一种水稻真空渗透遗传转化装置制造方法
【专利摘要】一种水稻真空渗透遗传转化装置，该装置在支承桌桌面中部设有通孔，支承桌上放置底板，底板上、下表面中部设有上、下圆柱，上、下圆柱上分别套有磁铁环Ⅱ和磁铁环Ⅰ，磁铁环Ⅰ与磁铁环Ⅱ相邻磁极为同极，下圆柱和磁铁环Ⅰ穿过通孔位于桌面之下，真空渗透遗传转化室放置在底板上，上圆柱位于室内，支架放置在磁铁环Ⅱ上，支架上放置渗透液盛放容器，室内上部内壁设有环状承接台及带阀门的空气通气管和真空抽气接管；室的底端口和顶端口均设有密封圈。该装置能使待转化植株一开始接触渗透转化液时就在真空状态下进行，真正实现了在真空状态下对水稻的原位遗传转化，增强了农杆菌对植株的侵染力。该装置对于个体较小和个体较大的作物都适用。
【专利说明】一种水稻真空渗透遗传转化装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水稻真空渗透遗传转化装置，属于基因工程和分子生物学实验【技术领域】。
【背景技术】
[0002]水稻是全球一半以上人口主要的粮食作物，然而，水稻生产受到越来越多不利因素(如病虫害等)的限制，因此水稻品种的改良十分迫切。转基因技术能突破生物种间障碍，实现物种间基因的转移，从而为作物遗传改良提供新途径。利用转基因技术对水稻进行遗传改良的成功与否，很大程度上依赖于有效的遗传转化方法的开发和应用。现在，公知的水稻遗传转化方法一般分为2类:一类是直接的基因转化(包括基因枪法、电击法、PEG法、月旨质体转化法和花粉管通道法等)，这类方法往往因为成本高，操作技术繁琐而极少应用?’另一类是由载体介导的转化，目前应用较为广泛的是农杆菌介导法，利用该方法在水稻上已成功获得一些具有抗病虫害、抗逆等优异性状的转基因材料。
[0003]然而传统的农杆菌介导法明显地存在许多不足:转化的实现必须经过对成熟种胚等外植体进行愈伤诱导、胚性愈伤继代、愈伤与农杆菌共培养、抗性愈伤筛选及抗性愈伤分化出苗等至少近4个月的组织培养过程，转化操作繁琐且周期长，人财物花费大，而且对操作者的技术要求高；其次在近4个月的组织培养过程中，易发生体细胞变异、形态畸形、染色体数目改变和育性丧失等问题，造成遗传背景复杂化；再者得到的转化植株常出现基因沉默，转化效率低。因此，开发一种无需经过组培过程，具有简便、快速和高效等优势，只需对开花前的活体植株短暂真空处理即实现外源基因向植株转化的水稻真空渗透转化装置和方法，便成为水稻基因转化的另一重要途径。
[0004]尽管目前有关真空渗透转化法成功应用的研究报道很多，但基本只局限在拟南芥、芥菜、白菜、菜薹、甘蓝型油菜、萝卜、烟草等个体较小的植物上应用，而且转化率偏低，真正获得的有应用价值的转基因植物较少。现有的真空渗透遗传转化大多是用现成的、体积较小的真空干燥器(如图14所示)作为真空渗透遗传转化装置，其基本操作是:将渗透转化液倒入真空干燥器，除拟南芥用活体植株进行转化外，其余植物(如芥菜、白菜、菜薹、甘蓝型油菜、萝卜、烟草等)均是将待转化植株直接从培养钵中拔出、洗净后，先将待转化植株全株或部分浸泡在真空干燥器中的渗透转化液中，此时真空干燥器处于常压状态，然而植株已浸泡在渗透转化液中开始了渗透遗传转化，然后再用真空泵减压使真空干燥器达到真空状态，继续在真空状态下渗透遗传转化(即真空处理)，达到预定时间后(即完成渗透遗传转化)，关闭真空泵开关，打开真空干燥器通气阀门，待恢复常压后，揭开干燥器盖，取出植株种植在培养钵中或田间。拟南芥真空渗透遗传转化不同的是，由于拟南芥植株较小(20-30cm), 一般是在真空干燥器中放置装有渗透转化液的烧杯，然后将种植在营养钵里的拟南芥活体植株连同营养钵一起倒置浸入在烧杯中，然后如上所述进行真空渗透转化。