一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓pcp蛋白及生产方法
【专利摘要】本发明公开了一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及其生产方法，该方法主要包括以下步骤：(1)克隆PCP基因；(2)构建真核表达载体并转化其到真核酵母宿主中；(3)通过筛选，得到高水平分泌表达的酵母转化子，酵母表达的PCP存在糖基化和非糖基化的两种形式；(4)利用摇瓶扩大培养，培养液上清经透析后经镍亲合层化得到高纯度的糖基化和非糖基化的PCP蛋白；(5)将纯化的重组PCP蛋白加入到培养的不同肿瘤细胞系中，该重组蛋白对骨肉瘤细胞U2OS、胃癌细胞MGC803等细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。本发明首次利用毕赤酵母表达系统表达了具有选择性抗肿瘤细胞活性的一种新的茯苓免疫调节蛋白PCP，该方法既可以大量生产活性PCP蛋白，又为肿瘤的治疗增加了一种新的重组蛋白。
【专利说明】
一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及生产方法
技术领域
[0001] 本发明涉及应用重组DNA技术生产基因工程蛋白药物的技术，特别涉及一种选择 性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及生产方法。
【背景技术】
[0002] 茯苓是中国的道地、大宗药材。茯苓因其性平、味苦、无毒，具有渗湿利水、防癌抗 衰、增强机体免疫力的功效，被称为中国的四大原料药之一，临床中药处方中65 %都有茯 苓，也是当前国际药品市场最具潜力的天然药物之一。同时被国家卫生部、国家中药管理局 列入"既是食品又是药品的品种名单"。茯苓中的主要成分为膳食纤维，其比例占茯苓干重 的80%以上;其次为蛋白质，约占茯苓干重的1.5%。目前，对茯苓活性成分的研究主要集中 在非蛋白类的次生代谢产物上。茯苓有效成分的研究中，研究得最多的就是茯苓多糖，即茯 苓次聚糖，它具有抗肿瘤活性，其衍生物羧甲基茯苓糖已被证明具免疫促进及抗肿瘤作用， 而U-茯苓多糖和羟乙基茯苓多糖则可抑制小鼠肉瘤细胞生长、调节免疫系统功能；其次是 茯苓的三萜类化合物，可抑制癌细胞增生，目前的研究发现茯苓三萜类化合物还具有抗炎、 抗肿瘤细胞生成及诱生集落刺激因子等作用。目前，对占茯苓干重1.5%的茯苓蛋白的研究 几乎没有报道。
[0003] 国立台湾大学的研究者从茯苓干燥菌核中经由阴离子交换树脂与胶体过滤层析 纯化得到一种免疫调节蛋白FIP。体外试验显示该茯苓蛋白FIP能刺激RAW 264.7巨噬细胞 产生TNF-α与IL-Ιβ，同时亦能调控NF-κΒ相关基因的表达量。另外，不少研究者也从其它食 用和药用真菌中分离纯化到了多种类似功能的蛋白。因此，茯苓中也可能存在多种具有免 疫调节功能的蛋白，利用基因工程技术，大量生产这类蛋白并对其生物活性进行开发，将为 整个茯苓及其制品产业的开发提供新的思路和新的产品。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白及生产方法，并 开发其独特的生物功能，根据该方法可获得稳定、高效分泌表达rPCP的毕赤酵母转化子并 有效纯化到了不同糖基化修饰的蛋白，该重组蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性;利用该发 明陈述的方法，可保证得到的一种新的重组功能蛋白。
[0005] 解决上述目的的技术方案如下：
[0006] 一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 进一步的，该蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性。
[0008] 进一步的，该蛋白包括糖基化修饰和未经糖基化修饰两种形式。
[0009] -种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白的生产方法，步骤如下：
[0010] 1)、克隆茯苓免疫调节蛋白PCP基因：以新鲜茯苓菌核为材料，先用RT-PCR扩增总 cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出茯苓免疫调节蛋白PCP，所用特异引物上游引 入Xho I酶切位点、在下游未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pUC载体，得质 粒PCP/pUC，经过测序确定为正确表达序列；
[0011] 2)、构建真核表达载体:将酵母分泌表达载体和质粒PCP/pUC分别经过Xhol及Xba I双酶切并纯化回收，利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZaA/PCP;
[0012] 3)、转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体PPICZaA/PCP用SacI单酶切线性化 后，用电击转化法转入毕赤酵母中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆；
