使用的这些培养基如上面所描述通常包括一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是如单糖、双糖或多糖的糖类。十分好的碳源的例子是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖类还可以以诸如糖蜜、或其他糖提纯过程中的副产品的复杂化合物形式添加至培养基。还可以有利的加入多种碳源的混合物。其它可能的碳源为油类，例如豆油、向日葵油、花生油和/或椰子脂；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和/或亚油酸；醇类和/或多元醇，例如甘油、甲醇和/或乙醇；和/或有机酸，例如醋酸和/或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。氮源的例子包括液态或气态氨或诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵的铵盐、硝酸盐、尿素、氨基酸或诸如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取液、肉浸出物和其它的复合氮源。氮源可以个别使用或者作为混合物使用。
出现在培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化盐、磷酸盐或硫酸盐。
为了制备含硫的化学物质，特别是蛋氨酸，可使用作为硫源的诸如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物的无机含硫化合物，或者使用诸如硫醇和硫醇类的有机硫化合物。
可使用作为磷源的磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
为了保持溶液中的金属离子，可以往培养基中加入螯合剂。特别合适的螯合剂包括诸如邻苯二酚或原儿茶酸(protocatechuate)的二羟酚类或诸如柠檬酸的有机酸。
根据本发明，对于培养微生物所使用的发酵培养基通常还包括诸如维生素的其它生长因子或包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇的生长促进因子。生长因子和盐类通常来源于复杂的培养基成分，例如酵母提取液、糖蜜、玉米浆等等。此外，合适的前体也可以加入到培养基中。培养基化合物的确切组分极大地取决于特定的实验并且对于每一种特定情况要个别选择。关于培养基优化的知识可以从教科书″应用微生物生理学，实验方法″(著者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL出版社(1997)53-73页，ISBN 0 19 963577 3)中得到。生长培养基还可以从诸如Standard 1(Merck)或BHI(Brain heart infusion，DIFCO)等的商业供应商购得。
所有的培养基成分要通过加热(1.5巴和121℃，20分钟)或者过滤除菌的方法进行灭菌。各种成分可以一起灭菌或者根据需要分开灭菌。在培养开始时可存在所有的培养基成分，或者任选地连续加入或分批加入培养基成分。
培养温度通常在15℃和45℃之间，优选的在25℃-40℃之间，并且在实验过程中保持恒定或变化。培养基的pH值应该介于5-8.5之间，优选的在7左右。在培养过程中，通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨、氨水、或酸性化合物如磷酸、硫酸的方法控制培养时的pH值。通过使用如聚乙二醇脂肪酸酯的消泡剂控制泡沫的产生。通过向培养基中加入适宜的具有选择效应的物质如抗生素使得质粒的稳定性得以维持。通过向培养基中引入氧或含氧气体混合物如空气来维持通气条件。培养基的温度通常为20℃-45℃并且优选的为25℃-40℃。持续培养直至形成最大的目的产物。该目的通常在10小时到160小时内可以实现。
用该方式得到的、特别含有L-蛋氨酸和/或L-赖氨酸、有利的含有L-蛋氨酸的发酵液通常具有按重量计的7.5-25％的干物质含量。
糖限制性发酵也是格外有利的，至少在最后，但是尤其是在至少30％的发酵时间进行糖限制性发酵。这意味着发酵培养基中可利用的糖浓度在该段时间内维持在或降低至≥0-3g/l。
然后进一步加工发酵液。根据需求，通过分离方法，例如离心、过滤、倾析或者这些方法的组合，能够从发酵液全部或部分去除生物量或者能够将生物量完全留在发酵液中。
然后通过已知的方法，例如，借助旋转蒸发器、薄膜蒸发器、降膜式蒸发器，通过逆向渗透或通过纳米过滤，能够增稠或浓缩发酵液。然后该浓缩发酵液能够通过冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾颗粒化或通过其他方法进行加工。
然而，也可进一步纯化氨基酸。为了该目的，将去除生物量的含产物发酵液在适当的树脂上进行层析，在该步骤中目的产物或者杂质将全部或部分滞留于层析树脂上。如果必要，能够使用相同或不同的层析树脂重复这些层析步骤。技术人员熟悉适当层析树脂的选择及其最有效的使用。纯化的产物能够通过过滤或超滤进行浓缩并储存于使产物最稳定的温度。
通过现有技术能够确定所分离化合物的身份或纯度。这些技术包括高效液相色谱法、分光镜分析法、薄层色谱法、NIRS、酶的测定或微生物测定法。这些分析方法归纳于Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 11 27-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.1967-70.工业化学Ulmann百科全书(1996)第A27卷，VCHWeinheim，89-90页、521-540页、540-547页、559-566页、575-581页和581-587页；Michal，G(1999)生物化学途径生物化学和分子生物学图集，John Wiley and Sons；Fallon，A等(1987)HPLC在生物化学中的应用生物化学和分子生物学实验室技术，第17卷。
该方法中获得的氨基酸适于作为起始材料用于进一步合成有价值的产物。例如它们能够彼此相组合或单独用于生产药物、人类食物、动物饲料或化妆品。
如上所述，外源基因转移入植物基因组称为转化。在这种情况下，所描述的用于从植物组织或植物细胞转化和再生的方法可用于瞬时或稳定转化。适当的方法是原生质体转化，通过聚乙二醇-诱导DNA摄入、使用基因枪的生物弹射击方法-所谓的粒子轰击法、电穿孔法、干燥胚在含DNA溶液中孵育、显微注射和农杆菌介导的基因转移。所述方法描述于，例如B.Jenes等，基因转移技术，于转基因植物，第1卷，工程与利用，由S.D.Kung和R.Wu编辑，学术出版社(1993)128-143和于Potrykus Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225。所表达的构建体优选地克隆入适于转化根瘤农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。然后用此种载体转化的农杆菌能够以已知的方法用于转化植物，尤其是作物，例如烟草植物，通过例如在农杆菌溶液中浸浴创伤叶或叶的碎片并且然后在适当培养基中进行培养。使用根瘤农杆菌转化植物描述于例如Hfgen和Willmitzer的Nucl.Acid Res.(1988)16，9877或者除此之外还描述于F.F.White，高等植物中基因转移的载体；于转基因植物，第1卷，工程与利用，由S.D.Kung和R.Wu编著，学术出版社，1993，15-38页。
标记基因有利地用于筛选成功导入本发明核酸的宿主生物体。这些标记基因使得有可能鉴定本发明核酸的成功导入，通过大量不同的原理，例如通过借助荧光、发光或人类可见光波长范围内的视觉识别、通过除草剂或抗生素抗性、通过所谓的营养(营养缺陷体标记)或抗营养标记、通过酶测定或通过植物激素。此处可提及的此类标记的例子是GFP(＝绿色荧光蛋白质)；萤光素/萤光素酶系统；带有有色底物的β-半乳糖苷酶，例如X-Gal；除草剂抗性，例如，抗咪唑啉酮、草甘磷、膦丝菌素或磺酰脲；抗生素抗性，例如，抗博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、大观霉素或杀稻瘟菌素，此处仅提及几种；诸如利用甘露糖或木糖的营养标记或者诸如2-脱氧葡萄糖抗性的抗营养标记。该列举代表一小部分可能的标记。三种类型的标记都是技术人员众所周知的。根据生物体和选择方法，优选使用不同的标记。
关于核酸稳定或瞬时整合入植物细胞，根据所使用的表达载体和所使用的转染技术，已知仅一小部分细胞摄入外源DNA并且，如果期望，将外源DNA整合入其基因组。为了鉴定和筛选这些整合，通常将编码选择标记(例如抗生素抗性)的基因与目的基因一起导入宿主细胞。优选的筛选标记包括那些在植物中赋予对诸如嘉磷塞(glyphosphate)或草铵膦(glufosinate)的除草剂抗性标记。其它适当的标记是，例如，编码参与诸如糖或氨基酸生物合成途径的那些基因的标记，例如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码诸如萤光素酶、gfp或其它荧光基因的标记同样也是适当的。这些标记能够用于突变体，其中这些基因不是功能性的，因为例如已经通过常规方法将它们删除了。此外，编码选择标记的核酸标记也能够与编码用于本方法的苏氨酸醛缩酶和/或赖氨酸脱羧酶的基因位于同一载体导入宿主细胞，或者能够以分别的载体导入宿主细胞。可对用导入的核酸稳定转染的细胞进行鉴定，例如通过选择(例如具有整合的可选标记的细胞存活，而其它细胞死亡)。
因此，通常，在成功导入核酸后转基因宿主细胞不再需要或期望这些标记基因，尤其是抗生素和除草剂抗性基因，使得可删除或切除这些标记基因的技术有利地用于本发明方法以导入核酸。一种此种方法是所谓的共转化。在共转化中，两个载体同时使用以进行转化，一个载体携带有本发明的核酸并且第二个载体携带有标记基因。在植物中大部分转化体获得或容纳这两个载体(多至40％的转化体或更多)。然后有可能通过杂交从转化的植物中去除标记基因。其它方法使用整合入转座子的标记基因以与目的核酸共同转化(所谓的Ac/Ds技术)。在一些情况下(大约10％)，成功转化之后，转座子转移出宿主细胞基因组并丢失。在其它大量情况下，转座子转移至另一位点。在这些情况下，又再次需要标记基因的异型杂交(outcrossing)。已经研发了使得能够或者促进此类事件检出的微生物学技术。另一个有利的方法使用所谓的重组系统，该系统具有可省略异型杂交的优点。该类型最熟知的系统是所谓的Cre/lox系统。Cre1是重组酶，其删除定位于loxP序列之间的序列。如果标记基因是在loxP序列之间整合的，成功转化后通过表达重组酶将其删除。其它重组酶系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，200022255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000553-566)。将本发明核酸序列靶向整合入植物基因组原则上也是可能的但不是优选的，因为要涉及大量工作。当然，这些方法也应用于微生物诸如酵母、真菌和细菌。
用本发明表达载体转化的农杆菌同样能够以已知的方式用于转化植物诸如受试植物(例如拟南芥)或作物植物，例如谷类、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉花、甜菜、芸苔、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、红辣椒、油菜籽、树薯、木薯、竹芋、万寿菊、紫花苜蓿、莴苣和各种树木、坚果和葡萄物种，尤其是含油作物植物诸如大豆、花生、蓖麻油植物、向日葵、玉米、棉花、亚麻、油菜籽、椰子、油棕、红花(Carthamus tinctorius)或可可豆，例如通过在农杆菌溶液中浸浴创伤叶或叶的碎片并且然后在适当培养基中培养。
通过技术人员已知的方法能够再生经遗传修饰的植物细胞。适当的方法发现于上述S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或Hfgen和Willmitzer的出版物。
除了然后一定再生为植物的体细胞转化之外，也可转化植物分生组织细胞和尤其是那些发育成配子的细胞。在这种情况下，转化的配子通过天然植物发育导致形成转基因植物。因此，例如，用农杆菌处理拟南芥的种子，并从由其发育形成的植株获得种子，这些种子显示一定的转化率并因此是转基因的(Feldman，Ka和Marks MD(1987)，拟南芥菜发芽种子的农杆菌介导的转化非组织培养方法.Mol Gen Genet 208274-289；FeldmannK(1992)拟南芥中的T-DNA插入诱变于种子感染转化.在C Koncz，N-HChua和J Shell编著，拟南芥研究方法.Word Scientific，Singapore，274-289页)。另外的方法基于重复去除花序并在莲座中央用转化的农杆菌孵育所切断的部位，同样使得有可能随后获得转化的种子(Chang，SS，Park SK，Kim，BC，Kang，BJ，KimDU和Nam，HG(1994)在植物原位通过农杆菌接种稳定遗传转化拟南芥菜.Plant J.5551-558；Katavic，V，Haughn，GW，Reed，D，Martin，M和Kunst，L(1994)拟南芥菜的植物原位转化.Mol GenGenet，245363-370)。然而，使用对其进行修饰的真空侵入法，例如花浸蘸，是特别有效的。在拟南芥的真空侵入法中，在真空中用农杆菌悬液处理完整植物(Bechthold，N，Ellis，J和Pelletier，G(1993)通过浸润成体拟南芥菜植株进行植物原位农杆菌介导的基因转移.C R Acad Sci Paris Life Sci，3161194-1199)，而在花浸蘸方法中将正在发育的花组织简单孵育于与表面活性剂混合的农杆菌悬液中(Clough，SJ和Bent，AF(1998)花浸蘸一种简单的用于农杆菌介导的拟南芥菜转化的方法.The Plant J.16，735-743)。在两种情况下，收获一定百分率的转基因种子并且通过在上述选择条件下栽培能够从非转基因种子中鉴别出转基因种子。
因此本发明另一方面涉及用至少一个本发明的核酸序列或表达盒或者本发明的载体转化转基因生物，并且涉及细胞、细胞培养物、组织、部分-关于植物生物体例如叶、根等等-或者由此类生物体得到的繁殖材料。术语“宿主生物体”、“宿主细胞”、“重组(宿主)生物体”、“重组(宿主)细胞”、“转基因(宿主)生物体”和“转基因(宿主)细胞”在此处可互换使用。不证自明，这些术语不仅涉及特定宿主生物体或特定靶细胞，而且涉及这些生物体或细胞的后代或可能的后代。因为由于突变或环境影响在后代中可以发生某些修饰，所以这些后代没有必要与亲本细胞相同但是这些后代仍然包括于如此处所用术语的范围之内。
分类于SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氨基酸序列是本发明的另一方面。
通过以下实施例对本发明进一步进行说明，这些实施例不作为本发明的限制。所有参考文献、专利申请、专利和已出版专利申请在本专利申请中引用作为参考。
实施例实施例1SEQ ID NO1克隆入大肠杆菌通过众所周知且成熟建立的方法(见，例如Sambrook，J.等(1989)“分子克隆实验室手册”.冷泉港实验室出版社或者Ausubel，F.M.等(1994)“分子生物学最新流程”，John Wiley & Sons)将SEQ ID NO1克隆入质粒pBR322(Sutcliffe，J.G.(1979)Proc.Natl Acad.Sci.USA，753737-3741)；pACYC177(Change和Cohen(1978)J.Bacteriol.1341141-1156)；质粒pBS系列(pBSSK+、pBSSK-及其它；Stratagene，LaJolla，USA)或者粘粒如SuperCos1(Stratagene，LaJolla，USA)或Lorist6(Gibson，T.J.Rosenthal，A.和Waterson，R.H.(1987)Gene 53283-286)以在大肠杆菌中进行表达。
序列SEQ ID NO11、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15、SEQ ID NO17、SEQ ID NO19、SEQ ID NO21、SEQ ID NO23或SEQ ID NO25类似地进行克隆。
实施例2DNA序列分析和计算机功能分析通过标准方法进行DNA序列分析，具体而言是使用ABI377测序仪的链终止法(见，例如，Fleischman，R.D.等(1995)“流感嗜血杆菌(HaemophilusInfluenzae Rd.)的全基因组随机测序和组合”，Science 269；496-512)。
实施例3体内诱变通过不能维持其遗传信息完整性的大肠杆菌或其它微生物(例如芽孢杆菌物种或酵母诸如酿酒酵母)传递质粒(或其它载体)DNA，可实施体内谷氨酸棒杆菌诱变。由于DNA修复系统通常的突变体菌株在其基因中具有突变[例如mutHLS、mutD、mutT等，为了比较，见Rupp，W.D.(1996)大肠杆菌和沙门氏菌中的DNA修复机制，2277-2294页，ASMWashington]。这些菌株是技术人员已知的。这些菌株的用途说明于例如Greener，A.和Callahan，M.(1 994)Strategies 7；32-34。
实施例4大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的DNA转移几种棒杆菌属和短杆菌属物种含有进行自主复制的外源质粒(例如，pHM1519或pBL1)(综述，见，例如Martin，J.F.等(1987)Biotechnology5137-146)。利用用于大肠杆菌的标准载体能够容易地构建用于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的穿梭载体(Sambrook，J.等，(1989)，“分子克隆实验室手册”，冷泉港实验室出版社或Ausubel，F.M.等(1994)“分子生物学最新方法”，John Wiley & Sons)，其中加入了来自谷氨酸棒杆菌的复制起始区和适当的标记。此类复制起始区优选地来自从棒杆菌属和短杆菌属物种分离得到的内源质粒。特别用于这些物种的转化标记是卡那霉素抗性基因(例如那些来自Tn5或Tn-903转座子的卡那霉素抗性基因)或氯霉素抗性基因(Winnacker，E.L.(1987)“从基因到克隆-基因技术介绍”，VCH，Weinheim)。在文献中有很多制备大量穿梭载体的例子，这些穿梭载体在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中复制，并能够用于多种目的，包括基因表达(见，例如Yoshihama，M.等(1985)J.Bacteriol.162591-597，Martin，J.F.等，(1987)Biotechnology，5137-146和Eikmanns，B.J.等(1992)Gene 10293-98)。在棒状杆菌中复制的适当载体是，例如，pZ1(Menkel等，Appl.Environ.Microbiol.，64，1989549-554)、pEkEx1(Eikmanns等，Gene 102，199193-98)或pHS2-1(Sonnen等，Gene 107，199169-74)。这些载体基于隐性质粒pHM1519、pBL1或pGA1。其它那些例如基于pCG4(US4,489,160)、pNG2(Serwold-Davis等，FEMS Microbiol.Lett.，66，1990119-124)或pAG1(US 5,158,891)的质粒载体能够以相似的方式使用。