现有的真空渗透转化装置存在以下不足:(1)采用现有的真空干燥器进行的真空渗透转化，在抽真空减压之前，植株已经浸泡在容器内的农杆菌渗透液(渗透液)中，虽然容器内的植株和渗透液还处于常压状态，但是植株浸泡在容器内的农杆菌渗透液中已经开始了遗传转化，其转化过程可以说包含了部分常压下的渗透转化和部分真空的渗透转化，并没有真正实现真空渗透遗传转化，其农杆菌对植株的侵染力降低，转化效率也随之降低。这可能也是目前真空渗透转化法转化效率偏低的主要原因。(2)现有的真空干燥器由于受体积较小、没有适宜活体植物放置的相应配套部件以及操作不方便等因素限制，使水稻、花卉、棉花、麦类等个体较大作物不能实现在原种植条件的活体状态(即原位条件)下进行渗透遗传转化，多采用将受体植株挖出，将其直接倒放于容器中进行转化，转化后又移栽的操作方式，一方面并不是真正的原位转化，另一方面对转化后植株的生长状态、健壮程度和结实率均有影响，进而造成真空渗透转化效率偏低。(3)即便像拟南芥这样小的活体植株的真空渗透遗传转化操作，也存在许多侧枝被压断，导致处理转化效果低的问题。综上所述，现有的真空渗透转化装置及其转化方法并不适于水稻等作物的真空渗透遗传转化，因此设计和开发出一种操作简便、快速和高效的适于水稻等作物的真空渗透遗传转化装置，这将极大地缩短转化周期、节约科研成本，提高转化效率，为作物品种的遗传改良和基因功能研究提供强有力的技术保障。
【发明内容】
[0005]为克服现有真空渗透遗传转化装置未真正在真空状态下实现渗透遗传转化和不适于水稻等个体较大作物的不足，本发明提供一种真正在真空状态下、操作简便、对水稻实现原位真空渗透遗传转化的装置。
[0006]本发明所提供的技术方案为一种水稻真空渗透遗传转化装置设有支承桌、底板、磁铁环1、磁铁环I1、下圆柱、上圆柱、真空渗透遗传转化室、支架、渗透液盛放容器，密封圈I，密封圈II部件，具体结构是:
A.真空渗透遗传转化室的结构:真空渗透遗传转化室为中空的圆柱形，且真空渗透遗传转化室的顶端和底端均为敞口，在真空渗透遗传转化室的顶端盖有盖板，真空渗透遗传转化室室内上部的内壁固定连接有环状承接台，在位于环状承接台之上的室壁上分别设置有空气通气管和真空抽气接管，空气通气管上设置有阀门；
B.支架的结构:支架由四条竖直的支腿和支承板组成，四条竖直的支腿的顶端分别与支承板的下表面固定连接；
C.总体结构:
在支承桌的桌面中部设置有通孔，支承桌的桌面上放置有底板，底板的下表面中部垂直固定连接有下圆柱，下圆柱上间隙套有磁铁环I，通孔的直径D大于磁铁环I的外径K，D> K，下圆柱和磁铁环I均穿过通孔位于支承桌桌面之下，在底板上表面中部且在与下圆柱对应的位置垂直固定连接有上圆柱，上圆柱上间隙套有磁铁环II，磁铁环I与磁铁环II相邻的磁极为同极；真空渗透遗传转化室放置在底板的上表面中部，且上圆柱及其套有磁铁环II位于真空渗透遗传转化室的室内；支架的四条支腿放置在磁铁环II的上表面上，在支架的支承板上放置有渗透液盛放容器，渗透液盛放容器位于真空渗透遗传转化室内的环状承接台的下方；支腿的长度H与磁铁环II的厚度N之和大于上圆柱的柱高L，H+N > L ;磁铁环II位于上圆柱最低处时，渗透液盛放容器口与环状承接台下表面之间的距离R为80cm?120cm ;真空渗透遗传转化室的底端口通过密封圈II与底板的上表面密封连接，真空渗透遗传转化室的顶端口通过密封圈I与盖板密封连接。
[0007]真空渗透遗传转化室内壁连接的环状承接台的环孔孔径M尺寸以能使倒置在环状承接台上的培养钵20不从环状承接台的环孔中掉落为准。M可以为18?23cm。
[0008]本发明装置使用的主要操作是:
A.将固定连接有上圆柱5和下圆柱2的底板4放置在支承桌I上，且使下圆柱2穿过支承桌I上的通孔19，并且下圆柱2位于支承桌I的桌面之下，将磁铁环II 6套在上圆柱5上。
[0009]B.将真空渗透遗传转化室7放置在底板4上，且使上圆柱5位于真空渗透遗传转化室7的室内，用密封圈II将真空渗透遗传转化室7的底端口与底板的上表面密封连接。
[0010]C.从真空渗透遗传转化室7的顶端口将支架8的四条支腿17放置在磁铁环II 6的上表面上，在支架8的支承板18上放置盛有含目的基因的农杆菌渗透转化液的渗透液盛放容器9。
[0011]D.当种植在培养钵20里的水稻处于开花前时，将培养钵内的水浙干并用纱布或泡沫把培养钵内的土进行阻隔，使倒置培养钵是钵内的泥土不下掉，然后连同水稻一起将培养钵20倒置在真空渗透遗传转化室7的环状承接台15上(参见图12)，使活体水稻植株稻穗自然下垂，此时活体水稻植株稻穗与渗透液盛放容器9内的含目的基因的农杆菌渗透转化液相距一定距离，即没有接触，其目的是使真空渗透遗传转化室7内还未处于真空状态时，活体水稻植株稻穗与含目的基因的农杆菌渗透转化液不接触。然后将盖板12盖在真空渗透遗传转化室7的顶端口并通过密封圈I 13使真空渗透遗传转化室7的顶端口与盖板12密封连接。
[0012]E.关闭空气通气管10上的阀门11，将真空泵的真空管与真空抽气接管14连接，打开真空泵开关，减压抽真空，维持0.05 MPa压力，保持真空渗透遗传转化室7为真空状态。然后再将磁铁环I 3套在下圆柱2上且使磁铁环I 3与磁铁环II 6相邻的两磁极为同极(即磁铁环I 3上面的磁极与磁铁环II 6下面的磁极相同)，手动向上推动下圆柱2上的磁铁环I 3，由于上圆柱5上的磁铁环II 6与磁铁环I 3相邻两极为同极，根据同极相斥的原理，上圆柱5上的磁铁环II 6会随之向上移动，从而推动置于支架8上的渗透液盛放容器9也随之向上升，当渗透液盛放容器9上升到使倒置的活体水稻稻穗完全浸泡在渗透液盛放容器9内的含目的基因的农杆菌渗透转化液中时，停止向上推磁铁环I 3，且操作人员托住磁铁环I 3不动并维持磁铁环I 3处于使倒置的活体水稻稻穗完全浸泡在渗透液盛放容器9内的含目的基因的农杆菌渗透转化液中的位置，此时立即开始计时，当活体水稻植株在渗透液盛放容器9内浸泡达到预定转化时间后，缓慢取下磁铁环I 3，磁铁环II 6随之向下滑落至底板4上，渗透液盛放容器9及支架8也随之向下降落，从而水稻植株与渗透液盛放容器9内的含目的基因的农杆菌渗透液分离，培养钵内水稻植株的渗透遗传转化即完成。此时立即关闭真空泵开关，然后缓慢打开阀门11，待真空渗透遗传转化室7恢复常压状态，打开盖板12，再从真空渗透遗传转化室7的顶端口将培养钵20连通水稻一起取出。然后进行水稻植株渗透遗传转化完成后的后续工作，如将培养钵内的水稻植株全部覆盖上塑料膜保湿24小时后，将其培养钵置于温室内，按常规栽培方法培育植株至成熟，收获种子即可进行转化子的筛选，获得转化子。
[0013]现有技术中待转化植株的真空渗透转化虽然是在真空干燥器内进行，但是在待转化植株完全浸泡在容器内的渗透液中时，真空干燥器内还为常压状态，当待转化植株完全浸泡在容器内的渗透液中后，才能用真空泵抽真空使真空干燥器为真空状态，因此，现有技术虽然是在真空干燥器内对待转化植株进行渗透遗传转化，浸泡于渗透液内进行渗透遗传转化的植株实际是部分时间在常压下，部分时间在真空状态下，并没有真正在真空状态下对待转化植株进行渗透遗传转化。
[0014]本发明的工作原理是:
本发明是在真空渗透遗传转化室处于真空状态后，利用磁铁同极相斥的原理，通过操控室外的磁铁带动室内磁铁按预定轨迹运动，达到在真正的真空状态下对水稻进行渗透遗传转化的目的。本发明在底板上不穿孔，通过设置在底板上面上圆柱上的磁铁环II和在底板下面下圆柱上的磁铁环I相邻两极为同极，利用磁铁同极相斥的原理，当向上推动底板下面的磁铁环I时，在真空渗透遗传转化室内的上圆柱上的磁铁环II上也随之上移，从而真空渗透遗传转化室内的渗透液盛放容器也随之上升至能使活体水稻植株稻穗完全浸泡在渗透液盛放容器内的含目的基因的农杆菌渗透遗传转化液中的位置为止并托住磁铁环I不动维持磁铁环I所处位置，待真空处理完毕后进行后续操作。本发明在底板上不穿孔，真空渗透遗传转化室顶部端口和底部端口又均分别通过密封圈1、密封圈II密封，并关闭关闭空气通气管上的阀门11，然后抽真空，使活体水稻植株还没有与含目的基因的农杆菌渗透遗传转化液接触时，真空渗透遗传转化室就已处于真空状态，使活体水稻植株从一开始与含目的基因的农杆菌渗透遗传转化液接触时就是在真空状态下接触，实现了真正的真空状态下的水稻渗透遗传转化，增强了农杆菌对植株的侵染力，因此，本发明与现有技术相t匕，具有以下有益效果:
1、本发明装置能够使待转化植株一开始接触渗透遗传转化液进行遗传转化时就在真空状态下进行，真正实现了在真空状态下对水稻进行遗传转化，增强了农杆菌对植株的侵染力。克服了现有技术在植株浸泡在容器内的渗透遗传转化液中后，才开始抽真空，浸泡于渗透液内进行渗透遗传转化的植株实际是部分时间在常压下，部分时间在真空状态下，并没有真正实现真空渗透转化，农杆菌对植株的侵染力降低，转化效率也随之降低的缺陷。
[0015]2、本发明实现了水稻的原位真空渗透遗传转化，且不损伤水稻植株。本发明装置中环状承接台的设置可使连同培养钵一起的原位条件下的水稻植株便捷地倒置在真空渗透遗传转化室的环状承接台上，使活体水稻植株稻穗自然下垂且不受损伤。
[0016]3、本发明装置设计巧妙，各部件结构合理，连接简便。真空渗透遗传转化室内的环状承接台可承接较重的倒置培养钵，实现了较大个体植物的活体原位渗透遗传转化，并且植株不会被压断或折断。本发明装置的使用不受作物个体大小的限制，不仅适用于芥菜、白菜、菜薹、甘蓝型油菜、萝卜、烟草等个体较小作物，水稻、花卉、棉花、麦类等个体较大作物同样适用。
[0017]4、本发明装置操作简便，大大提高了工作效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明装置的结构示意图。
[0019]图2是本发明装置的主示图。
[0020]图3是图2中A— A剖视图。
[0021]图4是真空渗透遗传转化室的结构示意图。
[0022]图5是底板的结构示意图。
[0023]图6是支承桌的结构示意图。
[0024]图7是真空渗透遗传转化室与底板连接的结构示意图。
[0025]图8是底板、上圆柱、磁铁环II连接的结构示意图。
[0026]图9是底板、上圆柱、磁铁环I1、下圆柱、磁铁环I连接的结构示意图。
[0027]图10是支架的结构示意图。
[0028]图11是渗透液盛放容器、支架、上圆柱、磁铁环I1、底板、下圆柱、磁铁环I连接的结构示意图。
[0029]图12是本发明装置使用状态示意图。所述使用状态是指将种植有水稻的培养钵倒置在真空渗透遗传转化室内的环状承接台上时的状态。
[0030]图13是图3中磁铁环II上升至最闻位直时的结构不意图。所述磁铁环II上升至最高位置时是指向上推动磁铁环I使磁铁环II随之上升至不能再向上升的位置。
[0031]图14是现有技术进行植物真空渗透遗传转化使用的真空干燥器示意图。