[0013] 4)、高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500yg/mLZe〇Cin的 YH)平板，筛选到了 Zeocin抗性的转化子;将所述Zeocin抗性的转化子利用YPD液体培养基 洗下，经稀释后，涂布到2000yg/mL Zeocin的YH)平板，得到高抗性转化子，再以BMGY培养基 培养至光密度值> 10. 〇，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0%，诱 导72小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rPCP酵母转化子；
[0014] 5)、诱导后的酵母转化子上清液离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH8.0透 析后，镍亲合纯化层析法纯化目标蛋白，纯化蛋白经PBS透析后，利用超滤法浓缩收集到的 蛋白，最后得到纯度达95%以上的重组PCP蛋白；
[0015] 6)、将纯化的重组蛋白加入到培养的不同肿瘤细胞系中，该重组蛋白对骨肉瘤细 胞U20S、胃癌细胞MGC803细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。
[0016] 进一步的，步骤1中包含Xho I和Xba頂每切位点的特异性引物为：
[0017] 上游引物 GCCTCGAGAAAAGATTCGTCTCTCCTAGTAGCGCAC;
[0018] 下游引物GCTCTAGATC TAGAGCATGAGCGGCCCCCACAG。
[0019] 进一步的，步骤3中所述的表达载体为分泌型表达载体、表达菌株为毕赤酵母所有 宿主菌。
[0020] 进一步的，步骤3中所述的表达载体为pPICZaA、表达菌株为X33菌株。
[0021]进一步的，步骤6中所述的不同肿瘤细胞系具体为人肺癌细胞系H1299、人胃癌细 胞系A549、人骨肉瘤细胞U20S、人胃癌细胞MGC803。
[0022]进一步的，步骤6具体为将纯化的重组蛋白加入到培养的人肺癌细胞系H1299、人 胃癌细胞系A549、人骨肉瘤细胞U20S、人胃癌细胞MGC803细胞系中，于37°C，5 %二氧化碳培 养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM为培养基培养至细胞密度为90%，胰酶消化后用含10% 胎牛血清的DMEM将细胞浓度调节至约为106/ml，24孔培养板中，分别加入上述细胞，每孔加 入2ml，37°C，5 %二氧化碳培养箱中将细胞培养12小时，将纯化的重组蛋白以终尝试为lng/ ml加入到上述长有不同细胞的24孔培养板中，37°C，5%二氧化碳培养箱中将细胞培养36小 时，显微镜下拍照，结果表明：该重组蛋白对骨肉瘤细胞U20S、胃癌细胞MGC803等细胞具有 选择性抗肿瘤细胞活性而对人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549未见生物活性。
[0023]选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白在肿瘤治疗及肿瘤治疗药物方面的应用。 [0024]本发明所述蛋白为于初夏时节，气温在20°C左右，从栽种1年的明显可以观察到茯 苓菌核已长成的土壤中采集鲜茯苓菌核，立即用自来水将鲜茯苓洗干净、去皮，切成薄片后 并立即加入液氮中保存，之后经提取得到。
[0025]用本发明所述的生产rPCP的高水平表达酵母转化子及其分离纯化不同程度糖基 化修饰形式的蛋白方法具有显著的优势:一方面，它能够防止宿主菌对表达产物的降解、减 轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用;二是能够促进分泌蛋白按适当的 方式折叠、恢复其天然构象;三是摸索出一条有效纯化具有生物活性、存在不同糖基化修饰 程度的rPCP蛋白的方法；四是测定了毕赤酵母表达rPCP的生物活性，测定结果表明：毕赤酵 母表达的不同程度糖基化修饰的rPCP蛋白在极低浓度下（lng)表现出极高对骨肉瘤细胞 U20S、胃癌细胞MGC803等细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。
[0026]本发明探索出用真核宿主毕赤酵母高效表达和纯化rPCP蛋白的方法，既保证了 rPCP的生物学活性，也高效地获得了大量稳定蛋白。该方法将毕赤酵母中分泌表达的不同 糖基化修饰程度的rPCP蛋白全部纯化下来，得到的产物经生物活性测定表明重组蛋白具有 未曾报道的选择性抗肿瘤细胞生物学活性。
【附图说明】
[0027]图1，真核表达载体pPICZaA/PCP构建示意图；
[0028]图2,摇瓶条件下，毕赤酵母表达的rPCP各时段SDS-PAGE电泳分析示意图；
[0029]图3，rPCP镍亲合纯化条件下，不同浓度咪唑洗脱样品的SDS-PAGE电泳分析示意 图；
[0030]图4，rPCP生物学活性的结果示意图；
【具体实施方式】
[0031]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明方案做进一步详细描述：
[0032] 一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0033] 进一步的，该蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性。
