一种扩增游离dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种扩增游离DNA的方法，包括如下步骤：设计并合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3’端为T碱基，从寡核苷酸甲3’端的第二个碱基与寡核苷酸乙5’端开始互补；将寡核苷酸乙5’端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA。另将游离DNA末端补平后经加A反应，得到有A粘性末端的游离DNA；以接头DNA和有A粘性末端的游离DNA进行连接反应得到的产物为模板，利用寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增。本方法能够最大程度上保留DNA片段的完整性，防止游离DNA进一步片段化，利用该方法能够获得足以满足常规检测的游离DNA模板。
【专利说明】一种扩增游离DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于DNA扩增领域，具体涉及一种扩增游离DNA的方法。
【背景技术】
[0002] 游离DNA存在于血浆、血清或其他体液中的含量较少，且多为DNA分子片段，致使 其在提取过程中容易丢失，提取难度增大，提取量较少，难以满足常规检测的要求，导致检 测灵敏度较低。如何获得足以满足常规检测的游离DNA已经成为亟待解决的问题。
[0003] 常规的基因组扩增方法主要有以下两种：一是利用随机引物与DNA的任意位置相 结合并扩增，从而获得大量的随机长度的DNA;二是先利用限制性内切酶切割DNA，使其形 成长度不等的酶切DNA片段，然后在其酶切形成的粘性末端连接接头，最后以接头DNA为模 板进行DNA扩增。这两种方法的缺点是，扩增产物DNA分子长度小于原来的DNA分子，DNA 分子的完整性遭到破坏，不能保证基因组DNA分子的全长扩增，尤其是对于由小片段DNA分 子构成的基因组DNA样本，很难保证在一条基因组DNA分子片段上同时存在2个酶切位点； 常规的基因组扩增还会使得基因组，小片段产物过多，导致用于常规检测的有效DNA模板 量不足。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种扩增游离DNA的方法，保证常规 检测的有效DNA模板量充足，并且保证基因组DNA分子的全长扩增，步骤如下：
[0005] 1.制备接头DNA:合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端为T碱基，从寡核苷酸甲 3'端的第二个碱基与寡核苷酸乙5'端开始互补；将寡核苷酸乙5'端用磷酸根修饰；经退 火反应得到接头DNA ;
[0006] 2.游离DNA的预处理：将游离DNA末端补平后经加 A反应，得到有A粘性末端的 游离DNA ;
[0007] 3.将步骤1得到的接头DNA和步骤2得到的有A粘性末端的游离DNA进行连接反 应，得到连接产物；
[0008] 4.利用步骤3所述的连接产物为模板，利用步骤1中的寡核苷酸甲为引物进行 PCR扩增。
[0009] 以下对本发明做进一步说明。
[0010] 所述游离DNA取自于血浆、血清、其他体液中。
[0011] 所述的寡核苷酸甲长度为10-50个碱基，所述的寡核苷酸乙长度为5-47个碱基， 寡核苷酸甲的碱基数比寡核苷酸乙多3-30个。
[0012] 在上述方法中，步骤1所述的磷酸根修饰是通过T4多聚核苷酸激酶实现的。
[0013] 在上述方法中，步骤2所述的末端补平是通过T4 DNA聚合酶实现的。
[0014] 在上述方法中，步骤所述的加 A是通过Taq DNA聚合酶实现的。
[0015] 在上述方法中，步骤3所述的接头DNA和有A粘性末端的游离DNA的连接是通过 T4DNA连接酶实现的。
[0016] 在上述方法中，步骤4中PCR扩增反应过程如下：
[0017] (a)60 ?73°C下接头延伸 5 ?lOmin，
[0018] (b)90 ?100°C下预变性 3 ?lOmin，
[0019] (c)90 ?10(TC下变性 10 ?30s，
[0020] (d) 68?73°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C ) 10?30s，
[0021] (e) 68 ?73°C 下延伸 1 ?5min，
[0022] (f)重复（c)?（e) 30个循环，
[0023] (g)90 ?KKTC下变性 10 ?30s，
[0024] (h) 53 ?58? 下退火 10-30s，
[0025] (i) 68 ?73°C下延伸 l-5min，