通过标准方法有可能将靶基因克隆入上述穿梭载体之一，并且有可能将此类杂合载体导入谷氨酸棒杆菌菌株。通过原生质体转化(Kastsumata，R.等，(1984)J.Bacteriol.159，306-311)、电穿孔(Liebl，E.等，(1989)FEMSMicrobiol.Letters，53399-303)并且，在使用特定载体情况下，也通过接合(例如，如描述于Schfer，A.，et(1990)J.Bacteriol.1721663-1666)，能够完成谷氨酸棒杆菌的转化。同样通过从谷氨酸棒杆菌制备质粒DNA(通过本领域已知的方法)并将其转化入大肠杆菌，从而有可能将穿梭载体从谷氨酸棒杆菌转移至大肠杆菌。使用标准方法能够进行该转化步骤，但是有利地使用Mcr-缺陷的大肠杆菌菌株，例如NM522(Gough和Murray(1983)J.Mol.Biol.1661-19)。
有利地是，如果试图将转化序列整合入棒状细菌的基因组，用于该目的的标准技术也是技术人员已知的。例如，对于hom-thrB操纵子的复制和扩增，如Remscheid等(Appl.Environ.Microbiol.，60，1994126-132)所述的那些质粒载体用于该目的。在该方法中，将完整的基因克隆入能够在宿主诸如大肠杆菌中而不在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中。适当载体的例子是pSUP301(Simon等，Bio/Technology 1，1983784-791)、pKIBmob或pK19mob(Schfer等，Gene 145，199469-73)、pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，USA)、pCR2.1-TOPO(Schuman，J.Biol.Chem.，269，199432678-32684，US 5,487,993)、pCRBlunt(来自Invitrogen，Groningen，The Netherlands)或pEM1(Schrumpf等，J.Bacteriol.，173，19914510-4516)。
实施例5确定突变体/转基因蛋白质的表达对突变的或转基因蛋白质在转化的宿主细胞中活性的观察基于该蛋白质以与野生型蛋白质相似的方式和相似的量进行表达的事实。用于确定突变体或转基因基因的转录效率(可用于翻译成基因产物的mRNA的量这一指示剂)的适当方法是进行Northern印迹(见，例如，Ausubel等，(1988)分子生物学最新方法，WileyNew York)，其中引物进行设计从而使其具有可检测标记(通常为放射性或化学发光的)结合至靶基因上以至于—当从生物体培养物提取全部RNA、从胶上分离、转移至适当基质上并用该探针孵育时—探针的结合和探针结合的量表明该基因mRNA的存在和数量。该信息是基因转录程度的证明。如Bormann，E.R.等，(1992)Mol.Microbiol.6317-326中所述，通过本领域已知的各种方法能够从谷氨酸棒杆菌分离全部细胞RNA。
通过应用标准技术例如Western印迹(见，例如，Ausubel等(1988)“分子生物学最新方法”，Wiley，New York)能够确定从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对数量。在该方法中，提取全部细胞蛋白质，通过凝胶电泳进行分离，转移至基质例如硝化纤维素膜，并用探针例如抗体进行孵育，该探针特异性结合至目标蛋白质上。该探针通常具有能够容易地进行检测的直接或间接化学发光或色度法标记。标记物的存在和所观察到的数量表明在细胞中所寻找的突变蛋白质的存在或数量。
实施例6经遗传修饰的谷氨酸棒杆菌的生长—培养基和培养条件经遗传修饰的棒状杆菌培养于合成或天然生长培养基中。大量不同的用于棒杆菌的生长培养基是已知的并且易于获得(Lieb等(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.32205-210；von der Osten等(1998)BiotechnologyLetters 1111-16；Patent DE 4 120 867；Liebl(1992)“棒杆菌属”，于原核生物，第II卷，Balows，A.，等著，Springer-Verlag)。这些培养基包括一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素。优选的碳源是糖例如单-、双-或多糖。非常好的碳源的例子是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、绵子糖、淀粉或纤维素。糖也能够以复杂化合物诸如糖蜜或者其它糖精炼过程的副产品而加入到培养基中。加入多种碳源混合物也可以是有利的。其它可能的碳源是醇和/或有机酸例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物或含这些化合物的物质。氮源的例子包括氨气、氨水溶液或铵盐例如NH4Cl或(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或者复杂氮源例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉浸出物及其它。也可以优选地使用上述氮源的混合物。
可以存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。为了保持溶液中的金属离子可以在培养基中加入螯合剂。特别适当的螯合剂包括诸如邻苯二酚或原儿茶酸的二羟基酚类，或者诸如柠檬酸的有机酸。培养基通常情况下也包含其它生长因子诸如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常来自复合培养基成分诸如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等等。培养基化合物的确切成分很大程度上取决于特定的实验并且对于每一具体情况分别进行选择。关于培养基的信息是可以获得的，例如从教科书“应用微生物学生理学，实验方法”(著者P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)53-73页，ISBN 0 19963577 3)。生长培养基也能够从供应商那里购买到，例如Standard 1(Merck)或BHI(脑心浸汁，DIFCO)等等。
所有培养基成分均通过加热(1.5巴和121℃加热20分钟)或者通过无菌过滤进行灭菌。这些成分能够在一起灭菌或者，如果必要，单独进行灭菌。所有培养基成分可以在开始培养时就存在或者任选地连续或分批加入。
对于每个实验培养条件是分别确定的。温度将在15℃和45℃之间并且在实验期间能够维持不变或进行改变。培养基的pH将在从5-8.5的范围内，优选地为大约7.0，并且能够通过向培养基中加入缓冲液而进行维持。用于该目的的缓冲液的一个例子是磷酸钾缓冲液。合成缓冲液诸如MOPS、HEPES、ACES等能够互换使用或同时使用。在培养期间也能够通过加入例如NaOH或NH4OH维持培养pH恒定。如果使用复合培养基诸如酵母提取物，对缓冲液的需求减少，因为许多复杂化合物具有高缓冲能力。如果将发酵罐用于培养微生物，也能够使用气体氨控制pH值。
孵育时间通常在几个小时到多至几天的范围内。该时间是可选择的，从而在发酵液中积累最大量的产物。所公开的生长实验能够在大量器皿中进行，诸如微孔板、玻璃管、玻璃烧瓶或者多种大小的玻璃或金属发酵罐。为了筛选大量克隆，将微生物培养于微孔板、玻璃管或者具有或不具有挡板的摇瓶中。优选地使用100ml摇瓶并装入10％(基于体积)所需的生长培养基。将烧瓶在定轨摇床(振幅25mm)上振荡，速度为从100-300转/分钟范围内。通过维持潮湿空气能够降低蒸发损失；另外，对于蒸发损失将进行数学上的校正。
如果观察到经遗传修饰克隆，也将测试未修饰的对照克隆或者包含不含插入部分的基础质粒的对照克隆。如果转基因序列进行表达，在这种情况下对照克隆也将优选地进行测试。培养基优选地接种至OD600为0.5-1.5，使用培养于琼脂平板例如CM平板(10g/l葡萄糖，2.5g/lNaCl，2g/1尿素，10g/l多蛋白胨，5g/l酵母提取物，5g/l肉浸出物，22g/l琼脂，用2MNaOH调至pH6.8)上的细胞，其在30℃进行培养。通过导入来自CM平板的谷氨酸棒杆菌细胞盐溶液或者通过加入该细菌的液体预培养物对培养基进行接种。
实施例7由转化序列所编码蛋白质的功能的体外分析对酶活性和动力学参数的测定在本领域中是众所周知的。用于测定特定修饰的酶活性的实验必须适合于野生型酶的特异活性，这是技术人员能力所及的。关于结构、动力学、原理、方法、应用的一般和特别详细的综述和测定多种酶活性的例子能够发现于例如以下参考文献中Dixon，M.，和Webb，E.C(1979)酶，Longmans，London；Fersht(1985)酶的结构和机制，Freeman，New York；Walsh(1979)酶反应机制.Freeman，SanFrancisco；Price，N.C.，Stevens，L.(1982)酶学原理.牛津大学出版社Oxford；Boyer，P.D著者(1983)酶学，第三版，学术出版社，New York；Bisswanger，H.(1994)Enzymkinetik，第二版，VCH，Weinheim(ISBN3527300325)；Bergmeyer，H.U.，Bergmeyer，J.，Graβl，M.著者(1983-1986)酶分析方法，第三版，第I-XII卷，Verlag ChemieWeinheim；和工业化学Ullmann′s百科全书(1987)第A9卷，″酶″，VCH，Weinheim，352-363页。
实施例8分析核酸对氨基酸生产的影响通过在适当条件下(诸如上述的那些条件)培养修饰的微生物，并观察培养基和/或细胞成分增加的氨基酸的产生能够确定谷氨酸棒杆菌中的遗传修饰对氨基酸产生的影响。此类分析技术对于技术人员是众所周知的，并且包括光谱法、质谱分析、薄层层析法、多种类型染色法、酶学和微生物学方法、以及分析层析法诸如高效液相色谱(见，例如，工业化学Ullmann′s百科全书，第A2卷，89-90页和443-613页)VCHWeinheim(1985)；Fallon，A.，等，(1987)″HPLC在生物化学中的应用″在生物化学和分子生物学实验室技术，第17卷；Rehm等(1993)生物技术，第3卷，第III章″产物的回收和纯化″，第469-714页，VCHWeinheim；Belter，P.A.等(1988)生物分离技术用于生物技术的下游加工，John Wiley and Sons；Kennedy，J.F.和Cabral，J.M.S.(1992)生物材料的回收方法，John Wileyand Sons；Shaeiwitz，J.A.和Henry，J.D.(1988)生物化学分离，在工业化学Ullmann′s百科全书，第B3卷，第11章，1-27页，VCHWeinheim；以及Dechow，F.J.(1989)生物技术中的分离和纯化技术，Noyes Publications)。
为了确定生物体的总产量、化合物产生的产率和/或效率，除了测定发酵的终产物之外，同样可分析用于产生目的化合物的代谢途径的其他成分，诸如中间体和副产品。分析方法包括培养基中营养物量的测定(例如糖、碳氢化合物、氮源、磷酸盐和其他离子)、生长和生物量成分的测定、来自生物合成途径的一般代谢物产量的分析和发酵期间所产生气体的测定。这些测定的标准方法描述于应用微生物学生理学；实用方法，P.M.Rhodes和P.F.Stanbury著，IRL出版社，103-129页；131-163页和165-192页(ISBN0199635773)和在其中所指出的参考文献。
实施例9来自谷氨酸棒杆菌培养物的氨基酸纯化通过本领域已知的多种方法，能够从谷氨酸棒杆菌细胞和/或从上述培养物的上清液获得氨基酸。为了该目的首先获得培养物上清液，为了达到该目的通过缓慢离心从培养物中收获细胞，并且随后能够通过标准技术诸如机械压力超声粉碎或裂解细胞。通过离心去除细胞碎片，并且将上清液部分与培养物上清液混合用于氨基酸的进一步纯化。然而，如果上清液中所包含的氨基酸的浓度足够，也可仅对上清液进行操作。然后通过，例如提取和/或盐沉淀或者通过离子交换层析，能够进一步纯化氨基酸或氨基酸混合物。
如果必要并且期望，接下来可以进行使用适当树脂的进一步层析步骤，氨基酸或者滞留于层析树脂上，但是样品中的许多杂质不能滞留，或者杂质滞留于树脂上，而具有产品的样品(氨基酸)不能滞留。如果必要，可以重复这些层析步骤，使用相同的或不同的层析树脂。对于所要纯化的特定分子技术人员熟悉适当层析树脂的选择及最有效的用途。通过过滤或超滤，能够浓缩纯化的产物并将产物储存于使产物的稳定性最大的温度。
许多纯化方法在本领域是已知的并且不限于上述的纯化方法。这些方法描述于例如Bailey，J.E.和Ollis，D.F.生物化学工程基础，McGraw-HillNew York(1986)。
通过本领域的标准技术能够测定所分离氨基酸的身份和纯度。这些技术包括高效液相色谱(HPLC)、光谱法、染色方法、薄层层析法、NIRS、酶学测定或微生物学测定。这些分析方法归纳于Patek等(1994)Appl.Environ.Microbiol.60133-140；Malakhova等(1996)Biotekhnologiya 1127-32；和Schmidt等(1998)Bioprocess Engineer.1967-70。工业化学Ullmann′s百科全书，第A27卷，VCHWeinheim，89-90页，521-540页，540-547页，559-566页，575-581页和581-587页；Michal，G(1999)生物化学途径生物化学和分子生物学图集，John Wiley and Sons；Fallon，A.等(1987)HPLC在生物化学中的应用，在生物化学和分子生物学实验室技术，第17卷。
实施例10用于在植物中表达的SEQ ID NO1的克隆除非另外指明，使用来自Sambrook等，分子克隆实验室手册，ColdSpring Harbor 1989，冷泉港实验室出版社的标准方法。
按照Pfu Turbo DNA聚合酶(来自Stratagene)的操作方法进行SEQ IDNO1的PCR扩增。组成成分如下1x PCR缓冲液[20mM Tris-HCl(pH8.8、2mM MgSO4、10mM KCl、10mM(NH4)SO4、0.1％Triton X-100、0.1mg/ml BSA)、0.2mM d-Thio-dNTP和dNTP(1∶125)、100ng来自酿酒酵母(S288C株；来自Research Genetics公司，现为Invitrogen)的基因组DNA、50pmol正向引物、50pmol反向引物、2.5u Pfu Turbo DNA聚合酶。扩增循环如下95℃，3’一个循环，随后是36个循环，每个循环1’95℃，45”50℃和210”72℃，随后是一个循环72℃ 8’，然后是4℃。
对基因SEQ ID NO1选择以下引物序列i)正向引物(SEQ ID NO1)5‘-GGAATTCCAGCTGACCACCATGACTGAATTCGAATTGCCTCCAAii)反向引物(SEQ ID NO1)5‘-GATCCCCGGGAATTGCCATGTCAGTATTTGTAGGTTTTTATTTCGC
作为引物的通用部分，上述正向引物的开始19个核苷酸包含用于克隆基因的切割位点。该引物的随后部分，在所示例子中的25个核苷酸，对于所克隆的基因是特异的。反向引物的通用部分包含用于克隆的5’端(20个核苷酸)的切割位点。对后26个核苷酸的特异部分，其也是对所要克隆的基因特异的。正向引物的通用部分包含一个EcoRI切割位点，而反向引物的通用部分包含一个SmaI切割位点。两个切割位点多用于克隆核酸序列。如下所述进行限制性酶切。随后将扩增子在QIAquick柱子上按照标准程序(来自Qiagen)进行纯化。
制备了用于本发明方法的其他序列的引物并以类似方式使用。
通过标准程序，使用EcoRI和SmaI对载体DNA(30ng)进行限制性酶切，并且通过标准程序(MBI-Fermentas)补平EcoRI切割位点并通过加入高盐缓冲液终止反应。通过标准程序(Machery-Nagel)在Nucleobond柱子上纯化所切割的载体片段。使用了位于T-DNA边界序列之间的含有选择表达盒(启动子、选择标记、终止子)和具有启动子、克隆盒和终止子序列的表达盒的双元载体。除了在克隆盒中，双元载体不再含有EcoRI和SmaI切割位点。能够使用的双元载体是技术人员已知的，并且双元载体及其用途的综述由Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，(2000)农杆菌双元载体指南，Trends in Plant Science，第5卷，第10期，446-451给出。根据所使用的载体，使用其它限制性酶进行克隆也是有利的。通过使用适当的PCR扩增引物能够将适当有利的切割位点添加于ORF。
将大约30ng制备的载体和一定数量制备的扩增子进行混合，并通过加入连接酶进行连接。
在相同的反应器中通过加入感受态大肠杆菌细胞(菌株DH5α)并在1℃孵育20’，随后在42℃热休克90”并冷却至4℃以进行经连接载体的转化。随后加入完全培养基(SOC)并在37℃孵育45’。然后将全部的混合物铺于具有抗生素(根据所用的双元载体选择)的琼脂平板上并在37℃孵育过夜。
通过使用结合限制性切割位点上游和下游并因此使得插入片段的扩增成为可能的引物进行扩增，以检验成功的克隆。按照Taq DNA聚合酶(Gibco-BRL)的操作方法进行扩增。组成成分如下1xPCR缓冲液[20mMTris-HCl(pH8.4、1.5mMMgCl2、50mM KCl)]、0.2mM dNTP、5pmol正向引物、5pmol反向引物、0.625u Taq DNA聚合酶。
扩增循环如下94℃，5’一个循环，随后是35个循环，每个循环15”94℃，15”66℃和5’72℃，随后是一个循环72℃10’，然后是4℃。
检测了几个克隆，并且仅一个克降检测到预期大小PCR产物的克隆进一步被使用。
将一份该阳性克隆转移入加入完全培养基(LB)的反应器并在37℃孵育过夜。为了筛选克隆，LB培养基含有抗生素，根据所使用的双元载体选择抗生素并且双元载体中存在抗性基因。
如Qiaprep标准操作方法(Qiagen)所述进行质粒制备。
实施例11产生表达SEQ ID NO1的转基因植物通过电穿孔法，将1ng所分离的质粒DNA转化入根瘤农杆菌的感受态细胞，例如菌株GV 3101 pMP90(Koncz和Schell，Mol.Gen.Gent.204，383-396，1986)。农杆菌菌株的选择依赖于双元载体的选择。可能的菌株及其特性的综述见Hellens，R.，Mullineaux，P.和Klee H.，(2000)农杆菌双元载体指南，Trends in Plant Science，第5卷第10期，446-451。随后加入完全培养基(YEP)并转移至新的反应器在28℃孵育3h。然后将全部混合物铺于具有分别抗生素例如对于菌株GV3101 pMP90是利福平和庆大霉素以及用于对双元载体进行筛选的另一种抗生素的YEP琼脂平板上，并且28℃孵育48小时。
然后将具有实施例10中所产生的质粒构建体的农杆菌用于植物转化。
使用吸头从琼脂平板上挑取克隆并放入3ml也含有适当抗生素的液体TB培养基中，抗生素的选择取决于农杆菌菌株和双元质粒。预培养物生长于28℃和120转/分钟生长48小时。
400ml含有与先前相同抗生素的LB培养基用于主要培养物。将预培养物转移入主要培养物中。后者在28℃和120转每分生长18小时。4000转每分离心之后将沉淀片重悬于滤过培养基(MS培养基，10％蔗糖)。
为了栽培用于转化的植物，用GS 90基质(标准土壤，WerkverbandE.V.，Germany)半填充碟子(Piki Saat 80，绿色具有多孔底，30×20×4.5cm，来自Wiesauplast，Kunststoffechnik，Germany)。
