兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法
【专利摘要】本发明涉及寄生虫的纯化提取方法，具体为一种兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，该方法将感染兔肝球虫肝脏的白色病变结节研磨后，过滤并经多次离心后获得沉淀，加入重铬酸钾溶液，25-40℃下摇床培养2-6天，获得纯化的肝球虫卵囊；之后，洗去重铬酸钾，再次经研磨后多次离心后获得沉淀，经消化和蔗糖梯度离心后，最终获得形成攻击性月牙状的子孢子。该方法从感染兔的肝脏中分离提纯斯氏艾美尔球虫的纯卵囊并形成攻击性子孢子，以便对其后续进行体外的大规模繁殖、疫苗及药物的研究做好前期的研究准备工作。
【专利说明】兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及寄生虫的纯化提取方法，具体为一种兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法。
【背景技术】
[0002]兔球虫是家兔最常见的一种寄生虫，由于其对养兔业危害极大，幼兔感染率高达90%以上，患病幼兔死亡率高达40%?70%。早在1935年我国研究者就开始了兔球虫种类调查，尤其是解放后众多学者在全国范围内开展了兔球虫种类调查、内生发育史、各阶段虫体的超微结构、细胞化学、球虫免疫机理等方面的研究。现公开文献所记载的兔球虫种类较多，据Levine (1985年)等人的研究确认共有14种，且都为艾美尔属，除斯氏艾美尔球虫寄生于兔肝胆管上皮细胞外，其余13种都寄生于肠。目前，国内外对斯氏艾美尔球虫即兔肝球虫的研究不多，对它造成的危害性也没有引起足够的重视，实用性的研究成果基本上处于零。肝球虫卵囊在外界环境中有极强的生存能力和抵抗力，卵囊在外界土壤中可生存4-9个月，在有树荫的地方可生存15-18个月。一般的消毒药,如5%福尔马林、5%石碳酸、5%硫酸铜、10%硫酸、5%氢氧化钾及5%碘化钾、2%的来苏尔、0.2%的新洁尔灭、0.25%麝香草酚对卵囊均无作用，甲醛熏烟无效，由此造成的传播极其广泛，且由于不同虫株的免疫原性没有交叉性限制了疫苗的研制，使该病预防极为困难。因此，一旦感染则很难清除，给畜牧业经济造成极大的危害。
[0003]经查阅及参考相关外文文献，发现仅有一篇关于Eimeria tenella的子孢子纯化过程，即用胰蛋白酶牛黄胆酸钠进行脱囊，随后按文献记载的方法进行还原，但没有成功，更没有出现文献报道的形成子孢子。
[0004]概括其步骤如下:
A、用5%的次氯酸钠分离纯化后的艾美尔球虫卵囊，卵囊壁为两层，薄的浅色内层和厚的亮色外层，内层颜色较浅并清晰。
[0005]B、用0.4%胃蛋白酶/HCl室温培养2h后卵囊壁变皱接近孢子囊。
[0006]C、分离艾美尔球虫的卵囊，0.4%胰蛋白酶/0.75%牛磺胆酸液在40°C条件下孵育
2.5h，卵囊壁破裂，孢子囊开始向外挤出。
[0007]D、脱离卵囊壁的孢子囊和卵囊壁的碎片在0.75%牛磺胆酸液中继续40°C孵育2h。
[0008]E、子孢子在RPMI培养基中40°C孵育1h ;具体步骤如下:
步骤1:培养基0.4%的胃蛋白酶用蒸馏水配制，用IN的HCl调节pH至3，孵育16卵囊/10ml，0.4%胃蛋白酶在40°C，5%C02培养箱中培养2h，用PBS (llOOg, 1min)洗2次。
[0009]步骤2:培养基A液，0.4%胰蛋白酶/0.75%牛磺胆酸液，用RPMI为基质配制孵育，16卵囊/1ml，0.4%A液在40°C恒温振荡器(180rpm)中培养2h，释放出的孢子囊达30_40%。用 PBS (1100g，10min)洗 2 次。
[0010]步骤3:培养基B液，0.75%牛磺胆酸液，2.5mM的MgCl2用RPMI为基质配制孵育:16 卵囊 /10ml，B 液在 40。。，5% CO2 培养箱中培养 2h 用 PBS (llOOg, 1min)洗 2 次。
[0011]步骤4:培养基RPMI加1%的胎牛血清，孵育40°C，5%C02培养箱中培养6_10h。