[0026] 本发明方法具有以下优越性：1、解决了利用随机引物与DNA的任意位置相结合并 扩增方法中产物DNA分子的完整性遭到破坏，不能保证基因组DNA分子全长扩增的问题。2、 解决了先利用限制性内切酶切割DNA，后在其粘性末端连接接头，最后以接头DNA为模板进 行扩增的方法中DNA分子进一步片段化的问题，本方法能够在扩增的同时最大程度上保留 DNA片段的完整性，防止游离DNA进一步片段化，利用该方法能够获得足以满足常规检测的 游离DNA模板。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1是实施例1和实施2中游离DNA起始量和获得量对比图。
[0028] 图2是实施例1和实施2的电泳图像。
[0029] 图3中A为实施例1和实施2荧光定量PCR扩增曲线，B为未经处理的血浆游离 DNA荧光定量PCR扩增曲线。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实验对本发明进行进一步说明。
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032] 下述实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033] 实施例1
[0034] (1)设计并合成甲乙二条寡核苷酸：寡核苷酸甲：5' -GCG GTG ACC CGG GAG ATC TGA ATT CT-3'，寡核苷酸乙：5' -GAA TTC AGA TC-3'。
[0035] (2)寡核苷酸乙5'端磷酸根修饰，反应如下（总体系50 μ 1):
[0036] 寡核苷酸乙（ΙΟΟμΜ) Ιμ? lOxrcaction buffer A for T4 PNIC 5μ1 ATP (lOmM) 0·5μ1 T4多聚核苷酸激酶（lOU/μΙ) 1 5μ1 ddH20 丨<|、个 Μ)μΙ
[0037] 轻柔吹打混匀，37°C水浴60min，75°C水浴lOmin灭活。
[0038] (3)退火反应（总体系100 μ 1):
[0039] 经磷酸跟修饰的寡核苷酸乙 Μμ?
[0040] 寡核苷酸甲 Ιμ? Annealing Buffer for DNA Oligos (5x ) 20μ1 ddH2〇 补个. 100μΙ
[0041] 反应条件如下：
[0042] 95 °C 2min
[0043] 95°C (每 90sec 下降 1°C，降至 25°C )
[0044] 4°C 保温
[0045] 所得产物即为接头DNA。
[0046] (4)游离DNA的末端补平：利用100ng经过酚/氯仿/异戊醇法提取的游离DNA， 进行如下反应（总体系10 μ 1):
[0047] 游离 DNA !00ng 1〇χΤ4 BuiTcr Ιμ? 1% BSA Ιμ? dNTP Mixture (2.5mM each) Ιμ? ddH2〇 补至 9μ1 75 °C保温5min后，移入37°C恒温槽 T4聚合酶 Ιμ? 用加样器轻轻吹打混匀。 37°C 保温 30min
[0048] 使用AxyPr印PCR清洁试剂盒纯化DNA，溶解于25 μ lEluent溶液中。
[0049] (5)经末端补平后的游离DNA的加 A反应：利用步骤（4)所得产物，进行如下反应 (总体系50 μ 1):
[0050] 经末端补平后的游离DNA 24μ1 2><dA Tailing Buffer 25μ1 TaqDNA 聚合酶（5υ/μ1) Ιμ? 72°C 保温 21ι
[0051] 使用AxyPr印PCR清洁试剂盒纯化DNA，样品溶解于25 μ lEluent溶液中。
[0052] (6)将步骤（3)得到的接头DNA和步骤（5)得到有A粘性末端的游离DNA进行连 接反应,反应体系如下（总体系30 μ 1):
[0053] 有Α粘性末端的游离DNA 25μ? 接头DNA 3μ1 l〇xLigasc Buffer 3μ1 T4 DNA 连接酶（3υ/μ1) 1 μ? ddH2〇 补午. 30μ1
[0054] 反应条件如下：
[0055] 4°C 12h
[0056] 70°C lOmin
[0057] (7)以步骤（6)产物为模板，步骤⑴中的寡核苷酸为引物，进行PCR扩增反应：
[0058] PCR扩增反应体系（20μ 1):
[0059] 步骤（6)产物 3μ1 IOxPlaiinum HiProofTaq PCR Buffer 2μ1 MgCh (25mM) 1.2μ1 dNTP (2.5mM each) 1 6μ1 步骤（1)中的寡核苷酸（20μΜ) 0.5μ1 Platinum HiProofTaq (2υ/μ1) 0 5μ| ddH20 补个. 20μ1
[0060] PCR扩增反应过程如下：
[0061] (a)60 ?73°C下接头延伸 5 ?10min，
[0062] (b) 90 ?100°C下预变性 3 ?10min，
[0063] (c)90 ?10(TC下变性 10 ?30s，
[0064] (d) 68?73°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C ) 10?30s，
[0065] (e)68 ?73? 下延伸 1 ?5min，