用0.05％Previcur溶液(Previcur N，Aventis CropScience或Proplant，Chimac-Agriphar，Belgium)浸泡过夜。将拟南芥菜C24种子(NottinghamArabidopsis Stock Centre，UK；NASC Stock N906)分散于碟子上，大约每个碟子1000粒种子。用盖子盖住碟子用于分层(8h、110μμmol/m2/s-1、22℃；16h、黑暗、6℃)。5天后，将碟子放置于短日照人工气候室(8h、130μmol/m2/s-1、22℃；16h、黑暗、20℃)。它们在此处维持大约10天直到形成第一片真叶。
将苗转移入含有相同基质的罐中(Teku pots，7或10cm，LC系列，由Pppelmann GmbH&Co制造，Germany)。将5或10株植物挑选放入一个罐。然后再次将罐放置于短日照人工气候室并进一步省长。
10天后，然后将植物放入温室(额外光照，16小时，340μE，22℃；8小时，黑暗，20℃)。它们继续生长17天。
通过将六周龄的刚开花的拟南芥植物浸泡于上述农杆菌悬液中10秒钟进行转化。后者预先已经与10μlSilwettL77(Crompton S.A.，Osi Specialties，Switzerland)混合。相应方法描述于Clough和Bent，1998(Clough，JC和Bent，AF.1998花浸蘸用于农杆菌介导的拟南芥菜转化的简单方法，Plant J.16735-743)。
然后将植物放置于潮湿房间内18小时。随后将罐送回温室以进一步生长。培养植物10周直到有可能收获种子。
根据用于选择经转化植物的抗性标记，将收获的种子播种于温室中并且进行喷雾选择，或将其消毒后培养于具有适当选择试剂的琼脂平板中。大约10-14天之后，转化的抗性植物明显不同于死亡的野生型小苗，并且挑出来放置于6cm的罐中。转基因拟南芥菜植物的种子储存于冰箱(在-20℃)。
用于本方法的其它序列也可以类似地在植物中表达。
实施例12栽培用于生物分析研究的植物为了生物分析研究转基因植物，使它们一致生长于特殊栽培物中。对于土壤混合物，将GS-90底物放入盆栽装置(Laible System GmbH，Singen，Germany)并用于填充罐。然后将35个罐一起放入一个盘中并用普力克(Previcur)处理。将25ml普力克稀释于10升自来水以进行处理。该数量足以处理大约200个罐。将罐放置于普力克溶液中并额外从上面用不含普力克的自来水浇水。种子在同一天播种或者在三天内播种。
为了播种，使用牙签将已经储存于冰箱(在-20℃)内的种子从Eppendorf管中取出并转移入含有土壤的罐中。整体上，大约5-12粒种子分布于罐的中央。
播种后，用相匹配的塑料盖盖住带有罐的盘并在分层室内黑暗4℃放置4天。湿度为大约80-90％。分层后，使用16小时光照和8小时黑暗的节律，在20℃，60％的湿度和400ppmCO2浓度下栽培测试植物22-23天。光源包括钨丝Powerstar HQI-T 250W/D日光灯，其产生的有色光谱与光强度为大约220μE/m2/s-1的太阳光有色光谱相似。
在8、9和10天龄时将植物进行抗性标记筛选。再过3-4天后，可清楚地将转基因、具抗性的苗(处于四叶期的小植株)与非转化植株区别开。非转基因小苗是漂白的或死亡的。在14天龄时挑选转基因抗性植株。在罐当中生长最好的植株被作为靶植株。使用金属镊子小心取出全部其它植株并丢弃。
生长期间，用蒸馏水从上面给植株加水(至土壤上)并从下面流入通道。然后在23天龄时收获生长的植株。
具有其它用于本发明方法的序列的植株也以类似的方式进行分析。
实施例13经转化植物的代谢分析根据本发明方法所鉴定的所述代谢物的含量改变通过以下方法鉴定。
a)取样和样品贮藏在植物人工气候室中直接进行取样。使用小型实验室剪刀切断植株，在实验室天平上迅速称重，转移至预冷的吸引套管并放置于用液氮冷却的铝架上。如果必要，可以将吸引套管储存于-80℃冰箱。从植物的切割到冻存于液氮的时间不超过10-20秒。
b)冷冻干燥在实验过程中，小心拿取保持深度冰冻状态(温度＜-40℃)或者在首次与溶剂接触之前已经通过冷冻干燥脱水的植株。
将装有处于吸引套管中的植物样品的铝架放置于预冷的(-40℃)冷冻干燥器内。在主要干燥期间起始温度为-35℃，且压力为0.120毫巴。干燥期间，参数根据压力和温度设置而改变。12小时后最终温度为+30℃，且最终压力为0.001-0.004毫巴。在已经关掉真空泵和制冷器后，系统用空气(通过干燥管干燥的)或氩气进行通风。
c)提取冷冻干燥器通风之后立即将装有冷冻干燥植物材料的吸引套管转移入ASE装置(具有溶剂控制器和AutoASE软件的加速溶剂提取器ASE 200)(来自DIONEX)的5ml萃取柱内。
ASE装置的24个试样位置用于放入植物样品。
使用大约10ml甲醇/水(80/20，v/v)在T＝70℃和p＝140巴，加热5分钟，静置提取1分钟，对极性物质进行抽提。使用大约10ml甲醇/二氯甲烷(40/60，v/v)在T＝70℃和p＝140巴，加热5分钟，静置提取1分钟，对更多亲脂性物质进行抽提。将两种溶剂混合物抽提入相同样品管(具有螺旋盖和可穿制隔板的50ml离心管用于ASE(DIONEX))。
将溶液与内标准混合，内标准包括核糖醇、L-甘氨酸-2，2-d2、L-丙氨酸-2，3，3，3-d4、蛋氨酸-甲基-d3和α甲基吡喃葡萄糖苷和甲基十九烷酸酯、甲基十一烷酸酯、甲基十三烷酸酯、甲基十五烷酸酯、甲基二十九烷酸酯。
将全部提取物与8ml水混合。丢弃植物样品的固体残余物和提取套管。
振荡提取物并且然后在1400g的最低转速离心5-10分钟以加速相分离。将1ml上清甲醇/水相(“极性相”，无色)取出以进行进一步的GC分析，并取1ml用于LC分析。丢弃甲醇/水相的剩余物。取0.5ml有机相(“脂相”，墨绿色)用于进一步GC分析，并取0.5ml用于LC分析。使用IR Dancer红外线真空蒸发器(Hettich)将所有取出液体蒸发至干燥。在蒸发过程中最高温度不超过40℃。装置中的压力不低于10毫巴。
d)进一步加工用于LC/MS或LC/MS/MS分析的脂相将已经蒸发至干燥的脂相提取物溶于流动相。使用梯度洗脱进行HPLC。
将已经蒸发至干燥的极性相提取物溶于流动相。使用梯度洗脱进行HPLC。
e)用于GC/MS分析的脂相的衍生作用对于反式甲醇分解作用，将140μl氯仿、37μl盐酸(37％重量的HCl溶于水)、320μl甲醇和20μl甲苯的混合物加入至蒸发的提取物中。将容器紧密封闭并于100℃加热振荡2小时。然后将溶液蒸发至干燥。将剩余物完全干燥。
通过与甲氧胺氢氯化物(5mg/ml于吡啶中，取100μl在紧密封闭容器中于60℃1.5小时)反应进行羰基的甲氧胺作用。加入20μl奇数的直链脂肪酸(溶于含30％吡啶的甲苯v/v混合物中的具有7-25个碳原子的脂肪酸每种0.3mg和具有27、29和31个碳原子的脂肪酸每种0.6mg/ml)作为时间标准。最后，100μlN-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)用于在容器中进行衍生作用，再次将该容器紧密封闭，于60℃进行30分钟。GC注射前最终体积为220μl。
f)用于GC/MS分析的极性相的衍生作用通过与甲氧胺氢氯化物(5mg/ml于吡啶中，取50μl在紧密封闭容器中于60℃ 1.5小时)反应进行羰基的甲氧胺作用。加入10μl奇数的直链脂肪酸(溶于含30％吡啶的甲苯v/v混合物中的具有7-25个碳原子的脂肪酸每种0.3mg和具有27、29和31个碳原子的脂肪酸每种0.6mg/ml)作为时间标准。最后，50μlN-甲基-N-(三甲基硅烷基)-2，2，2-三氟乙酰胺(MSTFA)用于在容器中进行衍生作用，再次将该容器紧密封闭，于60℃进行30分钟。GC注射前最终体积为110μl。
g)多种植物样品的分析将植物样品以每20个植物样品的单一系列(所谓的系列)进行测量，每一系列包含至少5种野生型植物作为对照。每种分析物的峰面积或峰高除以各自内标准的峰面积。将数据标准化至植物的最初鲜重。通过将它们除以同一系列野生型对照组相应数据的平均值使以该方式计算出的值与野生型对照组相关。所得数据作为x倍，对所有系列是可比的并且表明分析物浓度与相对野生型对照的突变体有多大的不同。
另外，使用Geigenberger等(Plant Cell & Environ，19，199643-55)的方法通过HPLC分析乙醇提取级分能够方便地检测氨基酸。
对植物多种分析的结果显示于下表YEL046C
表中第1栏表示样品编号。所分析的氨基酸显示于第2栏。第3栏显示转基因植物和野生型之间所分析氨基酸的比率。第4栏显示与不是用苏氨酸醛缩酶基因转化的其它转基因植物的中位数相比的所述转基因植物的比率。第5栏显示分析方法。所有结果显示在独立重复分析上是有意义的。
YJL055w
表中第1栏表示分析物编号。所分析的氨基酸显示于第2栏。第3栏显示转基因植物和野生型之间所分析氨基酸的比率(按照Ratio_by_WT方法)的倍数。第4栏显示分析方法。
所有结果显示在独立重复分析上是有意义的。
序列表<110> 梅坦诺米克斯有限及两合公司<120> 制备氨基酸的方法<130> 2002_960<140> PF54195<141> 2002-12-20<160> 26<170> PatentIn版本3.1<210> 1<211> 1164<212> DNA<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)<220>
<221> CDS<222> (1)..(11 64)<223> 苏氨酸醛缩酶<400> 1atg act gaa ttc gaa ttg cct cca aaa tat atc acc gct gct aac gac 48Met Thr Glu Phe Glu Leu Pro Pro Lys Tyr Ile Thr Ala Ala Asn Asp1 5 10 15ttg cgg tca gac aca ttc acc act cca act gca gag atg atg gag gcc 96Leu Arg Ser Asp Thr Phe Thr Thr Pro Thr Ala Glu Met Met Glu Ala20 25 30gct tta gag gcc tct atc ggt gac gct gtc tac ggt gaa gat gtt gac 144Ala Leu Glu Ala Ser Ile Gly Asp Ala Val Tyr Gly Glu Asp Val Asp35 40 45acc gtt agg ctc gaa cag acc gtt gcc cgc atg gct ggc aaa gaa gca 192Thr Val Arg Leu Glu Gln Thr Val Ala Arg Met Ala Gly Lys Glu Ala50 55 60ggt ttg ttc tgt gtc tct ggg act ttg tcc aac cag att gcc atc aga 240Gly Leu Phe Cys Val Ser Gly Thr Leu Ser Asn Gln Ile Ala Ile Arg
65 70 75 80act cac ttg atg caa cct cca tac tct att cta tgt gat tac agg gct 288Thr His Leu Met Gln Pro Pro Tyr Ser Ile Leu Cys Asp Tyr Arg Ala85 90 95cac gtt tac act cac gaa gcc gct gga ctg gcg atc ttg tct caa gcg 336His Val Tyr Thr His Glu Ala Ala Gly Leu Ala Ile Leu Ser Gln Ala100 105 110atg gtg gtt cct gtg gtt cct tcc aac ggt gac tac ttg acc ttg gaa 384Met Val Val Pro Val Val Pro Ser Asn Gly Asp Tyr Leu Thr Leu Glu115 120 125gac atc aag tca cac tac gtc cca gac gac ggt gat att cac ggt gcc 432Asp Ile Lys Ser His Tyr Val Pro Asp Asp Gly Asp Ile His Gly Ala130 135 140ccc acc aga ttg att tct ctg gaa aac act tta cac ggt att gtt tat 480Pro Thr Arg Leu Ile Ser Leu Glu Asn Thr Leu His Gly Ile Val Tyr145 150 155 160cca ttg gaa gaa ctg gtc cgc atc aaa gct tgg tgt atg gaa aat ggt 528Pro Leu Glu Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Trp Cys Met Glu Asn Gly165 170 175ctc aaa cta cat tgt gac ggt gcc aga atc tgg aat gcc gct gca caa 576Leu Lys Leu His Cys Asp Gly Ala Arg Ile Trp Asn Ala Ala Ala Gln180 185 190tct ggc gtg cca tta aag caa tat ggg gaa atc ttc gac tcc atc tcc 624Ser Gly Val Pro Leu Lys Gln Tyr Gly Glu Ile Phe Asp Ser Ile Ser195 200 205atc tgt cta tcc aag tct atg ggt gct cct att ggg tcc gtc ttg gtt 672Ile Cys Leu Ser Lys Ser Met Gly Ala Pro Ile Gly Ser Val Leu Val210 215 220ggg aac ctt aag ttt gtc aag aag gcc acc cat ttc aga aaa caa caa 720Gly Asn Leu Lys Phe Val Lys Lys Ala Thr His Phe Arg Lys Gln Gln225 230 235 240ggt ggt ggt att aga caa tct ggt atg atg gct aga atg gct ctt gta 768Gly Gly Gly Ile Arg Gln Ser Gly Met Met Ala Arg Met Ala Leu Val245 250 255aac atc aac aac gat tgg aag tcc caa ttg ctg tac tcg cac tct ttg 816Asn Ile Asn Asn Asp Trp Lys Ser Gln Leu Leu Tyr Ser His Ser Leu260 265 270gct cat gaa tta gcc gaa tat tgt gag gca aag ggc atc ccg cta gag 864Ala His Glu Leu Ala Glu Tyr Cys Glu Ala Lys Gly Ile Pro Leu Glu275 280 285tct cca gca gac acc aac ttt gtc ttt att aac ctg aag gcc gct aga 912Ser Pro Ala Asp Thr Asn Phe Val Phe Ile Asn Leu Lys Ala Ala Arg290 295 300atg gac cca gat gtc ctt gtt aag aag ggt ttg aag tac aac gtt aag 960Met Asp Pro Asp Val Leu Val Lys Lys Gly Leu Lys Tyr Asn Val Lys305 310 315 320cta atg ggt ggt aga gtc tcg ttc cac tat caa gtc acc aga gat act 1008
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Leu Lys Leu His Cys Asp Gly Ala Arg Ile Trp Asn Ala Ala Ala Gln180 185 190Ser Gly Val Pro Leu Lys Gln Tyr Gly Glu Ile Phe Asp Ser Ile Ser195 200 205Ile Cys Leu Ser Lys Ser Met Gly Ala Pro Ile Gly Ser Val Leu Val210 215 220Gly Asn Leu Lys Phe Val Lys Lys Ala Thr His Phe Arg Lys Gln Gln225 230 235 240Gly Gly Gly Ile Arg Gln Ser Gly Met Met Ala Arg Met Ala Leu Val245 250 255Asn Ile Asn Asn Asp Trp Lys Ser Gln Leu Leu Tyr Ser His Ser Leu260 265 270Ala His Glu Leu Ala Glu Tyr Cys Glu Ala Lys Gly Ile Pro Leu Glu275 280 285Ser Pro Ala Asp Thr Asn Phe Val Phe Ile Asn Leu Lys Ala Ala Arg290 295 300Met Asp Pro Asp Val Leu Val Lys Lys Gly Leu Lys Tyr Asn Val Lys305 310 315 320Leu Met Gly Gly Arg Val Ser Phe His Tyr Gln Val Thr Arg Asp Thr325 330 335Leu Glu Lys Val Lys Leu Ala Ile Ser Glu Ala Phe Asp Tyr Ala Lys340 345 350Glu His Pro Phe Asp Cys Asn Gly Pro Thr Gln Ile Tyr Arg Ser Glu355 360 365Ser Thr Glu Val Asp Val Asp Gly Asn Ala Ile Arg Glu Ile Lys Thr370 375 380Tyr Lys Tyr385<210> 3<211> 376<212> PRT<213> 卡诺拉油菜(Canola)<400> 3Gly Cys Phe Ala Cys Tyr Leu Val Gly Gly Phe Ser Val Gln Glu Lys1 5 10 15Met Val Thr Arg Ile Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro20 25 30Thr Glu Ala Met Arg Ala Ala Met Ala Ser Ala Glu Val Asp Asp Asp35 40 45Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Phe Arg Leu Glu Thr Glu Met Ala
