一种海洋水产养殖用载体固定化抑菌型水质净化剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于水产养殖及海洋微生物技术领域，具体涉及一种菌群存活繁殖适应性 强的混菌发酵法制海参、大菱鲆和红鳍东方飩等海产品养殖用载体固定化水质净化剂及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 海水是海水养殖动物赖以生存的基本环境条件，俗话说："三分养鱼，七分养水"。 水质的好坏直接影响到它们的生长状况和养殖者的经济效益。随着生活水平的提高，人们 对水产品的需求量日益增加，在捕捞量不能满足市场需求的情况下，高密度的集约化水产 养殖方式得到了迅猛发展。然而，这种养殖模式中水体的污染程度远远超过了水体自身的 净化能力，残存饵料及排泄物在水体中沉积，造成水体自身污染乃至水质恶化，表现为水体 严重富营养化，水体中悬浮物增多，化学需氧量、氨氮、亚硝态氮、硫化氢的含量增加，有害 重金属含量累积，溶解氧下降，水体酸化和臭底。尤其对底息型动物（如海参、大菱鲆和红 鳍东方飩等）尤为严重，轻者影响其生长、发育和繁殖；重者导致疫病频发和直接死亡。
[0003] 现有海水集约化养殖过程中的净水方式一般是采用清池倒池，循环过滤，投放化 学净水剂和微生态制剂等。但普遍存在费时费力和高能耗高成本的缺点；虽然对于突发的 水体恶化，化学净水剂能快速反应转化有害物质，但会对水体环境造成二次污染；微生态制 剂为环境友好型净水方案，但存在菌群活化时间长、存活繁殖适应性差和数量递减等问题。
[0004] 目前用于水环境的微生态制剂的益生菌种主要有光合细菌、芽孢杆菌、乳杆菌、双 歧杆菌、硝化细菌等。这些微生物菌种单一，净化效果有限；基本为淡水菌株，不适用于海水 养殖应用；不产芽孢菌剂存活期短，对环境耐受能力差；有的菌种生长缓慢，使用中"活化" 时间长，导致活菌制剂的加工、保存、运输和使用等问题，阻碍了微生态制剂的研发、生产和 应用。
[0005] 芽孢杆菌是能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌一类细菌，对外界有害因子抵 抗力强，广泛存在于土壤、水体、空气以及动物肠道等中，具有繁殖快、代谢快、生命力强 (无湿状态可耐低温-60°c、芽孢耐高温280°C，耐强酸、耐强碱、抗菌消毒、耐高氧和耐低氧 等）等优点。农业部第2045号公告《饲料添加剂品种目录（2013)》中，允许使用的36种微 生物中有5种芽孢杆菌（地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和侧 孢短芽孢杆菌）。但这些芽孢杆菌多为淡水菌株，不适用于海水养殖，对于专用于海水养殖 的、具有高效海水养殖水体净化作用的芽孢杆菌以及其微生物制剂的研宄很少见。
[0006] 硅藻土是一种生物成因的硅质沉积岩，主要由古代硅藻遗体组成，具有不同的形 状（圆盘状、针状、筒状、羽状等），其化学成份主要是Si0 2，由于具有空隙率高、比表面大、 比重小、耐磨、耐酸、吸附性强、热导性低、隔热阻燃、保温隔音等优良特性，被广泛地应用 于饮食、建材、化工、能源、水处理等行业中。硅藻土的表面及孔内表面分布有大量的硅羟 基，使颗粒表现出一定的表面负电性，使得其在水处理过程中，不但能去除颗粒态和胶体态 的污染物质，还能有效地降低水体浊度和去除水体富营养化的主要污染物磷与氨氮，以及 Hg2+、Pb2+、Cr6+、Cd2+、Cu 2+等重金属离子等有害物质。
[0007] 玉米芯粉是选用优质玉米芯加工而成，为米色或黄褐色，含碳水化合物54. 5%、粗 蛋白质2. 2%、粗脂肪0.4%、粗纤维29. 7%、矿物质1. 2%，比重为0? 3~0? 35,吸附力50~ 70, 一般为制作兽药的载体，是豆饼粉及其它载体的替代品。主要用于生产马杜霉素、胆碱 类、维生素、预混剂和饲料添加剂等十几个兽药及饲料添加剂的载体。它具有比其它植物性 载体成本低、保质期长、流动性好、吸水性强、适口性好等特点。以玉米芯粉为载体生产的兽 药保质期达三年以上重稳定，各项指标及微生物指标均符合国内和国际标准。