[0032]图中各标记依次表不:I一支承桌，2—下圆柱，3—磁铁环I ,4一底板,5—上圆柱，6—磁铁环II，7—真空渗透遗传转化室，8—支架，9一渗透液盛放容器，10—空气通气管，11 一阀丨]，12—盖板，13一密封圈I，14一真空抽气接管，15—环状承接台，16一密封圈II，17一支腿，18一支承板，19一通孔，20一培养鉢，D是通孔的直径，K是磁铁环I的外径，H是支腿的长度，N是磁铁环II的厚度，L是上圆柱的柱高，R是磁铁环II位于上圆柱最低处时(即磁铁环II在底板上时)渗透液盛放容器口与环状承接台下表面之间的距离，Q是环状承接台下表面至底板上表面之间的距离，E是磁铁环II上升到最高位置时，渗透液盛放容器口至底板上表面之间的距离(所述磁铁环II上升至最高位置时是指向上推动磁铁环I使磁铁环II随之上升至不能再向上升的位置)，M是环状承接台的环孔孔径。
【具体实施方式】
[0033]参见图1一图13，本发明所述的一种水稻真空渗透遗传转化装置设有支承桌1、底板4、磁铁环I 3、磁铁环II 6、下圆柱2、上圆柱5、真空渗透遗传转化室7、支架8、渗透液盛放容器9，密封圈I 13，密封圈II 16部件，具体结构是:
A.真空渗透遗传转化室7的结构:真空渗透遗传转化室7为中空的圆柱形，且真空渗透遗传转化室7的顶端和底端均为敞口，在真空渗透遗传转化室7的顶端口盖有盖板12，真空渗透遗传转化室7的顶端口全部与盖板12的下表面接触，真空渗透遗传转化室7室内上部的内壁固定连接有环状承接台15，环状承接台15的环孔孔径M的尺寸以能使倒置在环状承接台15上的水稻培养钵20不从环状承接台15的环孔中掉落为准。环状承接台15的的环孔孔径M可为18?23cm,通常培育水稻的培养钵的内径为21cm?25cm,因此,倒置在环状承接台15的培养钵不会从环状承接台15的环孔中漏下，可以达到试验目的。在位于环状承接台15之上的室壁上分别设置有空气通气管10和真空抽气接管14，空气通气管10上设置有阀门11 ；
B.支架8的结构:支架8由四条竖直的支腿17和支承板18组成，四条竖直的支腿17的顶端均分别与支承板18的下表面固定连接； C.总体结构:
在支承桌I的桌面中部设置有通孔19，支承桌I的桌面上放置有底板4，底板4将支承桌I的桌面全部覆盖，底板4的下表面中部垂直固定连接有下圆柱2，下圆柱2上间隙套有磁铁环I 3 (即套在下圆柱2上的磁铁环I 3与下圆柱2间隙配合)，通孔19的直径D大于磁铁环I 3的外径K，D > K，下圆柱2和磁铁环I 3均穿过通孔19位于支承桌I桌面之下，在底板4上表面中部且在与下圆柱2对应的位置垂直固定连接有上圆柱5 (即上圆柱5的中心线与下圆柱2的中心线重合)，上圆柱5上间隙套有磁铁环II 6 (即套在上圆柱5上的磁铁环II 6与上圆柱5间隙配合)，磁铁环I 3与磁铁环II 6相邻的磁极为同极(即磁铁环I 3上表面的磁极与磁铁环II 6下表面的磁极相同);真空渗透遗传转化室7放置在底板4的上表面中部，真空渗透遗传转化室7底端口全部与底板4的上表面接触，且上圆柱5及其套有磁铁环II 6位于真空渗透遗传转化室7的室内；支架8的四条支腿17放置在磁铁环II 6的上表面上，在支架8的支承板18上放置有渗透液盛放容器9，支架8和渗透液盛放容器9均位于位于在真空渗透遗传转化室7的室内，渗透液盛放容器9位于真空渗透遗传转化室7内的环状承接台15的下方；支腿17的长度H与磁铁环II 6的厚度N之和大于上圆柱5的柱高L,H+N > L ;磁铁环II 6位于上圆柱5最低处时(即磁铁环II 6在底板4的上表面)，渗透液盛放容器9 口与环状承接台15下表面之间的距离R为80cm?120cm ;80cm?120cm是通常适宜进行水稻遗传转化的水稻全植株高，此R值可满足常规的水稻遗传转化的需求，使真空渗透遗传转化室7内还未处于真空状态时(还未进行抽真空操作)，倒置的活体水稻植株稻穗与渗透液盛放容器9内含目的基因的农杆菌渗透转化液不接触。