50 55 60Lys Thr Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met65 70 75 80Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Val His Cys Asp Val Arg Gly Ser Glu85 90 95Val Ile Leu Gly Asp Asn Cys His Ile Asn Ile Phe Glu Asn Gly Gly100 105 110Ile Ala Thr Ile Gly Gly Val His Pro Arg Gln Val Lys Asn Asn Asp115 120 125Asp Gly Thr Met Asp Ile Asp Leu Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Pro130 135 140Met Gly Glu Leu Phe Tyr Pro Thr Thr Lys Leu Ile Cys Leu Glu Asn145 150 155 160Thr His Ala Asn Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Val Glu Tyr Thr Asp165 170 175Arg Val Gly Glu Leu Ala Lys Lys His Gly Leu Lys Leu His Ile Aspl80 185 190Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ser Val Ala Leu Gly Val Pro Val Asp195 200 205Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly210 215 220Ile Gly Ala Pro Val Gly Ser Val Ile Val Gly Ser Lys Asn Phe Ile225 230 235 240Ala Lys Ala Arg Arg Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln245 250 255Ile Gly Leu Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Val260 265 270Gly Lys Leu Glu Ser Asp His Lys Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly275 280 285Leu Asn Glu Val Lys Gly Leu Arg Val Asp Ala Cys Ser Val Glu Thr290 295 300Asn Met Val Phe Ile Asp Ile Glu Glu Gly Thr Lys Thr Arg Ala Glu305310 315 320Lys Ile Cys Lys Tyr Met Glu Glu Arg Gly Ile Leu Val Met Gln Glu325 330 335Ser Ser Ser Arg Met Arg Val Val Leu His His Gln Ile Ser Ala Ser340 345 350Asp Val Gln Tyr Ala Leu Ser Cys Phe Gln Gln Ala Leu Ala Val Lys355 360 365Gly Val Gln Lys Glu Met Gly Asn370 375
<210> 4<211> 115<212> PRT<213> 大豆<400> 4Leu Phe Gly Leu Leu Ala Ile Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Lys Met Val1 5 10 15Pro Arg Ile Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro Ser Glu20 25 30Ala Met Arg Ala Ala Met Ala Ser Ala Glu Val Asp Asp Asp Val Leu35 40 45Gly Arg Asp Pro Ser Cys Phe Arg Leu Glu Thr Glu Met Ala Lys Ile50 55 60Leu Gly Lys Glu Gly Ala Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met Ala Asn65 70 75 80Leu Ile Ser Val Leu Val His Cys Asp Ile Arg Gly Ser Glu Val Ile85 90 95Leu Gly Asp Asn Ser His Ile His Ile Tyr Glu Asn Gly Gly Ile Ala100 105 110Thr Leu Gly115<210> 5<211> 127<212> PRT<213> 稻<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(127)<223> 未知或其它<400> 5Lys Thr Leu Xaa Gly Gly Met Arg Gln Val Gly Ile Leu Cys Ala Ala1 5 10 15Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Val Gly Lys Leu Gln Ser Asp His20 25 30
Asn Lys Ala Lys Leu Leu Ala Asp Gly Leu Asn Glu Ile Lys Gly Leu35 40 45Arg Val Asp Ile Ser Ser Val Glu Thr Asn Ile Ile Tyr Val Glu Val50 55 60Glu Glu Gly Ser Arg Ala Thr Ala Ala Lys Leu Cys Lys Asp Leu Glu65 70 75 80Asp Tyr Gly Ile Leu Leu Met Pro Met Gly Ser Ser Arg Leu Arg Ile85 90 95Val Phe His His Gln Ile Ser Ala Ser Asp Val Gln Tyr Ala Leu Ser100 105 110Cys Phe Gln Gln Ala Val Asn Gly Val Arg Asn Glu Asn Gly Asn115 120 125<210> 6<211> 147<212> PRT<213> 稻<400> 6Gly Arg Arg Phe Arg Ala Ile Arg Asp Pro Met Gly Glu Leu Phe Tyr1 5 10 15Pro Thr Thr Lys Leu Ile Cys Leu Glu Asn Thr His Ala Asn Ser Gly20 25 30Gly Arg Cys Leu Ser Val Glu Tyr Thr Asp Arg Val Gly Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys His Gly Leu Lys Leu His Ile Asp Gly Ala Arg Ile Phe Asn50 55 60Ala Ser Val Ala Leu Gly Val Pro Val Asp Arg Leu Val Gln Ala Ala65 70 75 80Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly Ile Gly Ala Pro Val Gly85 90 95Ser Val Ile Val Gly Ser Lys Asn Phe Ile Ala Lys Ala Arg Arg Leu100 105 110Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln Ile Gly Leu Leu Cys Ala115 120 125Ala Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Val Gly Lys Leu Glu Ser Asp130 135 140His Lys Lys145
<210> 7<211> 169<212> PRT<213> 卡诺拉油菜<220>
<221> misc_feature<222> (1)..(169)<223> 未知或其它<400> 7Gly Ile Pro Gly Xaa Thr Phe Arg Gly Asp Val Ala Lys Ser His Gly1 5 10 15Leu Lys Leu His Ile Asp Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ser Val Ala20 25 30Leu Gly Val Pro Val His Arg Leu Val Lys Ala Ala Asp Ser Val Ser35 40 45Val Cys Ile Ser Lys Gly Leu Gly Ala Pro Val Gly Ser Val Ile Val50 55 60Gly Ser Thr Ala Phe Ile Glu Lys Ala Lys Ile Leu Thr Lys Thr Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Met Arg Gln Val Gly Ile Leu Cys Ala Ala Ala Tyr Val85 90 95Ala Val Arg Asp Thr Val Gly Lys Leu Ala Asp Asp His Arg Arg Ala100 105 110Lys Val Leu Ala Asp Gly Leu Lys Lys Ile Lys His Phe Arg Val Asp115 120 125Thr Thr Ser Val Glu Thr Asn Met Val Phe Phe Asp Ile Val Asp Ser130 135 140Arg Ile Ser Pro Asp Lys Leu Cys Gln Val Leu Glu Gln Arg Asn Val145 150 155 160Leu Ala Met Pro Ala Gly Ser Lys Arg165
<210> 8<211> 362<212> PRT<213> 卡诺拉油菜<400> 8Ile Glu Ile Lys Met Val Met Arg Thr Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr1 5 10 15Val Thr Arg Pro Thr Asp Ala Met Arg Glu Ala Met Gly Ser Ala Glu20 25 30Val Asp Asp Asp Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Arg Arg Leu Glu35 40 45Glu Glu Ile Ala Lys Met Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro50 55 60Ser Gly Thr Met Gly Asn Leu Ile Cys Val Met Val His Cys Asp Val65 70 75 80Arg Gly Ser Glu Val Ile Leu Gly Asp Asn Cys His Ile His Val Tyr85 90 95Glu Asn Gly Gly Ile Ser Thr Ile Gly Gly Val His Pro Lys Thr Ile100 105 110Lys Asn Glu Glu Asp Gly Thr Met Asp Leu Gly Ala Ile Glu Ala Ala115 120 125Ile Arg Asp Pro Lys Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Ser Thr Arg Leu Ile130 135 140Cys Leu Glu Asn Thr His Ala Asn Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Ala145 150 155 160Glu Tyr Thr Asp Arg Val Gly Glu Ile Ala Lys Arg His Gly Leu Lys165 170 175Leu His Ile Asp Gly Ala Arg Leu Phe Asn Ala Ser Ile Ala Leu Gly180 185 190Val Pro Val His Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys195 200 205Leu Ser Lys Gly Leu Gly Ala Pro Ile Gly Ser Val Val Val Gly Ser210 215 220Gln Ser Phe Ile Glu Lys Ala Lys Thr Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly225 230 235 240Gly Met Arg Gln Ile Gly Val Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Ala Leu245 250 255
Gln Glu Asn Leu Pro Lys Leu Gln Phe Asp His Lys Lys Thr Lys Leu260 265 270Leu Ala Glu Gly Leu Ash Gln Met Lys Gly Ile Arg Val Asn Val Ala275 280 285Ala Met Glu Thr Asn Met Ile Phe Met Asp Met Glu Asp Gly Ser Lys290 295 300Leu Thr Ala Glu Lys Leu Arg Lys Ser Leu Thr Glu His Gly Ile Leu305 310 315 320Val Ile Pro Glu Asn Ser Thr Arg Ile Arg Met Val Leu His His Gln325 330 335Ile Thr Thr Ser Asp Val His Tyr Thr Leu Ser Cys Leu Gln Gln Ala340 345 350Val Gln Thr Ile His Glu Pro Cys Gln Asn355 360<210> 9<211> 196<212> PRT<213> 卡诺拉油菜<400> 9Gly Phe Leu Leu Lys His Lys Tyr Ile Tyr Tyr Cys Cys Tyr Leu Phe1 5 10 15Glu Ser Lys Ser Asn Asn Phe Leu Phe Ser Val Ile Lys Met Val Thr20 25 30Pro Val Ile Arg Thr Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro35 40 45Thr Glu Ser Met Arg Ser Ala Met Ala Asn Ala Glu Val Asp Asp Asp50 55 60Val Leu Gly Asn Asp Pro Thr Ala Val Leu Leu Glu Arg Glu Val Ala65 70 75 80Glu Ile Ala Gly Lys Glu Ala Ala Met Phe Val Pro Ser Gly Thr Met85 90 95Gly Asn Leu Ile Ser Val Leu Val His Cys Asp Glu Arg Gly Ser Glu100 105 110Val Ile Leu Gly Asp Asp Ser His Ile His Ile Tyr Glu Asn Gly Gly115 120 125Val Ser Ser Leu Gly Gly Val His Pro Arg Thr Val Lys Asn Glu Glu130 135 140Asp Gly Thr Met Glu Ile Ser Ser Ile Glu Ala Ala Val Arg Ser Pro145 150 155 160Thr Gly Asp Leu His Tyr Pro Val Thr Lys Leu Ile Cys Leu Glu Asn
165 170 175Thr Gln Ala Asn Cys Gly Gly Arg Cys Leu Pro Ile Glu Tyr Ile Asp180 185 190Lys Val Gly Glu195<210> 10<211> 104<212> PRT<213> 大豆<400> 10Ile Gly Ile Lys Met Val Met Arg Ile Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr1 5 10 15Val Thr Arg Pro Thr Asp Ala Met Arg Glu Ala Met Ala Ser Ala Glu20 25 30Val Asp Asp Asp Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Arg Gly Leu Glu35 40 45Glu Glu Met Ala Lys Met Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro50 55 60Ser Gly Thr Met Gly Asn Leu Ile Cys Val Met Val His Cys Asp Val65 70 75 80Arg Gly Ser Glu Val Ile Leu Gly Asp Thr Cys His Ile His Val Tyr85 90 95Glu Asn Gly Gly Ile Ser Thr Ile100<210> 11<211> 738<212> DNA<213> 酿酒酵母<220>
<221> CDS<222> (1)..(738)<223> 与赖氨酸脱羧酶类似的蛋白质<400> 11atg aca atg gaa aaa aat gga ggt aat agc agc cgt ggt ggc caa gta 48Met Thr Met Glu Lys Asn Gly Gly Asn Ser Ser Arg Gly Gly Gln Val1 5 10 l5