[0012]上述所有步骤必须进行无菌操作。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于从注册场的兔厂中分离提纯斯氏艾美尔肝球虫的纯卵囊及形成攻击性子孢子。
[0014]本发明是采用如下技术方案实现的:
一种兔肝球虫卵囊纯化的方法，包括如下步骤:
(1)、从感染兔肝球虫的兔子肝脏中将白色病变结节挑出于研磨容器中并加生理盐水；
(2)、将白色病变结节研磨；
(3)、过滤于容器内；
(4)、将收集的滤液分装于多个离心管中，离心后弃上清；然后将沉淀悬浮于水中，重复此步骤一次；
(5)、将沉淀溶于饱和NaCl溶液中，加水后离心，吸取表面的糊状物及上清液于另一容器内，加水稀释收集液，再次离心后弃上清；重复此步骤一次；
(6)、在沉淀中加入重铬酸钾溶液，25-40°C下摇床培养2-6天，即可得到纯化后的肝球虫卵囊。
[0015]优选的,上述步骤(4)中，离心参数为:2000_4000r/min离心5_15min。
[0016]步骤(5)中，首次离心参数为:500-1500r/min离心4_10min ;再次离心参数为:3000-5000r/min 离心 5_15min。
[0017]步骤(6)中，重铬酸钾溶液的浓度为1.5%_4%。
[0018]兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，包括如下步骤:
(1)、兔肝球虫卵囊纯化的方法同上；
(2)、用无菌生理盐水先洗掉重铬酸钾，离心后得到沉淀；
(3)、将沉淀溶于灭菌的生理盐水中，将悬浮液加至组织研磨器，研磨至90%以上破碎；
(4)、用生理盐水洗净研磨器中剩余的孢子放入离心管，将悬浮液离心后弃上清液，得到沉淀；
(5)、将胆汁用生理盐水稀释后置于消化瓶中，将沉淀加入该消化瓶中，然后加1-5倍消化液，放置30-40°C恒温水浴中消化，经观察无子孢子囊后终止消化，然后将其转入离心管内，离心后弃上清，用生理盐水悬浮沉淀；
(6)、将悬浮液加入配好的蔗糖梯度离心管中离心；在梯度离心管内蔗糖浓度按从下到上57-65%、45-52%、28-37%配制；离心后的子孢子分别集中于不同蔗糖浓度的分界液面之间；
(7)、吸取子孢子于离心管中然后加生理盐水稀释，离心后弃上清，沉淀即为具备攻击性月牙状的子孢子。
[0019]优选的,上述步骤(2)中，离心参数为:2000-3000r/min离心5_6min。
[0020]步骤(4)中，离心参数为:2000-3500r/min离心 5-lOmin。
[0021]步骤(5)中，所述消化液由体积比为0.6-1.8:1的0.18%_0.30%的胰酶和胆汁构成，所述胆汁由l_2ml纯胆汁加5-8ml生理盐水构成；离心参数为:1800-3000r/min离心6-10mino
[0022]步骤(6)中，离心参数为:1000-1800r/min离心 4_8min。
[0023]步骤(7)中，离心参数为:2000-2500r/min离心 6_8min。
[0024]上述方法从感染兔的肝脏中分离提纯斯氏艾美尔球虫的纯卵囊和攻击性子孢子，以便对其后续进行繁殖及药物的研究做好前期的研究工作，也为下一步研究针对其生长的特异性即仅在兔肝脏中存活的特性，通过原代培养兔肝细胞，接种分离到的纯斯氏艾美尔球虫的纯卵囊对其进行繁殖及药物的研究，寻找合适的针对本病的防治方法，以便解决治疗兔球虫病过程中造成的滥用药物等方面提供参考。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1表示直接从屠宰车间患病肝脏中挑取镜检后的肝球虫卵囊。
[0026]图2表示饱和盐水处理I次的卵囊纯化情况。
[0027]图3表示饱和盐水处理2次的卵囊纯化情况。
[0028]图4表示研磨10分后的镜检情况。
[0029]图5表示消化36分钟后的镜检情况。
[0030]图6表示处于蔗糖段的攻击性孢子。
[0031 ]图7表示处于最下层的攻击性孢子。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图对本发明的具体实施例进行详细说明。
[0033]肝球虫的病原形态结构如下:
①直接涂片法:从兔屠宰车间挑选有白色突起的肝脏，通过冷藏的方法当日运送到实验室。用接种环自肝脏表面的白色肿块突起挑取一环至生理盐水中，在40倍显微镜下观察肝球虫卵囊为长卵圆形或椭圆形，试验中测得其平均大小为34umX22um，如图1所示，直接从屠宰车间患病肝脏中挑取镜检后的肝球虫卵囊。
[0034]②饱和盐水漂浮法:取5?1g粪便置于100?200ml烧杯中，加入少量饱和盐水，搅拌均匀后，继续加饱和盐水约至20倍，用粪筛或纱布过滤至另一烧杯中，弃去粪渣。将盛有滤液的烧杯静置40?45min后，用直径0.5?1.0cm的金属圈水平接触液面，将粘在金属圈上的液体移置于载玻片上，加盖玻片后镜检。
[0035]在分离肝球虫时发现，感染不太严重的肝脏，最初是沿着肝胆管移行的，只要拿镊子一扯，即可顺着肝胆管提出来，在平时肉眼是看不到肝胆管的；但感染严重时，肝球虫则布满整个被感染的肝脏。
[0036]实施例1
兔肝球虫卵囊纯化的方法如下:
A、从肝脏将白色病变结节挑出于研磨容器中，并加适量的生理盐水。
[0037]B、挑完后用小剪子将结节充分剪碎后研磨lOmin。
[0038]C、将碎块结节经4层纱布过滤，滤于一大容器内，边过滤边用蒸馏水洗。反复洗2-3遍至结节组织完全为白色，镜检涂片基本无球虫后丢弃废液缸灭菌处理。
[0039]D、将收集的滤液分装于50ml离心管中，3000r/min离心15min弃上清。将沉淀悬浮于水中，重复此步骤一次。
[0040]E、将沉淀溶于1ml饱和NaCl溶液中并加5ml水混匀上离心机，500r/min离心8min，吸取表面的糊状物(肝球虫)及上清液于另一容器内，加水稀释收集液5倍左右，4000r/min离心15min弃上清；重复此步骤一次，得到的白色沉淀即为杂质较少的肝球虫卵囊。
[0041]F、加入数倍体积的1.5%重铬酸钾溶液，40°C恒温摇床培养2-4天，得到纯化后的肝球虫卵囊，收集4°C保存备用。
[0042]实施例2
兔肝球虫卵囊纯化的方法如下:
A、从肝脏将白色病变结节挑出于研磨容器中，并加适量的生理盐水。
[0043]B、挑完后用小剪子将结节充分剪碎后研磨20min。
[0044]C、将碎块结节经4层纱布过滤，滤于一大容器内，边过滤边用蒸馏水洗。反复洗2-3遍至结节组织完全为白色，镜检涂片基本无球虫后丢弃废液缸灭菌处理。
[0045]D、将收集的滤液分装于50ml离心管中，4000r/min离心5min弃上清。将沉淀悬浮于水中，重复此步骤一次。
[0046]E、将沉淀溶于1ml饱和NaCl溶液中并加5ml水混匀上离心机，1000r/min离心lOmin，吸取表面的糊状物(肝球虫)及上清液于另一容器内，加水稀释收集液8倍左右，3000r/min离心1min弃上清；重复此步骤一次，得到的白色沉淀即为杂质较少的肝球虫卵囊。
[0047]F、加入数倍体积的4%重铬酸钾，25°C恒温摇床培养4_6天，得到纯化后的肝球虫卵囊，收集4°C保存备用。
[0048]实施例3
兔肝球虫卵囊纯化的方法如下:
A、从肝脏将白色病变结节挑出于研磨容器中，并加适量的生理盐水。
[0049]B、挑完后用小剪子将结节充分剪碎后研磨15min。
[0050]C、将碎块结节经4层纱布过滤，滤于一大容器内，边过滤边用蒸馏水洗。反复洗2-3遍至结节组织完全为白色，镜检涂片基本无球虫后丢弃废液缸灭菌处理。
[0051]D、将收集的滤液分装于50ml离心管中，2000r/min离心1min弃上清。将沉淀悬浮于水中，重复此步骤一次。
[0052]E、将沉淀溶于1ml饱和NaCl溶液中并加5ml水混匀上离心机，1500r/min离心4min，吸取表面的糊状物(肝球虫)及上清液于另一容器内，加水稀释收集液7倍左右，5000r/min离心5min弃上清；重复此步骤一次，得到的白色沉淀即为杂质较少的肝球虫卵囊。
[0053]F、加入数倍体积的3%重铬酸钾，30°C恒温摇床培养3-4天，得到纯化后的肝球虫卵囊，收集4°C保存备用。
[0054]饱和盐水处理I次的卵囊纯化情况如图2所示。饱和盐水处理2次的卵囊纯化情况如图3所示。
[0055]实施例4 兔肝球虫卵囊纯化后形成攻击性子孢子的方法如下:
A、用无菌生理盐水先洗掉重铬酸钾,洗2-3次,2500r/min离心6min,弃上清。
[0056]B、将沉淀溶于Iml灭菌的生理盐水中，将悬浮液放置组织研磨器中，研磨1min左右后镜检一次。如图4所示，研磨1min后卵囊的破碎情况。