[0066] (f)重复（c)?（e) 30个循环，
[0067] (g)90 ?KKTC下变性 10 ?30s，
[0068] (h) 53 ?58? 下退火 10-30s，
[0069] (i) 68 ?73°C下延伸 l-5min，
[0070] (j)重复（g)?⑴10个循环，
[0071] (k) 68 ?73°C下延伸 5 ?lOmin，
[0072] (1)-20 ?37°C下保温。
[0073] 如图1所示步骤（7)的产物经纯化后游离DNA的获得量为1775ng。
[0074] 实施例2
[0075] 步骤⑷中游离DNA为10ng，其它步骤同实施例1。
[0076] 如图1所示步骤（7)的产物经纯化后游离DNA的获得量为1050ng。
[0077] 实施例1和实施例2扩增前后游离DNA起始量和获得量对比如图1所示。
[0078] 取实施例1和实施2产物进行电泳，结果如图2所示，其中泳道1为DL2000 DNA Marker，泳道1为实施例1产物，泳道2为实施例2产物。
[0079] 实施例1产物、实施例2产物以及血浆游离DNA经过qPCR扩增GAPDH基因，上游引 物：5'-GGA CTG AGG CTC CCA CCT TT-3'，下游引物：5'-GCA TGG ACT GTG GTC TGC AA-3'； 反应体系：1〇μ 1的2XqPCR Mix、0. 5μ 1的上游引物（10mM)、0. 5μ 1的下游引物（10mM)、 2μ 1 的实施例产物、7μ 1 的 ddH20 ;反应条件：95°C 5min，95°C 15s，58°C 15s，72°C 30s，50 个循环，72°C检测荧光，72°C 5min。扩增曲线如图3所示，其中A为实施例1产物和实施例 2产物扩增曲线，B为未经处理的血浆游离DNA扩增曲线。
[0080] 结果表明：本方法可保证常规检测的有效DNA模板量充足，提高了检测灵敏度，并 且保证基因组DNA分子的全长扩增。
【权利要求】
1. 一种扩增游离DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端为T碱基，从寡核苷酸甲3'端的第二个碱基与 寡核苷酸乙5'端开始互补；将寡核苷酸乙5'端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA ; (2) 将游离DNA末端补平后经加 A反应，得到有A粘性末端的游离DNA ; (3) 将步骤（1)得到的接头DNA和步骤（2)得到的有A粘性末端的游离DNA进行连接 反应，得到连接产物； (4) 利用步骤（3)得到的连接产物为模板，步骤（1)中的寡核苷酸甲为引物进行PCR扩 增。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述游离DNA取自于血浆、血清、其他体 液中。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的寡核苷酸甲长度为10-50个碱基， 所述的寡核苷酸乙长度为5-47个碱基，寡核苷酸甲碱基数比寡核苷酸乙多3-30个。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的磷酸根修饰是通过T4 多聚核苷酸激酶实现的。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的末端补平是通过T4 DNA聚合酶实现的。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑵中所述的加 A是通过Taq DNA聚 合酶实现的。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的连接是通过T4 DNA连 接酶实现的。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤⑷中PCR扩增反应过程如下： (a) 60?73°C下接头延伸5?lOmin， (b) 90?100°C下预变性3?lOmin， (c) 90 ?100°C下变性 10 ?30s， (d) 68?73°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C ) 10?30s， (e) 68?73°C下延伸1?5min， (f) 重复（c)?（e) 30个循环， (g) 90 ?100°C下变性 10 ?30s， (h) 53 ?58°C下退火 10-30s， (i) 68 ?73°C下延伸 l_5min， (j) 重复（g)?⑴10个循环， (k) 68 ?73°C下延伸 5 ?lOmin， (l) -20?37 °C下保温。
【文档编号】C12N15/10GK104232619SQ201410468186
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】杨麒巍, 张桂珍, 杜珍武, 宋旸, 于杉 申请人:吉林大学