ggc ggc aag tct gtg tgt gtt tac tgc ggg tct tca ttt ggc gct aag 96Gly Gly Lys Ser Val Cys Val Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ala Lys20 25 30gcg cta tac tca gaa agt gca gaa gaa tta gga gcc ctt ttc cat aag 144Ala Leu Tyr Ser Glu Ser Ala Glu Glu Leu Gly Ala Leu Phe His Lys35 40 45ctg gga tgg aaa ttg gta tac ggt gga ggc act act ggt ttg atg ggc 192Leu Gly Trp Lys Leu Val Tyr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Leu Met Gly50 55 60aag ata gca agg tct acg atg gga cct gat tta agc gga cag gtt cac 240Lys Ile Ala Arg Ser Thr Met Gly Pro Asp Leu Ser Gly Gln Val His65 70 75 80ggt atc att cca aat gca ctt gtg tct aag gaa agg aca gac gag gat 288Gly Ile Ile Pro Asn Ala Leu Val Ser Lys Glu Arg Thr Asp Glu Asp85 90 95aaa gaa gat gtt aat aaa gca ttg ttg gag tct gta gaa aat cat aag 336Lys Glu Asp Val Asn Lys Ala Leu Leu Glu Ser Val Glu Asn His Lys100 105 110ggc gcc act cct att tct gaa gag tat ggg gaa aca acg att gta cca 384Gly Ala Thr Pro Ile Ser Glu Glu Tyr Gly Glu Thr Thr Ile Val Pro115 120 125gat atg cat acg aga aaa aga atg atg gca aat ttg agt gac gcg ttt 432Asp Met His Thr Arg Lys Arg Met Met Ala Asn Leu Ser Asp Ala Phe130 135 140gtt gct atg cct ggt gga tac ggg act ttt gaa gaa atc atg gaa tgt 480Val Ala Met Pro Gly Gly Tyr Gly Thr Phe Glu Glu Ile Met Glu Cys145 150 155 160atc acg tgg tcg caa ctg ggg att cat aat aaa cca att atc ttg ttc 528Ile Thr Trp Ser Gln Leu Gly Ile His Asn Lys Pro Ile Ile Leu Phe165 170 175aat atc gat ggg ttc tat gac aaa tta ttg gag ttc ctc aaa cac tct 576Asn Ile Asp Gly Phe Tyr Asp Lys Leu Leu Glu Phe Leu Lys His Ser180 185 190att caa gaa cgg ttc atc agt gtg aag aat ggt gaa atc att caa gtt 624Ile Gln Glu Arg Phe Ile Ser Val Lys Asn Gly Glu Ile Ile Gln Val195 200 205gcc tcc act ccg cag gaa gtt gtt gat aaa ata gag aag tac gtc gtt 672Ala Ser Thr Pro Gln Glu Val Val Asp Lys Ile Glu Lys Tyr Val Val210 215 220cca gag ggc cgt ttc aat ttg aat tgg agc gac gaa ggt cac gct cac 720Pro Glu Gly Arg Phe Asn Leu Asn Trp Ser Asp Glu Gly His Ala His225 230 235 240gag gat tgt gct aaa taa 738Glu Asp Cys Ala Lys245
<210> 12<211> 245<212> PRT<213> 酿酒酵母<400> 12Met Thr Met Glu Lys Asn Gly Gly Asn Ser Ser Arg Gly Gly Gln Val1 5 10 15Gly Gly Lys Ser Val Cys Val Tyr Cys Gly Ser Ser Phe Gly Ala Lys20 25 30Ala Leu Tyr Ser Glu Ser Ala Glu Glu Leu Gly Ala Leu Phe His Lys35 40 45Leu Gly Trp Lys Leu Val Tyr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Leu Met Gly50 55 60Lys Ile Ala Arg Ser Thr Met Gly Pro Asp Leu Ser Gly Gln Val His65 70 75 80Gly Ile Ile Pro Asn Ala Leu Val Ser Lys Glu Arg Thr Asp Glu Asp85 90 95Lys Glu Asp Val Asn Lys Ala Leu Leu Glu Ser Val Glu Asn His Lys100 105 110Gly Ala Thr Pro Ile Ser Glu Glu Tyr Gly Glu Thr Thr Ile Val Pro115 120 125Asp Met His Thr Arg Lys Arg Met Met Ala Asn Leu Ser Asp Ala Phe130 135 140Val Ala Met Pro Gly Gly Tyr Gly Thr Phe Glu Glu Ile Met Glu Cys145150 155 160Ile Thr Trp Ser Gln Leu Gly Ile His Asn Lys Pro Ile Ile Leu Phe165 170 175Asn Ile Asp Gly Phe Tyr Asp Lys Leu Leu Glu Phe Leu Lys His Ser180 185 190Ile Gln Glu Arg Phe Ile Ser Val Lys Asn Gly Glu Ile Ile Gln Val195 200 205Ala Ser Thr Pro Gln Glu Val Val Asp Lys Ile Glu Lys Tyr Val Val210 215 220Pro Glu Gly Arg Phe Asn Leu Asn Trp Ser Asp Glu Gly His Ala His225 230 235 240Glu Asp Cys Ala Lys245<210> 13<211> 1083<212> DNA<213> 大豆
<220>
<221> CDS<222> (1)..(1083)<223> 苏氨酸醛缩酶<400> 13atg gta act aga att gtg gat ctt cgg tca gac aca gtt aca aag cca 48Met Val Thr Arg Ile Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro1 5 10 15act gaa gca atg aga gct gct atg gca agt gct gaa gtt gat gac gat 96Thr Glu Ala Met Arg Ala Ala Met Ala Ser Ala Glu Val Asp Asp Asp20 25 30gtt cta ggc tat gat cca act gct ttt cgc tta gaa aca gag atg gca 144Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Phe Arg Leu Glu Thr Glu Met Ala35 40 45aag aca atg ggc aaa gaa gct gct ctt ttt gtt cca tct ggc act atg 192Lys Thr Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met50 55 60ggg aac ctt gta tct gta ctt gtt cat tgt gat gtc agg gga agt gag 240Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Val His Cys Asp Val Arg Gly Ser Glu65 70 75 80gtt att ctt gga gac aat tgc cat atc aac att ttt gag aat gga ggc 288Val Ile Leu Gly Asp Asn Cys His Ile Asn Ile Phe Glu Asn Gly Gly85 90 95att gca acc att ggg gga gtg cat cca aga caa gtg aaa aat aac gat 336Ile Ala Thr Ile Gly Gly Val His Pro Arg Gln Val Lys Asn Asn Asp100 105 110gat gga acc atg gac att gat ttg att gag gct gct atc agg gac cca 384Asp Gly Thr Met Asp Ile Asp Leu Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Pro115 120 125atg ggg gag cta ttc tat cca acc acc aag ctt att tgc ttg gaa aat 432Met Gly Glu Leu Phe Tyr Pro Thr Thr Lys Leu Ile Cys Leu Glu Asn130 135 140act cat gca aac tct ggt ggc aga tgc ctc tca gtt gaa tat aca gac 480Thr His Ala Asn Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Val Glu Tyr Thr Asp145 150 155 160aga gtt gga gag tta gct aag aag cat gga ctg aag ctt cac att gat 528Arg Val Gly Glu Leu Ala Lys Lys His Gly Leu Lys Leu His Ile Asp165 170 175ggg gcc cgt att ttt aac gca tca gtt gca crt ggt gtt cca gtg gat 576Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ser Val Ala Leu Gly Val Pro Val Asp180185 190agg ctt gtc cag gcg gct gat tca gtt tcc gtt tgc cta tct aaa ggt 624Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly
195 200 205ata ggt gct cca gtt gga tct gtt att gtt ggt tcc aag aat ttt att 672Ile Gly Ala Pro Val Gly Ser Val Ile Val Gly Ser Lys Asn Phe Ile210 215 220gcc aag gct aga cga ctc cgg aaa acc tta gga ggt gga atg aga cag 720Ala Lys Ala Arg Arg Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln225 230 235 240att ggc ctc ctt tgt gcc gct gca ctt gtt gcc ttg cag gaa aat gtt 768Ile Gly Leu Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Val245 250 255ggg aag ctg gaa agt gat cac aag aaa gct aga ctt ttg gct gat gga 816Gly Lys Leu Glu Ser Asp His Lys Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly260 265 270tta aac gaa gtt aaa gga ttg aga gtg gat gcc tgt tct gtg gag acc 864Leu Asn Glu Val Lys Gly Leu Arg Val Asp Ala Cys Ser Val Glu Thr275 280 285aat atg gta ttt att gac att gaa gag ggt aca aag act aga gca gaa 912Asn Met Val Phe Ile Asp Ile Glu Glu Gly Thr Lys Thr Arg Ala Glu290 295 300aag ata tgc aag tac atg gaa gaa cgt ggt atc ctt gtg atg caa gag 960Lys Ile Cys Lys Tyr Met Glu Glu Arg Gly Ile Leu Val Met Gln Glu305 310 315 320agt tca tca aga atg aga gtt gtt ctc cat cac caa ata tca gca agt 1008Ser Ser Ser Arg Met Arg Val Val Leu His His Gln Ile Ser Ala Ser325 330 335gat gtg caa tat gcc ttg tcg tgc ttt cag caa gct cta gct gtc aaa 1056Asp Val Gln Tyr Ala Leu Ser Cys Phe Gln Gln Ala Leu Ala Val Lys340 345 350gga gta caa aag gaa atg ggc aac taa 1083Gly Val Gln Lys Glu Met Gly Asn355 360<210> 14<211> 360<212> PRT<213> 大豆<400> 14Met Val Thr Arg Ile Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Lys Pro1 5 10 15Thr Glu Ala Met Arg Ala Ala Met Ala Ser Ala Glu Val Asp Asp Asp20 25 30Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Phe Arg Leu Glu Thr Glu Met Ala35 40 45Lys Thr Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met
50 55 60Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Val His Cys Asp Val Arg Gly Ser Glu65 70 75 80Val Ile Leu Gly Asp Asn Cys His Ile Asn Ile Phe Glu Asn Gly Gly85 90 95lle Ala Thr Ile Gly Gly Val His Pro Arg Gln Val Lys Asn Asn Asp100 105 110Asp Gly Thr Met Asp Ile Asp Leu Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Pro115 120 125Met Gly Glu Leu Phe Tyr Pro Thr Thr Lys Leu Ile Cys Leu Glu Asn130 135 140Thr His Ala Asn Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Val Glu Tyr Thr Asp145 150 155 160Arg Val Gly Glu Leu Ala Lys Lys His Gly Leu Lys Leu His Ile Asp165 170 175Gly Ala Arg Ile Phe Asn Ala Ser Val Ala Leu Gly Val Pro Val Asp180 185 190Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly195 200 205Ile Gly Ala Pro Val Gly Ser Val Ile Val Gly Ser Lys Asn Phe Ile210 215 220Ala Lys Ala Arg Arg Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln225 230 235 240Ile Gly Leu Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Val245 250 255Gly Lys Leu Glu Ser Asp His Lys Lys Ala Arg Leu Leu Ala Asp Gly260 265 270Leu Asn Glu Val Lys Gly Leu Arg Val Asp Ala Cys Ser Val Glu Thr275 280 285Asn Met Val Phe Ile Asp Ile Glu Glu Gly Thr Lys Thr Arg Ala Glu290 295 300Lys Ile Cys Lys Tyr Met Glu Glu Arg Gly Ile Leu Val Met Gln Glu305 310 315 320Ser Ser Ser Arg Met Arg Val Val Leu His His Gln Ile Ser Ala Ser325 330 335Asp Val Gln Tyr Ala Leu Ser Cys Phe Gln Gln Ala Leu Ala Val Lys340 345 350Gly Val Gln Lys Glu Met Gly Asn355 360<210> 15<211> 1077
<212> DNA<213> 欧洲油菜(Brassica napus)<220>