[0057]C、若未达90%上破碎，再研磨2min后镜检；直至90%以上破碎。
[0058]D、用生理盐水洗净研磨器中剩余的孢子放入离心管，将悬浮液经3500r/min离心1min,弃上清液,得到沉淀。
[0059]E、将胆汁用少许生理盐水稀释置于青霉素小瓶(消化瓶)中，将沉淀置于消化瓶中，然后加I倍消化液(消化液由体积比为0.2%的胰酶:胆汁=0.6:1，胆汁由Iml纯胆汁加8ml生理盐水构成)30°C恒温水浴消化，每半小时观察一次，如图5所示，消化36min后的镜检情况；间隔1min摇晃消化瓶，经观察基本无子孢子囊后终止消化，然后将其转入离心管内，1800r/min离心8min。弃上清,用l_2ml生理盐水悬浮沉淀。
[0060]F、将悬浮液加入配好的蔗糖梯度(蔗糖浓度按从下到上57%，48%，35%配制)离心管中，1300r/min离心8min。子孢子分别基本集中于35%与48%、48%与57%之间的分界液面中；如图6、7所示，成为攻击性子孢子。
[0061]G、用长嘴吸管吸出子孢子置于离心管中，然后加数倍体积生理盐水稀释后，2500r/min离心7min后弃上清,沉淀即为具备攻击性月牙状的子孢子。
[0062]实施例5
兔肝球虫卵囊纯化后形成攻击性子孢子的方法如下:
A、用无菌生理盐水先洗掉重铬酸钾,洗2-3次,2000r/min离心5min,弃上清。
[0063]B、将沉淀溶于Iml灭菌的生理盐水中，将悬浮液放置组织研磨器中，研磨15min后镜检一次。如图4所示,研磨1min后卵囊的破碎情况。
[0064]C、若未达90%上破碎，再研磨2min后检验；直至90%以上破碎。
[0065]D、用生理盐水洗净研磨器中剩余的孢子放入离心管，将悬浮液经2500r/min离心5min,弃上清液,得到沉淀。
[0066]E、将胆汁用少许生理盐水稀释置于青霉素小瓶(消化瓶)中，将沉淀置于消化瓶中，然后加3倍消化液(消化液有体积比0.3%的胰酶:胆汁=1.2:1，胆汁由1.5ml纯胆汁加5ml生理盐水构成)40°C恒温水浴消化，每半小时观察一次，如图5所示，消化36min后的镜检情况；间隔1min摇晃消化瓶，经观察基本无子孢子囊后终止消化，然后将其转入离心管内，2700r/min离心lOmin。弃上清,用l_2ml生理盐水悬浮沉淀。
[0067]F、将悬浮液加入配好的蔗糖梯度(蔗糖浓度按从下到上65%，45%，37%配制)离心管中，1800r/min离心4min。子孢子分别基本集中于37%与45%、45%与65%之间的分界液面中；如图6、7所示，成为攻击性子孢子。
[0068]G、用长嘴吸管吸出子孢子置于离心管中，然后加数倍体积生理盐水稀释后，2200r/min离心8min后弃上清,沉淀即为具有攻击性月牙状的子孢子。
[0069]实施例6
兔肝球虫卵囊纯化后形成攻击性子孢子的方法如下:
A、用无菌生理盐水先洗掉重铬酸钾,洗2-3次,3000r/min离心6min,弃上清。
[0070]B、将沉淀溶于Iml灭菌的生理盐水中，将悬浮液放置组织研磨器中，研磨15min后镜检一次。如图4所示,研磨1min后卵囊的破碎情况。
[0071]C、若未达90%上破碎，再研磨2min后检验；直至90%以上破碎。
[0072]D、用生理盐水洗净研磨器中剩余的孢子放入离心管，将悬浮液经2000r/min离心8min,弃上清液,得到沉淀。
[0073]E、将胆汁用少许生理盐水稀释置于青霉素小瓶(消化瓶)中，将沉淀置于消化瓶中，然后加5倍消化液(消化液由体积比为0.18%的胰酶:胆汁=1.8:1，胆汁通常由2ml纯胆汁加7ml生理盐水构成)35°C恒温水浴消化，每半小时观察一次，如图5所示，消化36min后的镜检情况；间隔1min摇晃消化瓶，经观察基本无子孢子囊后终止消化，然后将其转入离心管内，3000r/min离心6min。弃上清,用l_2ml生理盐水悬浮沉淀。
[0074]F、将悬浮液加入配好的蔗糖梯度(蔗糖浓度按从下到上62%，52%，28%配制)离心管中，1000r/min离心6min。子孢子分别基本集中于28%与52%、52%与62%之间的分界液面中；如图6、7所示，成为攻击性子孢子。
