一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿dna的方法
【专利摘要】本发明涉及一种选择性扩增游离胎儿DNA的方法，包括如下步骤：将孕妇血浆中游离DNA末端补平后经加A反应，得到有粘性末端的游离DNA后与利用寡核苷酸制备的接头DNA进行连接反应，以连接产物为模板，寡核苷酸为引物进行PCR扩增反应：72℃接头延伸，80-87℃预变性3min，80-87℃变性20s，72℃退火20s，72℃延伸，80-87℃变性20s，57℃退火20s，72℃延伸，4℃保温。本方法选择性扩增游离胎儿DNA而不扩增母体游离DNA，可最大程度消除母体DNA背景干扰，提高游离胎儿DNA浓度，从而提高诊断的灵敏度与特异性。
【专利说明】一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DNA扩增【技术领域】，具体指一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA 的方法。
【背景技术】
[0002] 孕妇血楽中存在着少量的游离胎儿DNA (Cell-free fetal DNA, cffDNA)，是进行 无创性产前诊断的理想检材，利用游离胎儿DNA可以早期、特异地进行产前筛查和诊断，且 不易受到以往妊娠的干扰，为无创性产前诊断方法提供了新的途径。但孕妇血浆中游离胎 儿DNA含量极少，并且游离胎儿DNA与母体DNA混杂在一起，现有的对于孕妇血浆中游离胎 儿DNA的研究，都是在较高的母体DNA背景干扰下进行的，极容易引起误差。
[0003] 血浆中大多数游离胎儿DNA分子片段长度小于300bp，而大多数母体DNA分子片段 长度大于300bp，根据这一特点，可以依据DNA分子片段长度的差异，特异性富集片段长度 小于300bp的DNA分子，主要有以下两种方法：一种是通过琼脂糖凝胶电泳法将小片段的游 离胎儿DNA与大片段的母体血浆DNA分离开，从而富集游离胎儿DNA分子；另一种是在磁珠 法或硅胶模法提取DNA的基础上，通过调整吸附反应体系，选择性吸附小片段的DNA分子， 从而达到富集游离胎儿DNA的目的。但血浆中的DNA含量非常少，富集游离胎儿DNA分子 方法精确度低，并且极容易带入外源性核酸污染物其浓度在ng/ml水平，并且其中游离胎 儿DNA仅为血浆总游离DNA的19%左右，即使提取效率能够达到100%，仍然需要几毫升甚 至几十毫升的血液样品才能够满足常规检测的要求。如何消除母体DNA背景干扰，提高游 离胎儿DNA浓度，从而提高诊断的灵敏度与特异性，已经成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿 DNA的方法，在最大程度上消除母体DNA背景千扰情况下选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿 DNA，并能够在保证DNA分子完整性的同时，包括如下步骤：
[0005] (l)PCR扩增反应模板的制备：
[0006] A.合成甲乙两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端为T碱基，从寡核苷酸甲3'端的第二 个碱基与寡核苷酸乙5'端开始互补；将寡核苷酸乙5'端用磷酸根修饰；经退火反应得到接 头 DNA。
[0007] B.将游离DNA末端补平后经加 A反应，得到有A粘性末端的游离DNA。
[0008] C.将步骤A得到的接头DNA和步骤B得到有粘性末端的游离DNA进行连接反应， 得到连接产物。
[0009] ⑵通过特定的PCR反应程序，选择扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA，而大多数母体 DNA分子片段长度大于300bp不能被扩增。
[0010] 利用步骤C所述的连接产物为模板，步骤A中的寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增 过程如下：
[0011] (3)72。(：下接头延伸5111111,
[0012] (b)80 ?87°C 下预变性 3min，
[0013] (c)8〇 ? 87°C下变性 2〇s，
[0014] (d) 72Γ下退火（每个循环较前一循环降低0. 5? ) 20s，
[0015] (e)72O 下延伸 2min，
[0016] (f)重复（c)-(e)30 个循环，
[0017] (g)80 ?87°C下变性 20s，
[0018] (h) 57Γ 下退火 20s，
[0019] (i)72°C 下延伸 2min，
[0020] (j)重复（g)-(i)l〇_2〇 个循环，
[0021 ] (k)72°C 下延伸 5min，
[0022] (1)4°C 下保温。
[0023] 作为优选，PCR扩增反应过程如下：
[0024] (a) 72。〇下接头延伸5min，
[0025] (b)82 ?84°C下预变性 3min，
[0026] (c)82 ?84°C下变性 2〇s,
[0027] (d) 72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C ) 20s,
[0028] (e)72°C下延伸 2min,
[0029] ⑴重复（c)-(e) 3〇个循环，
[0030] (g)82 ?84?下变性 20s，
[0031] (h) 57 ? 下退火 20s，
[0032] (i)72O下延伸 2min，
[0033] (j)重复（g)-(i)l〇_20 个循环，
[0034] (k)72°C 下延伸 5min，
[0035] (1)4°C 下保温。
[0036] 所述的寡核苷酸甲长度为10-50个碱基，所述的寡核苷酸乙长度为5-47个碱基， 寡核苷酸甲碱基数比寡核苷酸乙多3-30个。
[0037] 所述的磷酸根修饰是通过T4多聚核苷酸激酶实现的。
