一种血液游离dna文库的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种血液游离DNA文库的构建方法。
【背景技术】
[0002] 我国为出生缺陷的高发国，在每年约两千多万的新生儿中，先天性致愚致残缺陷 儿占每年出生人口总数的4% -6%，总数高达120万，占全世界每年500多万出生缺陷儿童 的五分之一。我国政府每年支付一百亿元左右的经费用于唐氏综合征患儿的医疗和社会救 济，存活下来的出生缺陷儿多为终生残疾或智力障碍，无法治愈，由此给社会造成了严重的 经济负担，对家庭造成的心理负担和精神痛苦更是无法用金钱来衡量。
[0003] 出生缺陷是指婴儿在出生之前，在母体子宫里就发生的发育异常以及存在于身体 某些部位的畸形。这些缺陷大多是由各种各样的遗传病引起的。遗传病的种类大致可分为 三类：单基因遗传、多基因遗传病、染色体病。由于染色体病累及的基因数目较多，故症状 通常更严重。在众多染色体异常疾病中，染色体非整倍体导致的残疾及生活障碍尤为明显。 染色体非整倍体是指细胞的染色体数目多或少了一条或多条。新生儿中染色体异常的发病 率为1/160,临床上常见的非整倍体包括了 21三体综合征（唐氏综合征）、18三体综合征 (爱德华氏综合征）、13三体综合征（帕陶氏综合征），以及一些性染色体畸变，例如X单 体（Turner综合征），或性染色体三体，如47XXX(X三体综合征）、47XXY (Klinefelter综合 征）、47XYY(XYY综合征）。其中21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征新生儿发病 率分别为1/800、1/6000、1/10000,是三种最主要的常染色体非整倍体疾病。目前此类疾病 没有有效的治疗方法，只能通过产前诊断减少患儿的出生。
[0004] 相对于该类疾病的传统的检测方法，利用第二代高通量测序技术对胎儿染色体非 整倍体进行检测的方法具有明显的优势。第一，孕12周即可接受无创产前DNA检测：做产 前诊断最佳穿刺抽取羊水时间是妊娠16~20周，而无创产前基因检测更是把时间提前到 了 12周，能够更早的检测出结果并做出相应对策。第二、只需抽取母体外周血进行检测，具 有无创性的优点，避免胎儿宫内感染及流产，避免了传统的方法可能对母体和胎儿的危害。 第三、通过高通量测序技术，实现了对孕妇外周血游离DNA的准确检测，减少了传统检测方 法可能产生的假阳性及假阴性的概率。
[0005] 高通量测序技术又称为下一代测序技术，第二代高通量Ion Proton?测序平台具 有测序通量高、准确度高、成本低、操作简便等优点，在基于Ion Proton?平台进行高通量产 前检测的流程中，文库的制备是非常重要的一步，文库质量的高低将直接影响测序质量的 高低并对检测结果产生影响。
[0006] 现有技术中基于Ion Proton?平台的文库构建方法主要包括以下步骤：
[0007] 1、样本DNA提取；
[0008] 2、将样品DNA与末端修复试剂混合，室温下孵育进行反应；
[0009] 3、对步骤2所得的混匀DNA液进行片段筛选及纯化，得到片段集中的平末端DNA 片段；
[0010] 4、将步骤3所得到的DNA片段与连接酶试剂、接头、特异标签序列反应后纯化，得 到加了接头的DNA片段；
[0011] 5、将步骤4得到的DNA片段加入PCR扩增试剂进行PCR扩增，纯化，得到DNA文 库；
[0012] 上述构建的文库经过检测，之后进行高通量测序，选用IonProton?平台。上述基 于IonProton?平台的文库构建方法的缺点：需要提取游离DNA;磁珠均采用Beckman的 AgencourtAMPureXP磁珠，成本高；不同样本之间的扩增偏差较大，对测序分析产生不利 影响。
【发明内容】
[0013] 本发明目的是提供一种血液游离DNA文库的构建方法，以解决现有技术的不足。
[0014] 本发明采用以下技术方案：
[0015] 本发明第一方面提供了一种血液游离DNA文库的构建方法，包括以下步骤：
[0016] (1)末端修复：将孕妇外周血的血浆与末端修复试剂和末端修复酶混合进行反 应；
[0017] (2)磁珠纯化：将步骤（1)所得到的反应产物进行磁珠纯化得到纯化后的DNA片 段；
[0018] (3)接头连接：将步骤（2)所得到的DNA片段与连接酶、聚合酶、连接反应缓冲液、 接头、标签接头混合进行接头连接反应；
[0019] (4)磁珠筛选、纯化：将步骤（3)所得到的反应产物进行磁珠筛选大小和纯化得到 DNA文库；
[0020] (5)文库混合：QPCR检测文库浓度，不同样本进行等浓度混样；
[0021] (6)文库扩增、磁珠纯化：将步骤（5)得到的混合文库加入扩增试剂和扩增引物进 行PCR扩增，再进行磁珠纯化得到游离DNA文库；
[0022] 其中，步骤（1)中所用的末端修复试剂pH值为7. 5,溶剂为水，溶质为：10mM的 Tris-HCl、50mM 的 NaCl、10mM 的 MgCl2、3mM 的二硫苏糖醇、10mM 的 ATP、10mM 的 dNTPs 混合 液，末端修复酶为l〇U/ y 1的End R印air酶；
[0023] 步骤（2)中所用磁珠为BiocanalMagbeads磁珠；