R尺寸还可根据待转化植株的株高进行调整，其目的是使真空渗透遗传转化室7内还未处于真空状态时，倒置的活体植株与含目的基因的农杆菌渗透转化液不接触。真空渗透遗传转化室7的底端口通过密封圈II 16与底板4的上表面密封连接，以使真空渗透遗传转化室7的底端口密封不漏气，真空渗透遗传转化室7的顶端口通过密封圈I 13与盖板12密封连接，以使真空渗透遗传转化室7的顶端口密封不漏气，使整个真空渗透遗传转化室7达到密封状态。
【权利要求】
1.一种水稻真空渗透遗传转化装置，其特征在于:该装置设有支承桌(I)、底板(4)、磁铁环I (3)、磁铁环II (6)、下圆柱(2)、上圆柱(5)、真空渗透遗传转化室(7)、支架(8)、渗透液盛放容器(9)，密封圈I (13)，密封圈II (16)部件，具体结构是: A.真空渗透遗传转化室(7)的结构:真空渗透遗传转化室(7)为中空的圆柱形，且真空渗透遗传转化室(7)的顶端和底端均为敞口，在真空渗透遗传转化室(7)的顶端口盖有盖板(12)，真空渗透遗传转化室(7)室内上部的内壁固定连接有环状承接台(15)，在位于环状承接台(15)之上的室壁上分别设置有空气通气管(10)和真空抽气接管(14)，空气通气管(10)上设置有阀门(11); B.支架(8)的结构:支架(8)由四条竖直的支腿(17)和支承板(18)组成，在四条竖直的支腿(17)的顶端分别与支承板(18)的下表面固定连接； C.总体结构: 在支承桌(I)的桌面中部设置有通孔(19)，支承桌(I)的桌面上放置有底板(4)，底板(4)的下表面中部垂直固定连接有下圆柱(2)，下圆柱(2)上间隙套有磁铁环I (3)，通孔(19)的直径D大于磁铁环I (3)的外径K，D > K，下圆柱(2)和磁铁环I (3)均穿过通孔(19)位于支承桌(I)桌面之下，在底板(4)上表面中部且在与下圆柱(2)对应的位置垂直固定连接有上圆柱(5)，上圆柱(5)上间隙套有磁铁环II (6)，磁铁环I (3)与磁铁环II (6)相邻的磁极为同极；真空渗透遗传转化室(7)放置在底板(4)的上表面中部，且上圆柱(5)及其套有磁铁环II (6)位于真空渗透遗传转化室(7)的室内；支架(8)的四条支腿(17)放置在磁铁环II (6)的上表面上，在支架(8)的支承板(18)上放置有渗透液盛放容器(9)，渗透液盛放容器(9)位于真空渗透遗传转化室(7)室内的环状承接台(15)的下方；支腿(17)的长度H与磁铁环II (6)的厚度N之和大于上圆柱(5)的柱高L，H+N> L ;磁铁环II (6)位于上圆柱(5)最低处时，渗透液盛放容器(9) 口与环状承接台(15)下表面之间的距离R为80cm?120cm;真空渗透遗传转化室(7)的底端口通过密封圈II (16)与底板(4)的上表面密封连接，真空渗透遗传转化室(7)的顶端口通过密封圈I (13)与盖板(12)密封连接。
2.根据权利要求1所述的水稻真空渗透遗传转化装置，其特征在于:真空渗透遗传转化室(7)室内壁连接的环状承接台(15)的环孔孔径M为18?23cm。
【文档编号】C12M1/42GK104263645SQ201410467839
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】钟巧芳, 程在全, 李维蛟, 张敦宇, 殷富有, 李定琴, 余腾琼, 柯学, 肖素勤, 陈玲, 陈越, 付坚, 王玲仙, 蒋聪, 王波, 曾民, 李娥贤, 罗红梅, 蒋春苗, 黄兴奇 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所