[0038] 所述的末端补平是通过T4DNA聚合酶实现的。
[0039] 所述的加 A是通过Taq DNA聚合酶实现的。
[0040] 所述的接头DNA和有A粘性末端的游离DNA的连接是通过T4DNA连接酶实现的。
[0041] 本发明方法相对于现有技术具有以下优越性：1·在最大程度上消除母体DNA背景 千扰和避免带入外源性核酸污染物情况下提高胎儿DNA浓度，从而提高诊断的灵敏度与特 异性。2.能够在保证DNA分子完整性的同时，选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA。
【专利附图】
【附图说明】
[0042] 图1是实施例2-8的电泳图像。
【具体实施方式】
[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0044] 下述实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0045] 实施例1 :PCR扩增反应模板的制备
[0046] (1)设计并合成甲乙一 条募核昔酸：募核昔酸甲：5' -GCX} OTG A(X QX Μ? TGA ATT CT-3'，寡核苷酸乙：5' -GAA TTC AGA TC-3'。
[0047] (2)寡核苷酸乙5'端磷酸根修饰，反应如下（总体系5〇 y υ :
[0048] 核苷酸乙<100μ?νβ _ 1 〇χ reaction buffer A for T4 PNK Λ1Ρ: (IDmM): Q iul r ;M.多聚核酸激酶（1〇υ/μ?> ：1ι5μΙ ddE20 孙至
[0049] 轻柔吹打混匀，37°C水浴60min，75°C水浴lOmin灭活。
[0050] ⑶退火反应（总体系100 μ 1):
[0051] 经紮酸扎修饰;·5寡气?=卩醜￡ 5αμ1 細辦 AnficmlirtgBiifiiribflMAOlLpis (5x) .眞 樣随2〇 '1卜親綱_
[0052] 反应条件如下：
[0053] 95 °C 2min
[0054] %°C (每％sec 下降丨，降至 25Γ ) _] 4Γ下保温
[0056]所得产物即为接头DNA。 末端补平：糊1QQng经麵7氯仿，异鋪法提取的游离亂 进仃如下反应（总体系1〇 μ D :
[0058] lOtog
[0059] _WB_r m μα ?μ? dNTP Mixture C2.SmM^J ^ ddftO# 至 751下保濕5nin盾a: if^恒魁槽 T4 聚合_ IliI M加詳雛糧吹·甸， 3fU下像温 ^Omin
[0060] 使用AxyPr印PCR清洁试剂盒纯化DNA，溶解于25 μ 1 Eluent溶液中。
[0061] (5)经末端补平后的游离DNA的加 A反应：利用步骤⑷所得产物，进行如下反应 (总体系50 μ 1):
[0062] 经 Π 补平后DNA 24}h l^dA TailingBuffi* 25μ1 ciu/μ?) M 7?:.、\温 施
[0063] 使用AxyPr印PCR清洁试剂盒纯化DNA,样品溶解于25 μ 1 Eluent溶液中。
[0064] (6)将步骤⑶得到的接头DNA和步骤（5)得到有A粘性末端的游离DNA进行连 接反应，反应体系如下（总体系30 μ 1):
[0065] 有Α丨:张 ?:端的游l·.. 1:)Ν?Α 2、，ι1 義头wa m 10M..,igase Buffer 3μ? 窺道為:鐘酶（3?μ?) 細1 ddHaO 补Μ 30μΙ
[0066] 反应程序如下：
[0067] 4X2 ia ?*C. lOmin
[0068] 实施例2:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0069] 利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1)：
[0070] 实施例1产物 3μ1 lOxPlaiinum HiProof Taq PCR Buffer 2μ[ MgCh (25m.M) 1.2μ1 dNTP (2,5mM each) 1.6μΙ 霖核Tf酸平（20μΜ+) 0.5μΙ Platinum HiProof Taq (2υ/μ1) 0.5μ1 <MH20 补至 20μ1
[0071] PCR扩增反应过程如下：
[0072] (a)72°C下接头延伸 5min,
[0073] (b)8〇°C下预变性 3min，
[0074] (c)80°C下变性 20s，
[0075] (d) 72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C ) 20s，
[0076] (e)72°C 延伸 2min，
[0077] (f)重复（c) - (e) 30 个循环，
[0078] (g)8(TC 下变性 20s，
[0079] (h)57°C下退火 20s，
[0080] (i)72°C下延伸 2min，
[0081] (j)重复（g) _(i) 10-20 个循环，
[0082] (k)72°C 下延伸 5min，
[0083] (1) 4 °C 下保温。
[0084] 实施例3:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0085] 利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1)：
[0086] 实施例1产物 3μΙ
[0087] lO^Plattaan HIErorf'TaqTCR Buftr 2μ? M^la CI5mM> Ι.2μ1 dNTP C2.5mMeach> 1 鄭1 寡核苷酸甲--μΜ?: Θ,5μ1. FlMipiini.HiProof Taq ：(2?/μΙ): 0 5μ1 ddtfc&.l卜至 _2_i
[0088] PCR扩增反应过程如下：