<221> CDS<222> (1)..(1077)<223> 苏氨酸醛缩酶<400> 15atg gtg atg cga act gtg gat cta cgg tca gac acc gtg act aga cct 48Met Val Met Arg Thr Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Arg Pro1 5 10 15acc gat gcc atg cgt gaa gca atg gga agc gca gaa gta gac gat gac 96Thr Asp Ala Met Arg Glu Ala Met Gly Ser Ala Glu Val Asp Asp Asp20 25 30gtc ctc ggc tac gac cca acg gct cga cgt ctt gaa gag gag ata gcc 144Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Arg Arg Leu Glu Glu Glu Ile Ala35 40 45aag atg atg ggg aaa gaa gca gct ctc ttc gtg cca tct ggt aca atg 192Lys Met Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met50 55 60ggg aac ctc ata tgc gtt atg gtt cac tgc gac gtg aga ggc agc gag 240Gly Asn Leu Ile Cys Val Met Val His Cys Asp Val Arg Gly Ser Glu65 70 75 80gtg att ctt gga gac aac tgt cac atc cat gtc tac gag aac gga ggg 288Val Ile Leu Gly Asp Asn Cys His Ile His Val Tyr Glu Asn Gly Gly85 90 95ata tca acg ata gga ggc gtg cat ccc aag aca atc aag aat gaa gaa 336Ile Ser Thr Ile Gly Gly Val His Pro Lys Thr Ile Lys Asn Glu Glu100 105 110gac ggg aca atg gac ttg ggg gct ata gaa gca gct att aga gat cct 384Asp Gly Thr Met Asp Leu Gly Ala Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Pro115 120 125aaa gga agc acg ttt tat cca tca aca agg ttg att tgt ttg gag aac 432Lys Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Ser Thr Arg Leu Ile Cys Leu Glu Asn130 135 140aca cat gcc aac tct ggt ggg aga tgt ttg agt gcg gaa tac aca gat 480Thr His Ala Asn Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Ala Glu Tyr Thr Asp145 150 155 160aga gtt gga gag att gcc aag aga cat gga tta aag ctt cat atc gat 528Arg Val Gly Glu Ile Ala Lys Arg His Gly Leu Lys Leu His Ile Asp165 170 175gga gct cgc ctt ttt aat gct tcc att gca ctt gga gtt cca gtc cat 576Gly Ala Arg Leu Phe Asn Ala Ser Ile Ala Leu Gly Val Pro Val His180 185 190
agg ctt gta cag gct gct gac tct gtt tcg gtg tgt ctc tct aaa ggt 624Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly195 200 205ctt gga gct cca ata gga tct gta gtc gtt ggt tca cag agt ttc ata 672Leu Gly Ala Pro Ile Gly Ser Val Val Val Gly Ser Gln Ser Phe Ile210 215 220gaa aag gcg aaa acg tta aga aaa aca tta ggt gga gga atg aga caa 720Glu Lys Ala Lys Thr Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln225 230 235 240ata ggc gtc ctg tgc gca gcc gct ttg gtc gca ctt caa gag aat ctc 768Ile Gly Val Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Leu245 250 255cca aag tta caa ttt gac cac aag aag aca aaa ttg tta gct gaa ggg 816Pro Lys Leu Gln Phe Asp His Lys Lys Thr Lys Leu Leu Ala Glu Gly260 265 270ttg aat caa atg aaa ggg att aga gtg aac gtt gca gcc atg gag acc 864Leu Asn Gln Met Lys Gly Ile Arg Val Asn Val Ala Ala Met Glu Thr275 280 285aac atg ata ttc atg gat atg gag gat gga tca aaa ctg acc gct gaa 912Asn Met Ile Phe Met Asp Met Glu Asp Gly Ser Lys Leu Thr Ala Glu290 295 300aaa ctc cgc aag agt cta acg gag cat ggc att ctc gtc atc cct gaa 960Lys Leu Arg Lys Ser Leu Thr Glu His Gly Ile Leu Val Ile Pro Glu305 310 315 320aac tct acc cga atc aga atg gtt cta cac cac cag ata aca aca agt 1008Asn Ser Thr Arg Ile Arg Met Val Leu His His Gln Ile Thr Thr Ser325 330 335gat gtg cat tac aca ttg tct tgc tta caa caa gca gtg cag acg att 1056Asp Val His Tyr Thr Leu Ser Cys Leu Gln Gln Ala Val Gln Thr Ile340 345 350cat gaa cca tgc caa aac taa 1077His Glu Pro Cys Gln Asn355<210> 16<211> 358<212> PRT<213> 欧洲油菜<400> 16Met Val Met Arg Thr Val Asp Leu Arg Ser Asp Thr Val Thr Arg Pro1 5 10 15Thr Asp Ala Met Arg Glu Ala Met Gly Ser Ala Glu Val Asp Asp Asp20 25 30Val Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Arg Arg Leu Glu Glu Glu Ile Ala
35 40 45Lys Met Met Gly Lys Glu Ala Ala Leu Phe Val Pro Ser Gly Thr Met50 55 60Gly Asn Leu Ile Cys Val Met Val His Cys Asp Val Arg Gly Ser Glu65 70 75 80Val Ile Leu Gly Asp Asn Cys His Ile His Val Tyr Glu Asn Gly Gly85 90 95Ile Ser Thr Ile Gly Gly Val His Pro Lys Thr Ile Lys Asn Glu Glu100 105 110Asp Gly Thr Met Asp Leu Gly Ala Ile Glu Ala Ala Ile Arg Asp Pro115 120 125Lys Gly Ser Thr Phe Tyr Pro Ser Thr Arg Leu Ile Cys Leu Glu Asn130 135 140Thr His Ala Asn Ser Gly Gly Arg Cys Leu Ser Ala Glu Tyr Thr Asp145 150 155 160Arg Val Gly Glu Ile Ala Lys Arg His Gly Leu Lys Leu His Ile Asp165 170 175Gly Ala Arg Leu Phe Asn Ala Ser Ile Ala Leu Gly Val Pro Val His180 185 190Arg Leu Val Gln Ala Ala Asp Ser Val Ser Val Cys Leu Ser Lys Gly195 200 205Leu Gly Ala Pro Ile Gly Ser Val Val Val Gly Ser Gln Ser Phe Ile210 215 220Glu Lys Ala Lys Thr Leu Arg Lys Thr Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln225 230 235 240Ile Gly Val Leu Cys Ala Ala Ala Leu Val Ala Leu Gln Glu Asn Leu245 250 255Pro Lys Leu Gln Phe Asp His Lys Lys Thr Lys Leu Leu Ala Glu Gly260 265 270Leu Asn Gln Met Lys Gly Ile Arg Val Asn Val Ala Ala Met Glu Thr275 280 285Asn Met Ile Phe Met Asp Met Glu Asp Gly Ser Lys Leu Thr Ala Glu290 295 300Lys Leu Arg Lys Ser Leu Thr Glu His Gly Ile Leu Val Ile Pro Glu305 310 315 320Asn Ser Thr Arg Ile Arg Met Val Leu His His Gln Ile Thr Thr Ser325 330 335Asp Val His Tyr Thr Leu Ser Cys Leu Gln Gln Ala Val Gln Thr Ile340 345 350His Glu Pro Cys Gln Asn355
<210> 17<211> 570<212> DNA<213> 大豆<220>
<221> CDS<222> (1)..(570)<223> 赖氨酸脱羧酶<400> 17atg gaa ata agg gtt tca aag ttc aag agg att tgt gtc ttc tgt ggg 48Met Glu Ile Arg Val Ser Lys Phe Lys Arg Ile Cys Val Phe Cys Gly1 5 10 15agt agc cct ggc aaa aag aga agc tac caa gat gct gcc att gaa ctt 96Ser Ser Pro Gly Lys Lys Arg Ser Tyr Gln Asp Ala Ala Ile Glu Leu20 25 30ggc aat gaa ttg gtc tca agg aac att gat ctg gtg tat gga ggg gga 144Gly Asn Glu Leu Val Ser Arg Asn Ile Asp Leu Val Tyr Gly Gly Gly35 40 45agc att ggt cta atg ggt tta gtt tca caa gct gtt cat gat ggc ggt 192Ser Ile Gly Leu Met Gly Leu Val Ser Gln Ala Val His Asp Gly Gly50 55 60cgg cat gtc atc gga gtt att ccc aag acc ctc atg cct cga gag cta 240Arg His Val Ile Gly Val Ile Pro Lys Thr Leu Met Pro Arg Glu Leu65 70 75 80act ggt gaa aca gtg gga gaa gta aaa gct gtt gct gat atg cac caa 288Thr Gly Glu Thr Val Gly Glu Val Lys Ala Val Ala Asp Met His Gln85 90 95agg aag gca gag atg gcc aag cat tca gac gcc ttt att gcc tta cca 336Arg Lys Ala Glu Met Ala Lys His Ser Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro100 105 110ggt gga tat ggg act cta gag gag ctt ctt gaa gtc ata acc tgg gca 384Gly Gly Tyr Gly Thr Leu Glu Glu Leu Leu Glu Val Ile Thr Trp Ala115 120 125caa ctt ggg att cat gac aag ccg gtg gga tta gta aat gtt gat gga 432Gln Leu Gly Ile His Asp Lys Pro Val Gly Leu Val Asn Val Asp Gly130 135 140tac ttt aat tcc ttg ctg tca ttt att gac aaa gct gtg gaa gag gga 480Tyr Phe Asn Ser Leu Leu Ser Phe Ile Asp Lys Ala Val Glu Glu Gly145 150 155 160ttt atc agt cca aat gct cgc cac ata att gta tca gca ccc aca gca 528Phe Ile Ser Pro Asn Ala Arg His Ile Ile Val Ser Ala Pro Thr Ala165 170 175aaa gag ttg gtg aag aaa ttg gag gat tac gtt ccc tgt taa 570
Lys Glu Leu Val Lys Lys Leu Glu Asp Tyr Val Pro Cys180 185<210> 18<211> 189<212> PRT<213> 大豆<400> 18Met Glu Ile Arg Val Ser Lys Phe Lys Arg Ile Cys Val Phe Cys Gly1 5 10 15Ser Ser Pro Gly Lys Lys Arg Ser Tyr Gln Asp Ala Ala Ile Glu Leu20 25 30Gly Asn Glu Leu Val Ser Arg Asn Ile Asp Leu Val Tyr Gly Gly Gly35 40 45Ser Ile Gly Leu Met Gly Leu Val Ser Gln Ala Val His Asp Gly Gly50 55 60Arg His Val Ile Gly Val Ile Pro Lys Thr Leu Met Pro Arg Glu Leu65 70 75 80Thr Gly Glu Thr Val Gly Glu Val Lys Ala Val Ala Asp Met His Gln85 90 95Arg Lys Ala Glu Met Ala Lys His Ser Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro100 105 110Gly Gly Tyr Gly Thr Leu Glu Glu Leu Leu Glu Val Ile Thr Trp Ala115 120 125Gln Leu Gly Ile His Asp Lys Pro Val Gly Leu Val Asn Val Asp Gly130 135 140Tyr Phe Asn Ser Leu Leu Ser Phe Ile Asp Lys Ala Val Glu Glu Gly145 150 155 160Phe Ile Ser Pro Asn Ala Arg His Ile Ile Val Ser Ala Pro Thr Ala165 170 175Lys Glu Leu Val Lys Lys Leu Glu Asp Tyr Val Pro Cys180 185<210> 19<211> 675<212> DNA<213> 大麦(Hordeum vulgare)<220>
<221> CDS
<222> (1)..(675)<223> 赖氨酸脱羧酶<400> 19atg ggc gac acc acc gcg ccc tcg ccg ccg agg agg ttc ggc agg atc 48Met Gly Asp Thr Thr Ala Pro Ser Pro Pro Arg Arg Phe Gly Arg Ile1 5 10 15tgc gtc ttc tgc ggc agg aac tcc ggc aac cgc gcc gtg ttc ggc gac 96Cys Val Phe Cys Gly Arg Asn Ser Gly Asn Arg Ala Val Phe Gly Asp20 25 30gcc gcg ctc gag ctc ggc cag ggc ctg gtg acg agg ggg gtc gat ctg 144Ala Ala Leu Glu Leu Gly Gln Gly Leu Val Thr Arg Gly Val Asp Leu35 40 45gtc tac ggc ggc ggc agt atc ggg ctg atg ggc ctg atc gcg cag acg 192Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Gly Leu Met Gly Leu Ile Ala Gln Thr50 55 60gtt ctc gac ggc ggc tgc cgc gtc ctc ggg gtg att cca aga gca ctc 240Val Leu Asp Gly Gly Cys Arg Val Leu Gly Val Ile Pro Arg Ala Leu65 70 75 80atg ccc ctc gag ata tcc ggt gca agt gtt gga gaa gta aag att gtc 288Met Pro Leu Glu Ile Ser Gly Ala Ser Val Gly Glu Val Lys Ile Val85 90 95tcc gac atg cat gag agg aaa gct gag atg gcg cga caa gcc gat gca 336Ser Asp Met His Glu Arg Lys Ala Glu Met Ala Arg Gln Ala Asp Ala100 105 110ttc att gct ctt ccg ggt ggg tat gga aca atg gaa gag ctg gta gag 384Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Thr Met Glu Glu Leu Val Glu115 120 125atg atc act tgg tcg cag ctt gga atc cat gac aaa ccg gtc ggg ttg 432Met Ile Thr Trp Ser Gln Leu Gly Ile His Asp Lys Pro Val Gly Leu130 135 140cta aac gtc gat ggg tac tat gat ccg tta ctc gcg ctg ttc gac aag 480Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asp Pro Leu Leu Ala Leu Phe Asp Lys145 150 155 160ggc gcg ggg gaa ggg ttt ttt aag gcc gat tgc agg ccg ata atc gtg 528Gly Ala Gly Glu Gly Phe Phe Lys Ala Asp Cys Arg Pro Ile Ile Val165 170 175tcg gca cca act gcc cac gaa ctg ctg aca aaa atg gag caa tac acc 576Ser Ala Pro Thr Ala His Glu Leu Leu Thr Lys Met Glu Gln Tyr Thr180 185 190cgt tca ccc cgg gag gtg gcc tcg cgg acg agc tgg gag atg acc gag 624Arg Ser Pro Arg Glu Val Ala Ser Arg Thr Ser Trp Glu Met Thr Glu195 200 205atg ggc tcc ggg aaa gca ccg gag ccg gag gag gag gcg gcg gca tcg 672