[0034] 进一步的，该蛋白包括糖基化修饰和未经糖基化修饰两种形式。
[0035] -种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白生产方法，包括以下步骤：
[0036] (1)克隆茯苓免疫调节蛋白PCP基因：于初夏时节，气温在20°C左右，从栽种1年的 明显可以观察到茯苓菌核已长成的土壤中采集鲜茯苓菌核，立即用自来水将鲜茯苓洗干 净、去皮，切成薄片后并立即加入液氮中保存。利用植物总RNA提取试剂盒提取总RNA，用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，利用化学法合成特异扩增目标基因的引物对:上游引 物GCCTCGAGAAAAGATTCGTCTCTCCTAGTAGCGCAC和下游引物GCTCTAGATC TAGAGCATGAGCGGCCCCCACAG(合成的特异引物对已经包含Xho I和Xba I酶切位点），PCR扩增 出茯苓免疫调节蛋白PCP，回收所得的PCR产物连接到质粒pUC载体，得质粒PCP/pUC，经过测 序确定为正确表达序列；
[0037] (2)构建真核表达载体:将分泌表达载体pPICZaA和质粒PCP/pUC经过Xhol及Xba I 双酶切后纯化回收，并利用T4DNA连接酶，得重组载体pPICZaA/PCP;
[0038] (3)转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZaA/PCP用SacI单酶切线性化 后，用电击转化法转入毕赤酵母宿主菌中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆，阳性克隆利用聚 合酶链式反应得到了验证；
[0039] (4)高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有较高浓度Zeocin 500yg/mL的YPD平板，筛选到了较高Zeocin抗性的转化子。再将得到的较高Zeocin抗性的转 化子划线转接至含有高浓度Ze 〇cin(2000yg/mL)的YPD平板，筛选到了高Zeocin抗性的转化 子，高抗性转化子在BMGY培养基培养至光密度值> 10，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重 悬细胞并使其甲醇浓度为1. 〇%，于诱导后的〇d，Id，2d，3d，4d时取样，共诱导5天，经SDS- PAGE分析，得到了高水平分泌表达rPCP酵母转化子，在摇瓶条件下的表达情况，该转化子表 达的 rPCP 超过 1 Omg/1 OOmL;
[0040] (5)诱导上清液离心，收集离心后的上清液，经20mM Tris pH 8.0透析后，镍亲合 纯化层析法纯化目标蛋白，纯化蛋白经PBS透析后，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，最后得 到纯度达95%以上的重组PCP蛋白，SDS - PAGE结果表明，该重组蛋白具有不同程度的糖基 化修饰形式。
[0041 ] (6)人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549、人骨肉瘤细胞U20S、人胃癌细胞 MGC803等，于37°C，5%二氧化碳培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)为培养基培养至细胞密度为90%左右，胰酶消化后用含10%胎牛 血清的DMEM将细胞浓度调节至约为106/ml，24孔培养板中，分别加入上述细胞，每孔加入 2ml，37 °C，5 %二氧化碳培养箱中将细胞培养12小时，将纯化的重组蛋白以终尝试为lng/ml 加入到上述长有不同细胞的24孔培养板中，37°C，5%二氧化碳培养箱中将细胞培养36小 时，显微镜下拍照，结果表明：该重组蛋白对骨肉瘤细胞U20S、胃癌细胞MGC803等细胞具有 选择性抗肿瘤细胞活性而对人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549未见生物活性。
[0042]经SDS - PAGE分析，结果表明利用本发明纯化的rPCP含有未经糖基化修饰和不同 程度糖基化修饰的蛋白，使用镍亲合纯化方法能有效将不同糖基化修饰的蛋白一并纯化下 来，该纯化得到的重组蛋白具有未曾报道的选择性抗肿瘤细胞生物学活性。
[0043]本发明的另一目的是提供一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓免疫调节蛋白rPCP。 技术方案简述如下:根据上述方法生产得到的茯苓抗肿瘤蛋白rPCP，含有未经糖基化修饰 和不同程度糖基化修饰的蛋白。
[0044] 试验例：
[0045] 本发明选用毕赤酵母宿主菌，整合性表达质粒pPICZaA载体均购自美国 Invritrogen 公司。
[0046] 所用培养基配方如下：
[0047] 1)酵母生长培养基(BMGY):
[0048]完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700mL<a21°C蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入 100mL 1M磷酸钾溶液，100mL YNB，2mL500*B，100mL 10*GY;