[0089] (a)72°C接头延伸 5min,
[0090] (b) 81°C 下预变性 3min,
[0091] (c)81°C下变性 20s,
[0092] (d)72°C下退火（每个循环较前一循环降低〇· 5°C )20s，
[0093] (e)72°C下延伸 2min,
[0094] (f)重复（c) - (e) 3〇 个循环，
[0095] (g)81°C下变性 20s,
[0096] (h)57°C下退火 20s,
[0097] (i)72°C下延伸 2min,
[0098] (j)重复（g) -(i) 10-20 个循环，
[0099] (k)72°C 下延伸 5min，
[0100] (1)4°C 下保温。
[0101] 实施例4:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0102] 利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1):
[0103] 实尥咧j托?；； ?μ1 1 〇χ Platinum HiProofTaq PCR Buffer 2μΙ MgCb (25fflM3： 1.2μ1 dNTP t2,5mM：'.eaeii) Ι,6μ1
[0104] 灘__甲:.__) ().5μ! Plaftim ffiPr〇ofTa| (2υ/μΙ> 〇.5μΙ 趣20μ1
[0105] PCR扩增反应过程如下：
[0106] (a)72°C下接头延伸 5min，
[0107] (b)82°C 下预变性 3min，
[0108] (c)82°C下变性 2〇s，
[0109] (d) 72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C ) 20s，
[0110] (e)72°C 下延伸 2min，
[0111] ⑴重复（c)_(e)3〇个循环，
[0112] (g)82°C下变性 20s，
[0113] (h)57°C下退火 20s，
[0114] (i)72°C下延伸 2min，
[0115] (j)重复（g) _(i) 10-20 个循环，
[0116] (k)72°C 下延伸 5min，
[0117] (1)4°C 下保温。
[0118] 实施例5:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0119] 利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1)：
[0120] 实施例1产物 3μ1 I()xPlatinum HiProof Taq PCR Buflfer 2μ1 MgCh (25mM) !.2μΙ dNTP (2.5mM each) !.6μ1 霖核(20μΜ) 0·5μ1 Platinum HI Proof Taq (2υ/μ1) 0,5μ1 ddH20 补至 20μ1
[0121] PCR扩增反应过程如下：
[0122] (a)72°C下接头延伸 5min，
[0123] (b)83°C下预变性 3min，
[0124] (c)83°C下变性 20s，
[0125] (d)72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C )20s，
[0126] (e)72°C下延伸 2min，
[0127] (f)重复（c)-(e) 30 个循环，
[0128] (g)83°C下变性 20s，
[0129] (h)57°C下退火 20s，
[0130] (i)72°C下延伸 2min，
[0131] (j)重复（g) _(i) 10-20 个循环，
[0132] (k)72°C 下延伸 5min，
[0133] (1)4°C 下保温。
[0134] 实施例6:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0135]利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1)：
[0136] :实施_ 1.:产:_ 3μ? lO^Platinum HiPraof Tkq PCR Bufier 2一 M鋒(25mM> ；l,3pl 3MTP C!JmM each:) 1, jpj 寡核蕾麵：ψ α〇μΜ) 〇.5pl Platinum HiProofTaq (2?/μ1) 〇.§μ| 补至 _
[0137] PCR扩增反应过程如下：
[0138] (&)72。(：下接头延伸51^11，
[0139] (b)84°C 下预变性 3min，
[0140] (c)84°C下变性 20s,
[0141] (d) 72 °C下退火（每个循环较前一循环降低〇. 5? ) 20s，
[0142] (e)72°C 下延伸 2min，
[0143] (f)重复（c) - (e) 30 个循环，
[0144] &)84。(：下变性2〇8，
[0145] (h)57°C 下退火 20s，
[0146] (i)72°C下延伸 2min，
[0147] (j)重复（g)-(i) 1〇_20 个循环，
[0148] (k)72°C下延伸 5min，
[0149] (1)4°C 下保温。
[0150] 实施例7:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0151] 利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1)：
[0152] 实施钶i产物 m 10 ^Platimun HiProof TaqPCR Buffer 2μ1 MgCla C15mM> _ miW C2 5mM^*} 1.6μ! __議申（20_} 0.5μ1 Piafttura HiProaf 1-- (2ΚμΙ) 〇,5μΛ 鋪iO#至 ?μ?