Met Gly Ser Gly Lys Ala Pro Glu Pro Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ser210 215 220taa 675<210> 20<211> 224<212> PRT<213> 大麦<400> 20Met Gly Asp Thr Thr Ala Pro Ser Pro Pro Arg Arg Phe Gly Arg Ile1 5 10 15Cys Val Phe Cys Gly Arg Asn Ser Gly Asn Arg Ala Val Phe Gly Asp20 25 30Ala Ala Leu Glu Leu Gly Gln Gly Leu Val Thr Arg Gly Val Asp Leu35 40 45Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Gly Leu Met Gly Leu Ile Ala Gln Thr50 55 60Val Leu Asp Gly Gly Cys Arg Val Leu Gly Val Ile Pro Arg Ala Leu65 70 75 80Met Pro Leu Glu Ile Ser Gly Ala Ser Val Gly Glu Val Lys Ile Val85 90 95Ser Asp Met His Glu Arg Lys Ala Glu Met Ala Arg Gln Ala Asp Ala100 105 110Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Thr Met Glu Glu Leu Val Glu115 120 125Met Ile Thr Trp Ser Gln Leu Gly Ile His Asp Lys Pro Val Gly Leu130 135 140Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asp Pro Leu Leu Ala Leu Phe Asp Lys145 150 155 160Gly Ala Gly Glu Gly Phe Phe Lys Ala Asp Cys Arg Pro Ile Ile Val165 170 175Ser Ala Pro Thr Ala His Glu Leu Leu Thr Lys Met Glu Gln Tyr Thr180 185 190Arg Ser Pro Arg Glu Val Ala Ser Arg Thr Ser Trp Glu Met Thr Glu195 200 205Met Gly Ser Gly Lys Ala Pro Glu Pro Glu Glu Glu Ala Ala Ala Ser210 215 220<210> 21<211> 717<212> DNA
<213> 人工<220>
<221> CDS<222> (1)..(717)<223> 赖氨酸脱羧酶<400> 21atg gag gag aat caa gag aag ttt gct ccg gag agc agc ggc ggc gac 48Met Glu Glu Asn Gln Glu Lys Phe Ala Pro Glu Ser Ser Gly Gly Asp1 5 10 15ggt ggt ggc tcg gtg aga acg atc tgc gtc ttc tgc ggc agc agg ccg 96Gly Gly Gly Ser Val Arg Thr Ile Cys Val Phe Cys Gly Ser Arg Pro20 25 30ggg aac cgg ccg tcc ttc agc gct gcg gcg ctc gac ctg ggg aag cag 144Gly Asn Arg Pro Ser Phe Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Lys Gln35 40 45ctg gtc gag agg cag atg aac ctg gtg tac ggc ggc ggc agc ggc ggg 192Leu Val Glu Arg Gln Met Asn Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60ctg atg ggc ctg gtg tcc aag gcc gtc tac gaa ggc ggc cgc cac gtc 240Leu Met Gly Leu Val Ser Lys Ala Val Tyr Glu Gly Gly Arg His Val65 70 75 80ctc ggg gtc atc cct acc gcc ctc cta cct gaa gag gtg tca ggg gag 288Leu Gly Val Ile Pro Thr Ala Leu Leu Pro Glu Glu Val Ser Gly Glu85 90 95aca ttg gga gag gtg aaa gtg gtc agg gac atg cat cag cgc aag gcg 336Thr Leu Gly Glu Val Lys Val Val Arg Asp Met His Gln Arg Lys Ala100 105 110gaa atg gcg aaa cat gcc gac gct ttc atc gcc ctg cca ggt ggt tac 384Glu Met Ala Lys His Ala Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr115 120 125ggg aca atc gaa gaa ctg ctg gag atc ata gcg tgg gcg cag ctg ggc 432Gly Thr Ile Glu Glu Leu Leu Glu Ile Ile Ala Trp Ala Gln Leu Gly130 135 140atc cac agc aaa ccg gtg ggg ttg ctc aac gtg gac ggc tac tac aac 480Ile His Ser Lys Pro Val Gly Leu Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asn145 150 155 160agc ctg ctc tcg ctg ttc gac aag gct gtc gag gag ggc ttc atc gac 528Ser Leu Leu Ser Leu Phe Asp Lys Ala Val Glu Glu Gly Phe Ile Asp165 170 175acc aag gca cgg aac atc ttc gtc ctc gct gac acc gcc gcc gac ctg 576Thr Lys Ala Arg Asn Ile Phe Val Leu Ala Asp Thr Ala Ala Asp Leu
180 185 190ctg act agg ctc acc atg atg gcg cgc ctg gca gcc gac gac gac gat624Leu Thr Arg Leu Thr Met Met Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Asp Asp195 200 205gct act act acc ccc aga gga gac gga gac gga gac gga gac gaa cac672Ala Thr Thr Thr Pro Arg Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Glu His210 215 220aag ggg gcc acc acc gct gca ggc gtc aaa agg aaa agg ggc taa717Lys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Val Lys Arg Lys Arg Gly225 230 235<210> 22<211> 238<212> PRT<213> 人工<400> 22Met Glu Glu Asn Gln Glu Lys Phe Ala Pro Glu Ser Ser Gly Gly Asp1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Val Arg Thr Ile Cys Val Phe Cys Gly Ser Arg Pro20 25 30Gly Asn Arg Pro Ser Phe Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Lys Gln35 40 45Leu Val Glu Arg Gln Met Asn Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60Leu Met Gly Leu Val Ser Lys Ala Val Tyr Glu Gly Gly Arg His Val65 70 75 80Leu Gly Val Ile Pro Thr Ala Leu Leu Pro Glu Glu Val Ser Gly Glu85 90 95Thr Leu Gly Glu Val Lys Val Val Arg Asp Met His Gln Arg Lys Ala100 105 110Glu Met Ala Lys His Ala Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr115 120 125Gly Thr Ile Glu Glu Leu Leu Glu Ile Ile Ala Trp Ala Gln Leu Gly130 135 140Ile His Ser Lys Pro Val Gly Leu Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asn145 150 155 160Ser Leu Leu Ser Leu Phe Asp Lys Ala Val Glu Glu Gly Phe Ile Asp165 170 175
Thr Lys Ala Arg Asn Ile Phe Val Leu Ala Asp Thr Ala Ala Asp Leu180 185 190Leu Thr Arg Leu Thr Met Met Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Asp Asp195 200 205Ala Thr Thr Thr Pro Arg Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Glu His210 215 220Lys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Val Lys Arg Lys Arg Gly225 230 235<210> 23<211> 717<212> DNA<213> 玉米(Zea mays)<220>
<221> CDS<222> (1)..(717)<223> 赖氨酸脱羧酶<400> 23atg gag gag aat caa gag aag ttt gct ccg gag agc agc ggc ggc gac 48Met Glu Glu Asn Gln Glu Lys Phe Ala Pro Glu Ser Ser Gly Gly Asp1 5 10 15ggt ggt ggc tcg gtg aga acg atc tgc gtc ttc tgc ggc agc agg ccg 96Gly Gly Gly Ser Val Arg Thr Ile Cys Val Phe Cys Gly Ser Arg Pro20 25 30ggg aac cgg ccg tcc ttc agc gct gcg gcg ctc gac ctg ggg aag cag 144Gly Asn Arg Pro Ser Phe Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Lys Gln35 40 45ctg gtc gag agg cag atg aac ctg gtg tac ggc ggc ggc agc ggc ggg 192Leu Val Glu Arg Gln Met Asn Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60ctg atg ggc ctg gtg tcc aag gcc gtc tac gaa ggc ggc cgc cac gtc 240Leu Met Gly Leu Val Ser Lys Ala Val Tyr Glu Gly Gly Arg His Val65 70 75 80ctc ggg gtc atc cct acc gcc ctc cta cct gaa gag gtg tca ggg gag 288Leu Gly Val Ile Pro Thr Ala Leu Leu Pro Glu Glu Val Ser Gly Glu85 90 95aca ttg gga gag gtg aaa gtg gtc agg gac atg cat cag cgc aag gcg 336Thr Leu Gly Glu Val Lys Val Val Arg Asp Met His Gln Arg Lys Ala100 105 110gaa atg gcg aaa cat gcc gac gct ttc atc gcc ctg cca ggt ggt tac 384Glu Met Ala Lys His Ala Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr
115 120 125ggg aca atc gaa gaa ctg ctg gag atc ata gcg tgg gcg cag ctg ggc 432Gly Thr Ile Glu Glu Leu Leu Glu Ile Ile Ala Trp Ala Gln Leu Gly130 135 140atc cac agc aaa ccg gtg ggg ttg ctc aac gtg gac ggc tac tac aac 480Ile His Ser Lys Pro Val Gly Leu Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asn145 150 155 160agc ctg ctc tcg ctg ttc gac aag gct gtc gag gag ggc ttc atc gac 528Ser Leu Leu Ser Leu Phe Asp Lys Ala Val Glu Glu Gly Phe Ile Asp165 170 175acc aag gca cgg aac atc ttc gtc ctc gct gac acc gcc gcc gac ctg 576Thr Lys Ala Arg Asn Ile Phe Val Leu Ala Asp Thr Ala Ala Asp Leu180 185 190ctg act agg ctc acc atg atg gcg cgc ctg gca gcc gac gac gac gat 624Leu Thr Arg Leu Thr Met Met Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Asp Asp195 200 205gct act act acc ccc aga gga gac gga gac gga gac gga gac gaa cac 672Ala Thr Thr Thr Pro Arg Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Glu His210 215 220aag ggg gcc acc acc gct gca ggc gtc aaa agg aaa agg ggc taa 717Lys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Val Lys Arg Lys Arg Gly225 230 235<210> 24<211> 238<212> PRT<213> 玉米<400> 24Met Glu Glu Asn Gln Glu Lys Phe Ala Pro Glu Ser Ser Gly Gly Asp1 5 10 15Gly Gly Gly Ser Val Arg Thr Ile Cys Val Phe Cys Gly Ser Arg Pro20 25 30Gly Asn Arg Pro Ser Phe Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Lys Gln35 40 45Leu Val Glu Arg Gln Met Asn Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly50 55 60Leu Met Gly Leu Val Ser Lys Ala Val Tyr Glu Gly Gly Arg His Val65 70 75 80Leu Gly Val Ile Pro Thr Ala Leu Leu Pro Glu Glu Val Ser Gly Glu85 90 95Thr Leu Gly Glu Val Lys Val Val Arg Asp Met His Gln Arg Lys Ala100 105 110Glu Met Ala Lys His Ala Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr
115 120 125Gly Thr Ile Glu Glu Leu Leu Glu Ile Ile Ala Trp Ala Gln Leu Gly130 135 140Ile His Ser Lys Pro Val Gly Leu Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asn145 150 155 160Ser Leu Leu Ser Leu Phe Asp Lys Ala Val Glu Glu Gly Phe Ile Asp165 170 175Thr Lys Ala Arg Asn Ile Phe Val Leu Ala Asp Thr Ala Ala Asp Leu180 185 190Leu Thr Arg Leu Thr Met Met Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Asp Asp195 200 205Ala Thr Thr Thr Pro Arg Gly Asp Gly Asp Gly Asp Gly Asp Glu His210 215 220Lys Gly Ala Thr Thr Ala Ala Gly Val Lys Arg Lys Arg Gly225 230 235<210> 25<211> 672<212> DNA<213> 稻(Oryza sativa)<220>
<221> CDS<222> (1)..(672)<223> 赖氨酸脱羧酶<400> 25atg ggc gac aac agc gcc gcc gcg gcg gcc gtg gcc gcg ccg cgc ggc 48Met Gly Asp Asn Ser Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Gly1 5 10 15agg ttc ggc agg atc tgc gtc ttc tgc ggc agc aac gcc ggc aac cgc 96Arg Phe Gly Arg Ile Cys Val Phe Cys Gly Ser Asn Ala Gly Asn Arg20 25 30gcg gtg ttc ggc gac gcg gcg ctc cag ctc ggg cag gag ctg gtg tcg 144Ala Val Phe Gly Asp Ala Ala Leu Gln Leu Gly Gln Glu Leu Val Ser35 40 45aga ggg atc gag ttg gtc tac ggt ggc ggc agc gtc ggg ttg atg ggc 192Arg Gly Ile Glu Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Val Gly Leu Met Gly50 55 60ttg atc gcg cag acg gtt ctt gat ggc ggc tgc ggt gtt ctc ggg gtg 240Leu Ile Ala Gln Thr Val Leu Asp Gly Gly Cys Gly Val Leu Gly Val65 70 75 80att cca aaa gca ctt atg ccc acc gag ata tca ggt gca agt gtt gga 288
Ile Pro Lys Ala Leu Met Pro Thr Glu Ile Ser Gly Ala Ser Val Gly85 90 95gaa gtg aaa att gtg tct gac atg cat gag agg aaa gct gag atg gca 336Glu Val Lys Ile Val Ser Asp Met His Glu Arg Lys Ala Glu Met Ala100 105 110cgc caa tcc gat gcc ttc atc gct ctt cct gga ggg tat gga aca atg 384Arg Gln Ser Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Thr Met115 120 125gag gag ttg tta gag atg ata act tgg tca caa ctt gga att cat gac 432Glu Glu Leu Leu Glu Met Ile Thr Trp Ser Gln Leu Gly Ile His Asp130 135 140aaa cca gtt ggg ttg ctg aat gtg gac ggt tac tat gat ccg ttg ctt 480Lys Pro Val Gly Leu Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asp Pro Leu Leu145 150 155 160gcg cta ttt gat aag ggt gcg gca gaa gga ttt att aag gcc gat tgc 528Ala Leu Phe Asp Lys Gly Ala Ala Glu Gly Phe Ile Lys Ala Asp Cys165 170 175aga caa ata att gtt tcg gca ccg act gcg cat gag ctg ctg aga aag 576Arg Gln Ile Ile Val Ser Ala Pro Thr Ala His Glu Leu Leu Arg Lys180 185 190atg gag caa tac act cgt tca cac cag gag gta gcg cca cgt aca agc 624Met Glu Gln Tyr Thr Arg Ser His Gln Glu Val Ala Pro Arg Thr Ser195 200 205tgg gag atg tca gag ctt ggt tat gga aag aca cca gag gaa tcg taa 672Trp Glu Met Ser Glu Leu Gly Tyr Gly Lys Thr Pro Glu Glu Ser210 215 220<210> 26<211> 223<212> PRT<213> 稻<400> 26Met Gly Asp ASn Ser Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Gly1 5 10 15Arg Phe Gly Arg Ile Cys Val Phe Cys Gly Ser Asn Ala Gly Asn Arg20 25 30Ala Val Phe Gly Asp Ala Ala Leu Gln Leu Gly Gln Glu Leu Val Ser35 40 45Arg Gly Ile Glu Leu Val Tyr Gly Gly Gly Ser Val Gly Leu Met Gly50 55 60Leu Ile Ala Gln Thr Val Leu Asp Gly Gly Cys Gly Val Leu Gly Val65 70 75 80Ile Pro Lys Ala Leu Met Pro Thr Glu Ile Ser Gly Ala Ser Val Gly
85 90 95Glu Val Lys Ile Val Ser Asp Met His Glu Arg Lys Ala Glu Met Ala100 105 110Arg Gln Ser Asp Ala Phe Ile Ala Leu Pro Gly Gly Tyr Gly Thr Met115 120 125Glu Glu Leu Leu Glu Met Ile Thr Trp Ser Gln Leu Gly Ile His Asp130 135 140Lys Pro Val Gly Leu Leu Asn Val Asp Gly Tyr Tyr Asp Pro Leu Leu145 150 155 160Ala Leu Phe Asp Lys Gly Ala Ala Glu Gly Phe Ile Lys Ala Asp Cys165 170 175Arg Gln Ile Ile Val Ser Ala Pro Thr Ala His Glu Leu Leu Arg Lys180 185 190Met Glu Gln Tyr Thr Arg Ser His Gln Glu Val Ala Pro Arg Thr Ser195 200 205Trp Glu Met Ser Glu Leu Gly Tyr Gly Lys Thr Pro Glu Glu Ser210 215 220
权利要求
1.在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中该方法包括以下步骤a)导入编码苏氨酸降解蛋白质或编码赖氨酸降解蛋白质或编码苏氨酸降解蛋白质和赖氨酸降解蛋白质的核酸序列，或b)导入在转基因生物中增加苏氨酸降解作用或增加赖氨酸降解作用或增加苏氨酸降解作用和赖氨酸降解作用的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所提及的核酸序列。
2.如权利要求1所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中该方法包括以下解决步骤a)导入编码包含以下共有序列的苏氨酸降解蛋白质的核酸序列H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G，或HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG或b)导入在转基因生物中增加苏氨酸降解的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所提及的核酸序列。
3.如权利要求1所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中该方法包括以下解决步骤a)导入编码包含以下共有序列的赖氨酸降解蛋白质的核酸序列G[X]4GIM[X]45M[X]2RK[X]2M[X]11GGXG[X]3E[X]2E[X]3W，或LG[X]9LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE[X]2E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F，或b)导入在转基因生物中增加赖氨酸降解的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所提及的核酸序列。
4.如权利要求1所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中该方法包括以下解决步骤a)导入编码包含以下共有序列的苏氨酸降解蛋白质的核酸序列H[x]2G[X]R[X]19D[X]7K[X]27G，或HXDGAR[X]3A[X]15D[X]4CXSK[X]4PXGS[X]3G[X]7A[X]4K[X]2GGGXRQXG并导入编码包含以下共有序列的赖氨酸降解蛋白质的核酸序列G[X]4GIM[X]45M[X]2RK[X]2M[X]11GGXG[X]3E[X]2E[X]3W，或LG[X]9LVYGG[X]3GIMGXVA[X]9G[X]3GXIP[X]24MHXRK[X]2M[X]6F[X]3PGGXGTXEE[X]2E[X]2TW[X]2IG[X]3KP[X]4N[X]3FY[X]14F，或b)导入编码增加转基因生物中苏氨酸降解和赖氨酸降解的蛋白质的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所提及的核酸序列。
5.如权利要求1所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中在权利要求1-4所使用该方法步骤(a)中导入核酸序列，该序列选自以下核酸序列i)具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ IDNO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23或SEQ ID NO25中所描述序列的核酸序列；ii)通过反向翻译SEQ ID NO2，SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQID NO24或SEQ ID NO26中所描述的氨基酸序列由于遗传密码简并性而获得的核酸序列；以及iii)描述于SEQ ID NO1，SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ IDNO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的核酸序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中所描述氨基酸序列的多肽具有至少50％的同源性，且多肽的生物学活性仅有可忽略的降低。
6.如权利要求1或2或权利要求4和5所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中在方法步骤(a)中导入的核酸序列选自以下核酸序列i)通过反向翻译SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中所描述的氨基酸序列由于遗传密码简并性而获得的核酸序列；ii)通过反向翻译SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中所描述的氨基酸序列而获得的核酸序列的衍生物，并且在氨基酸水平其与上述氨基酸序列具有至少70％的同源性，而多肽的生物学活性仅有可忽略的降低。
7.如权利要求1-6所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中在导入和表达核酸之后培养并收获转基因生物。
8.如权利要求1-7所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中氨基酸是从生物体或培养基或生物体和培养基中分离的。
9.如权利要求1-8所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中氨基酸选自蛋氨酸、高丝氨酸和赖氨酸。
10如权利要求1-9所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中涉及到必需氨基酸蛋氨酸。
11.如权利要求1-10所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中转基因生物是微生物或植物。
12.如权利要求1-11所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中转基因生物是选自棒杆菌属、短杆菌属、埃希氏菌属、芽孢杆菌属、红酵母属、汉逊酵母属、裂殖酵母属、酵母属、假丝酵母属、麦角菌属或黄杆菌属的微生物。
13.如权利要求1-12所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中转基因生物是选自作物植物的植物。
14.如权利要求13所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中转基因生物是选自花生、油菜籽、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、杏树、鳄梨树、月桂树、西葫芦、莴苣、亚麻、大豆、阿月浑子树、紫草科、玉米、小麦、黑麦、燕麦、谷子、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、食用甜菜、茄子、番茄、豌豆、紫花苜蓿和多年生草本和食用作物的植物。
15.如权利要求1-14所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中核酸序列来源于真核生物。
16.如权利要求1-15所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中核酸序列来源于酵母属。
17.如权利要求1-16所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中将核酸序列掺入核酸构建体或载体中用于进行导入和表达。
18.如权利要求1-17所述的在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中将该方法中所制备氨基酸的额外生物合成基因导入生物体。
19.包含如权利要求2-6中所述核酸序列的核酸构建体，其功能性连接至一个或多个调控信号。
20.载体，其包含权利要求2-6中所述核酸序列或权利要求19中所述的核酸构建体。
21.转基因原核或真核生物，其包含至少一条权利要求2-6中所述的核酸序列或至少一个权利要求19中所述的核酸构建体或至少一个权利要求20中所述的载体。
22.如权利要求21所述的转基因原核或真核生物，其是微生物或植物。
23.如权利要求22所述的转基因原核或真核生物，其是棒杆菌属或短杆菌属的微生物。
24.如权利要求22所述的转基因原核或真核生物，其是选自花生、油菜籽、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、杏树、鳄梨树、月桂树、西葫芦、莴苣、亚麻、大豆、阿月浑子树、紫草科、玉米、小麦、黑麦、燕麦、谷子、黑小麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、食用甜菜、茄子、番茄、豌豆、紫花苜蓿和多年生草本和食用作物的植物。
25.权利要求21-24所述的转基因生物或通过权利要求1-18所述方法制备的氨基酸的用途，用于生产动物或人的食物、用于生产化妆品或药物。
26选自序列SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ IDNO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的氨基酸序列。
全文摘要
在转基因生物中制备氨基酸的方法，其中该方法包括以下步骤a)导入编码苏氨酸降解蛋白质或编码赖氨酸降解蛋白质或编码苏氨酸降解蛋白质和赖氨酸降解蛋白质的核酸序列，或b)导入在转基因生物中增加苏氨酸降解作用或增加赖氨酸降解作用或增加苏氨酸降解作用和赖氨酸降解作用的核酸序列，和c)在转基因生物中表达(a)或(b)中所提及的核酸序列。有利地是，在该方法步骤(a)中导入选自以下的核酸序列i)具有SEQ ID NO1，SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23和/或SEQ ID NO25中所描述序列的核酸序列；ii)通过反向翻译SEQ ID NO2，SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQID NO24和/或SEQ ID NO26中所描述的氨基酸序列由于遗传密码简并性而获得的核酸序列；和iii)描述于SEQ ID NO1，SEQ ID NO11；SEQ ID NO13；SEQ ID NO15；SEQ ID NO17；SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23或SEQ ID NO25的核酸序列的衍生物，其编码的多肽在氨基酸水平上与具有SEQ ID NO2，SEQ ID NO12；SEQ ID NO14；SEQ ID NO16；SEQ ID NO18；SEQ ID NO20；SEQ ID NO22；SEQ ID NO24或SEQ ID NO26中所描述氨基酸序列的多肽具有至少50％的同源性，且多肽的生物学活性仅有可忽略的降低。
文档编号C12N9/92GK1729294SQ200380106790
公开日2006年2月1日 申请日期2003年12月19日 优先权日2002年12月20日
发明者O·施米茨, P·普齐奥, A·布劳, R·洛塞, B·文德尔, B·卡姆朗格, G·普勒舍 申请人:梅坦诺米克斯有限及两合公司