[0075]G、用长嘴吸管吸出子孢子置于离心管中，然后加数倍体积生理盐水稀释后，2000r/min离心6min后弃上清,沉淀即为具备攻击性月牙状的子孢子。
【权利要求】
1.一种兔肝球虫卵囊纯化的方法，其特征在于如下几个步骤: (1)、从感染兔肝球虫的兔子肝脏中将白色病变结节挑出于研磨容器中并加生理盐水； (2)、将白色病变结节研磨； (3)、过滤于容器内； (4)、将收集的滤液分装于多个离心管中，离心后弃上清；然后将沉淀悬浮于水中，重复此步骤一次； (5)、将沉淀溶于饱和NaCl溶液中，加水后离心，吸取表面的糊状物及上清液于另一容器内，加水稀释收集液，再次离心后弃上清；重复此步骤一次； (6)、在沉淀中加入重铬酸钾溶液，25-40°C下摇床培养2-6天，即可得到纯化后的肝球虫卵囊。
2.根据权利要求1所述的兔肝球虫卵囊纯化的方法，其特征在于:步骤(4)中，离心参数为:2000-4000r/min 离心 5_15min。
3.根据权利要求1所述的兔肝球虫卵囊纯化的方法，其特征在于:步骤(5)中，首次离心参数为:500-1500r/min离心4-10min ;再次离心参数为:3000-5000r/min离心5_15min。
4.根据权利要求1所述的兔肝球虫卵囊纯化的方法，其特征在于:步骤(6)中，重铬酸钾溶液的浓度为1.5-4%。
5.一种兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，其特征在于如下几个步骤: (1)、兔肝球虫卵囊纯化方法同权利要求1-4任一所述； (2)、用无菌生理盐水先洗掉重铬酸钾，离心后得到沉淀； (3)、将沉淀溶于灭菌的生理盐水中，将悬浮液加至组织研磨器，研磨至90%以上破碎； (4)、用生理盐水洗净研磨器中剩余的孢子放入离心管，将悬浮液离心后弃上清液，得到沉淀； (5)、将胆汁用生理盐水稀释后置于消化瓶中，将沉淀加入该消化瓶中，然后加1-5倍消化液，放置30-40°C恒温水浴中消化，经观察无子孢子囊后终止消化，然后将其转入离心管内，离心后弃上清，用生理盐水悬浮沉淀； (6)、将悬浮液加入配好的蔗糖梯度离心管中离心；在梯度离心管内蔗糖的浓度按从下到上57-65%、45-52%、28-37%配制；离心后的子孢子分别集中于不同蔗糖浓度的分界液面之间； (7)、吸取子孢子于离心管中然后加生理盐水稀释，离心后弃上清，沉淀即为具备攻击性月牙状的子孢子。
6.根据权利要求5所述的兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，其特征在于:步骤(2)中，离心参数为:2000-3000r/min离心5_6min。
7.根据权利要求5所述的兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，其特征在于:步骤(4)中，离心参数为:2000-3500r/min离心5-lOmin。
8.根据权利要求5所述的兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，其特征在于:步骤(5)中，所述消化液由体积比为0.6-1.8:1的0.18%-0.30%的胰酶和胆汁构成，所述胆汁由l_2ml纯胆汁加5-8ml生理盐水构成；离心参数为:1800-3000r/min离心6-10mino
9.根据权利要求5所述的兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，其特征在于:步骤(6)中，离心参数为:1000-1800r/min离心4_8min。
10.根据权利要求5所述的兔肝球虫卵囊纯化及形成攻击性子孢子的方法，其特征在于:步骤(7)中，离心参数为:2000_2500r/min离心6_8min。
【文档编号】C12N1/10GK104232488SQ201410468113
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】巩红霞, 巩强, 傅英文, 张祖维, 田文霞, 贾广乐, 雷宇平, 安伟 申请人:山西出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 巩强