[0153] PCR扩增反应过程如下：
[0154] (a)72°C下接头延伸 5min，
[0155] (b)86°C下预变性 3min，
[0156] (c)86°C下变性 2〇s，
[0157] (d)72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C )20s，
[0158] (e)72°C下延伸 2min，
[0159] (f)重复（c) - (e) 30 个循环，
[0160] (g)86°C下变性 20s，
[0161] (h)57°C 下退火 20s，
[0162] (i)72°C下延伸 2min，
[0163] (j)重复（g)-(i)10_20 个循环，
[0164] (k)72°C 下延伸 5min，
[0165] (1)4°C 下保温。
[0166] 实施例8:孕妇血浆中胎儿游离DNA选择性PCR扩增
[0167] 利用实施例1的连接产物为模板，寡核苷酸甲为引物进行PCR扩增反应（总体系 20 μ 1):
[0168] 实施例1产_ 10 X Plattemi Hffroof laq P? Buf&r 2μ1 MgCh CtlmM：) 1.2μ1 dNTP C：2JmM eaeli) Up! 寒核豐_甲_ (2〇.μΜ) ：0.Sp Platinum 碰_Fllq C21%1) :〇.3_ ddHaD 补至 20μΙ
[0169] PCR扩增反应过程如下：
[0170] (a)72°C下接头延伸 5min，
[0171] (b)87°C下预变性 3min，
[0172] (c)87°C下变性 20s，
[0173] (d)72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C )20s，
[0174] (e)72°C下延伸 2min，
[0175] (f)重复（c)-(e) 30 个循环，
[0176] (g)87°C下变性 20s，
[0177] (h)57°C下退火 20s，
[0178] (i)72°C下延伸 2min，
[0179] (j)重复（g) _(i) 10-20 个循环，
[0180] (k)72°C 下延伸 5min，
[0181] (1)4°C 下保温。
[0182] 取实施例2-8产物进行电泳，结果如图1所示，其中泳道1为DL2000DNA Marker， 泳道2为实施例2产物，泳道3为实施例3产物，泳道4为实施例4产物，泳道5为实施例 5产物，泳道6为实施例6产物，泳道7为实施例7产物，泳道8为实施例8产物，泳道9为 空白对照。
[0183] 结果表明：本方法选择的温度80_87°C能够选择扩增小片段的DNA分子，而大片段 DNA分子不能被扩增。
【权利要求】
1. 一种选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 合成两条寡核苷酸，寡核苷酸甲3'端为T碱基，从寡核苷酸甲3'端的第二个碱基与 寡核苷酸乙5'端开始互补；将寡核苷酸乙5'端用磷酸根修饰；经退火反应得到接头DNA ; (2) 将游离DNA末端补平后经加 A反应，得到有A粘性末端的游离DNA ; (3) 将步骤（1)得到的接头DNA和步骤（2)得到的有A粘性末端的游离DNA进行连接 反应，得到连接产物； (4) 利用步骤⑶所述的连接产物为模板，步骤⑴中的寡核苷酸甲为引物进行PCR扩 增，反应过程如下： (a) 72°C下接头延伸5min， (b) 80?87°C下预变性3min, (c) 8〇 ?87°C下变性 2〇s， (d) 72°C下退火（每个循环较前一循环降低0· 5°C )20s， (e) 72°C下延伸 2min， (f) 重复（c)-(e) 30个循环， (g) 8〇 ?87°C下变性 2〇s， (h) 57°C下退火 20s， (i) 72°C下延伸 2min， (j) 重复（g)-(i)l〇_2〇 个循环， (k) 72°C 下延伸 5min， (l) 4°C下保温。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4)中（b)82?84°C下预变性3min。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（4)中（c) 82?84°C下变性20s。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（4)中（g) 82?84°C下变性20s。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的磷酸根修饰是通过T4 多聚核苷酸激酶实现的。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的末端补平是通过T4DNA 聚合酶实现的。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤⑵中所述的加 A是通过Taq DNA聚 合酶实现的。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的连接是通过T4DNA连 接酶实现的。
【文档编号】C12Q1/68GK104232771SQ201410468117
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】张桂珍, 杨麒巍, 杜珍武, 宋旸, 于杉 申请人:吉林大学