[0024] 步骤（3)中所用连接酶为400U/ul的T4DNA Ligase，聚合酶为8U/ y 1的Bst WarmStart DNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7. 6,溶剂为水，溶质为：50mM pH8. 0 的 Tris-HCl，10mM 的 KC1，10mM 的二硫苏糖醇、ImM 的 ATP、2nM 的 dNTPs 混合液、10mM 的 (NH4)2S04、2mM 的 MgS04;
[0025] 步骤（4)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠；
[0026] 步骤（6)中所用扩增试剂的pH值为7. 6,溶剂为水，溶质为：2U/ y 1的Hot Start High-Fidelity DNA polymerase、66mM pH8. 9 的 Tris-S04、20mM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgS04、 220 y M的dNTPs混合液；
[0027] 步骤（6)中所用磁珠为Biocanal Magbeads磁珠。
[0028] 步骤（3)所述接头的两条链的序列分别为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2。
[0029] 步骤（3)所述标签接头的序列是由如下正反两个序列组成的Ax Adapter :
[0030] 5' CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
[0031] 5,ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3，；
[0032] 其中的 Ax Adapter 选自：SEQ ID NO: 3 和 4,或 SEQ ID NO: 5 和 6,或 SEQ ID NO: 7 和8，或5￡〇10勵:9和10，或5￡〇10勵：11和12，或5￡〇10勵：13和14，或5￡〇10勵：15 和 16,或 SEQ ID NO: 17 和 18,或 SEQ ID NO: 19 和 20,或 SEQ ID NO: 21 和 22,或 SEQ ID NO: 23 和 24,或 SEQ ID NO: 25 和 26,或 SEQ ID NO: 27 和 28,或 SEQ ID NO: 29 和 30,或 SEQ ID NO: 31 和 32,或 SEQ ID NO: 33 和 34。
[0033] 步骤（4)筛选片段大小为200_300bp。
[0034] 步骤（6)中PCR所用的扩增引物序列为SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 36。
[0035] 本发明第二方面提供了一种血液游离DNA文库，由上述任一方法构建。
[0036] 本发明第三方面提供了一种用于构建血液游离DNA文库的末端修复反应试剂，包 括末端修复试剂和末端修复酶，所述末端修复试剂pH值为7. 5,溶剂为水，溶质为：10mM的 Tris-HCl、50mM 的 NaCl、10mM 的 MgCl2、3mM 的二硫苏糖醇、10mM 的 ATP、10mM 的 dNTPs 混合 液，末端修复酶为l〇U/ y 1的End R印air酶。
[0037] 本发明第四方面提供了一种用于构建血液游离DNA文库的接头连接反应试剂，包 括连接酶、聚合酶和连接反应缓冲液，所述连接酶为400U/ y 1的T4DNA Ligase，聚合酶为 8U/ y 1的Bst WarmStart DNA Polymerase，连接反应缓冲液pH值为7. 6,溶剂为水，溶质 为：50mM PH8. 0 的 Tris-HCl，10mM 的 KC1，10mM 的二硫苏糖醇、ImM 的 ATP、2nM 的 dNTPs 混 合液、10mM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgS04。
[0038] 本发明第五方面提供了一种用于构建血液游离DNA文库的扩增试剂，所述扩 增试剂的pH值为7. 6,溶剂为水，溶质为：2U/ y 1的Hot Start High-Fidelity DNA polymerase、66mM pH8. 9 的 Tris-S04、20mM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgS04、220 yM 的 dNTPs 混合 液。
[0039] 本发明第六方面提供了所述末端修复反应试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂在 构建血液游离DNA文库中的应用。
[0040] 本发明的有益效果：
[0041] 本发明方法与以往的基于Ion Proton?平台的建库方法相比，不需要提取游离 DNA，同时采用Biocanal Magbeads磁珠，步骤简单，成本低，降低了文库的损失，减少了 GC 扩增偏好，提高了建库成功率，同时可提高后续检测结果的准确度。
【附图说明】
[0042] 图1是本发明血液游离DNA文库的构建流程图。
[0043] 图2是采用Agilent Bioanalyzer2100对实施例1混合文库4的检测结果图