[0049] 2)酵母诱导培养基(BMMY)
[0050] 完全溶解l〇g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到700πιΙ^121°(：蒸气高压灭菌15-20min，冷却到室温，加入 100mL 1Μ磷酸钾溶液，100mL ΥΝΒ，2mL500*B，100mL10*M;
[0051 ] 3)YTO 培养基
[0052] 完全溶解lOg酵母提取物，20g蛋白胨，lOg葡萄糖，定容到lOOOmL，121°C蒸气高压 灭菌 15_20min。
[0053] 一种选择性抗肿瘤细胞活性茯苓免疫调节蛋白PCP及生产方法，主要包括以下步 骤：
[0054] a)克隆PCP全基因：
[0055]设计一对引物，以新鲜茯苓菌核为材料，先用RT-PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模 板，用特异引物扩增出茯苓免疫调节蛋白PCP，PCR条件为:95 °C预变性，5min，一个热循环； 94°C热变性30s，55°C褪火30s，72°C延伸45s，30个热循环;72°C复性10min。所获得的扩增片 断连接到pUCT载体(购自于广州TAKARA公司），用PCR，酶切和核酸测序鉴定，测定序列与 Genebank公布的WCPCP序列高度同源。
[0056] 克隆得到的PCP基因所对应的蛋白质序列如下：（SEQ ID No.l)。
[0057] 2、构建毕赤酵母分泌型表达载体pP I CZa A/PCP
[0058] 1)用Xho I和Xba I双酶切重组质粒PCP/pUC，获得目的片断PCP，反应体系如下(所 用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司）： 质粒 PCP/pUC 15 ,liL l〇xH缓冲液 5μL
[0059] Xho I 5U Xba I 5U 无菌水 个.50μ1_,
[0060] 2)用Xho I和Xba I双酶切pPICZaA，获得载体片断，反应体系如下（所用内切酶及 缓冲液均购自大连TAKARA公司）： 质粒 pPICZaA 15 (iL 1〇χ?缓冲液 5hL
[0061 ] Xho I 5U XbaI 5U 无菌水 个.50μΙ_,
[0062] 3)由1)及2)步后所得目的片断和载体片断，DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购 自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。构建示意图见图1。
[0063] 4)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司）进行连接反 应，目的基因准确插入到含有分泌信号因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下： 质粒pPICZaA片段 ΙμΙ 目的片段落 3>L
[0064] l〇x 缓冲液 IpL T4连接酶 0.5ML 无画水 至10μΙ^
[0065] 得重组载体 pPICZaA/PCP。
[0066] 3、转化重组质粒至毕赤酵母X33中：
[0067] 将5_10yg经Xho I和Xba I双酶切pPICZaA验证的质粒线性化后（Sac I)溶解在10μ L Mill iQ水中，与80yL Χ33菌感受态混均，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；按照 Invitrogen公司操作手册电转化法将重组载体转化到宿主毕赤酵母菌X33中。转化后用含 有100yg/mL Zeocin抗生素的YH)平板进行筛选，利用PCR对转化子进行了验证。
[0068] 4、高水平分泌表达酵母转化子的筛选：
[0069] 经PCR验证的毕赤酵母转化子（阳性克隆)经YH)液体培养基洗下，经稀释后涂布接 种至含有500yg/mL Zeocin抗生素的YH)平板，28°C生长出的转化子YH)液体培养基洗下，经 稀释后再涂布到含有2000yg/mL Zeocin抗生素的YH)平板，筛选高抗性的转化子，高抗性转 化子以BMGY培养基培养至光密度值>10.0，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲 醇浓度为1. 〇%，诱导96小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rPCP酵母转化子。
[0070] 5、rPCP在摇瓶条件下的扩大表达
[0071] 高水平分泌表达酵母转化子于1L BMGY培养基培养至光密度值>10,离心收集细 胞，用150mL BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0%，每24小时取样一次并补加甲醇 一次至终浓度为1%，经诱导4天后，各时间段的样品上清经SDS-PAGE分析。在扩大摇瓶诱导 条件下，该转化子表达的rPCP超过lOmg/100;摇瓶条件下，诱导4天左右，rPCP的表达量达到 最高值，再延长诱导的时间会其表达水平没有明显提高，但糖基化程度会有所改变且糖基 化程度呈现降低趋势。SDS-PAGE电泳结果如图2所示，在约15 - 25kDa处（目标蛋白如箭头所 示)处存在3条特异表达的蛋白条带，其中分子量最小的条带与预期蛋白分子量相符是未经 糖基化的重组PCP蛋白，其它两条条带较预期分子量偏大是糖基化修饰重组PCP蛋白。