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于针对上述在海洋水产养殖用微生物制剂中存在的问题，提供一 种适合用于海水养殖的菌群存活繁殖适应性强的载体固定化抑菌型水质净化剂，该净化剂 尤其适合用于海参、大菱鲆和红鳍东方飩等海产品养殖用水体的净化。本发明的载体固 定化抑菌型水质净化剂主要由净水芽孢杆菌混合组成，由海水养殖环境的底泥中分离并 筛选的降解氨氮的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)YB-01 (保藏号为CGMCC-No. 9756， 保藏日期为2014年10月11日）和降解亚硝酸氮的侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus 1&七61'〇8口〇1'11)￥8-02(保藏号为0611〇：4〇.9757，保藏日期为2014年10月11日），以玉米 粉、豆饼粉和玉米浆为主要发酵培养基，以硅藻土和玉米芯粉作为吸附和悬浮载体，加工成 固体粉剂。所述的枯草芽孢杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌YB-02,保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心（地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研宄所，邮编100101)。
[0009] 本发明的目的是通过如下技术方案来完成的：
[0010] 一种载体固定化抑菌型水质净化剂，是将枯草芽孢杆菌YB-01 (CGMCC-No. 9756) 和侧孢短芽孢杆菌YB-02 (CGMCC-No. 9757)的混合发酵菌液吸附固化到复合载体上制备得 到的，其中所述复合载体由硅藻土粉和玉米芯粉按重量比2~4:1混合组成。
[0011] 进一步地，所述的混合发酵菌液与复合载体的重量比为15~35:1，优选为20~ 30:1〇
[0012] 进一步地，所述的混合发酵菌液中菌体的镜检芽孢形成率为80~85%。
[0013] 本发明从海洋环境的刺参池养殖池采集的底泥样品中分离得到具有高效氨氮降 解能力的菌株枯草芽孢杆菌YB-01和具有高效的亚硝态氮降解能力的侧孢短芽孢杆菌 YB-02。经检测，YB-01在24小时对氨氮降解效率达到99. 35%，YB-02在24小时内对亚硝 态氮降解达到99. 87%，目前还没有具有如此高效的氨氮和亚硝态氮降解能力的海水用微 生态菌。本发明按一定比例联合使用两种菌株，达到高效去除氨氮和去除亚硝态氮效果，同 时对6种海水养殖中常见的致病菌有一定的抑菌效果，克服了目前海水池塘养殖水体快速 恶化和疫病频发的问题。
[0014] 上述技术方案中所述的载体固定化抑菌型水质净化剂，实际应用时含有枯草芽孢 杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌YB-02的益生菌液在发酵培养基中发酵至其镜检芽孢形成率 达到80~85%时，停止发酵，混合发酵菌液用于制备本发明的载体固定化抑菌型水质净化 剂。
[0015] 本发明的另一目的是提供一种本发明所述的载体固定化抑菌型水质净化剂的制 备方法，包括以下步骤：
[0016] (1)益生菌种子液制备：将斜面培养的枯草芽孢杆菌YB-01和侧孢短芽孢杆菌 YB-02,分别接种至种子液培养基中，在pH 7. 2-7. 5, 26~28°C恒温摇床培养，得枯草芽孢 杆菌YB-01益生菌种子液和侧孢短芽孢杆菌YB-02益生菌种子液，按体积比1:1~1. 5混 合，得混合益生菌种子液；
[0017] (2)益生菌液态发酵培养：将混合益生菌种子液按5~10%的体积比接种至发 酵培养基中，在〇. IMPa，温度28~30°C，溶氧3 30%的条件下，进行发酵，初始搅拌速度 150rpm，2h 后为 200rpm，3h 后为 250rpm，4h 后为 300rpm，12h 后得发酵菌液；
[0018] (3)载体固定化处理：向步骤（2)的发酵菌液中，加入复合载体，在搅拌下进行吸 附固定化处理1~3h，优选为lh，离心，收集固定化载体菌体复合物，50~55°C干燥处理至 半干后，自然晾干，粉碎，得终产品；<