[0072] 6、rPCP 的纯化
[0073] 诱导上清液于4°C离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH 8.0透析后，镍亲合 纯化层析法纯化目标蛋白，纯化蛋白经PBS透析后，利用超滤法浓缩收集到的蛋白，最后得 到纯度达95%以上的重组PCP蛋白，SDS - PAGE结果如图3所示，该纯化的重组蛋白具有不同 程度的糖基化修饰形式:在约15_25kDa处（目标蛋白如箭头所示)处存在3条特异表达的蛋 白条带，其中分子量最小的条带与预期蛋白分子量相符是未经糖基化的重组PCP蛋白，其它 两条条带较预期分子量偏大是糖基化修饰重组PCP蛋白，纯化后的蛋白与纯化前目标蛋白 条带相同。经该方法，最后得到纯度达95%以上的重组PCP蛋白。SDS-PAGE结果可以看出，利 用该方法能将所有糖基化形式的蛋白纯化下来。
[0074] 7、rPCP的生物学活性分析
[0075] 将肿瘤细胞株1]203、]\?^803^549、!11299等细胞于正常的10%?83的01^]\1中传代培 养;到细胞生长密度约达80-90 %时，利用胰酶消化，DMEM培养液将细胞调整到1 X 105个/mL 述细胞悬液接种到96孔培养板中，每孔接种1 OOyL。向上述96孔板中分别加入终浓度为0、 0.5、1、5、10、20、50、100、200ng/mL)的rPCP，每个浓度分别做3个重复孔;于温箱中培养36小 时；向各孔中加入l〇yL 5mg/mL的MTT，于培养箱中温育4小时，利用移液枪小心将培养液上 清吸干净，向每孔中加入l〇〇yL的DMS0于震荡器中震荡10min充分溶解，测定570nm光值。所 测结果表明，酵母表达的rPCP具有生物学活性，在极低浓度下（Ing/mL)纯化得到的rPCP对 U20S、MGC803等细胞具有选择杀灭活性(结果如图4所示）。
[0076]以上仅为本发明的具体实施例，并不以此限定本发明的保护范围（如对其它未提 及肿瘤细胞的选择性杀灭）；在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本 发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于:该蛋白具有选择性抗肿瘤细胞活性。3. 根据权利要求1所述茯苓PCP蛋白，其特征在于，该蛋白包括糖基化修饰和未经糖基 化修饰两种形式。4. 一种选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白的生产方法，其特征在于:步骤如下： (1) 克隆茯苓免疫调节蛋白PCP基因：以新鲜茯苓菌核为材料，先用RT-PCR扩增总cDNA， 再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出茯苓免疫调节蛋白PCP，所用特异引物上游引入Xho I酶切位点、在下游未端引入Xba I酶切位点；回收PCR产物连接到质粒pUC载体，得质粒PCP/ pUC，经过测序确定为正确表达序列； (2) 构建真核表达载体:将酵母分泌表达载体和质粒PCP/pUC分别经过XhoI及Xba I双 酶切并纯化回收，利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pPICZaA/PCP; (3) 转化重组载体到真核酵母宿主中：重组载体pPICZaA/PCP用SacI单酶切线性化后， 用电击转化法转入毕赤酵母中；经过Zeocin筛选得到阳性克隆； (4) 高水平分泌表达酵母转化子的筛选：阳性克隆转接至含有500yg/mLZeocin的YH)平 板，筛选到了 Zeocin抗性的转化子;将所述Zeocin抗性的转化子利用YH)液体培养基洗下， 经稀释后，涂布到2000yg/mL Zeocin的YPD平板，得到高抗性转化子，再以BMGY培养基培养 至光密度值>10. 〇，离心收集细胞，用BMMY培养基重悬细胞并使其甲醇浓度为1.0 %，诱导72 小时后，经SDS-PAGE分析，得到了高水平分泌表达rPCP酵母转化子； (5) 诱导后的酵母转化子上清液离心，收集离心后的上清液，20mM Tris pH8.0透析后， 镍亲合纯化层析法纯化目标蛋白，纯化蛋白经PBS透析后，利用超滤法浓缩收集到的蛋白， 最后得到纯度达95%以上的重组PCP蛋白； (6) 将纯化的重组蛋白加入到培养的不同肿瘤细胞系中，该重组蛋白对骨肉瘤细胞 U20S、胃癌细胞MGC803细胞株具有选择性抗肿瘤细胞活性。5. 根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于：步骤（1)中包含Xho I和Xba頂每切位 点的特异性引物为： 上游引物 GCCTCGAGAAAAGATTCGTCTCTCCTAGTAGCGCAC; 下游引物GCTCTAGATC TAGAGCATGAGCGGCCCCCACAG。6. 根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于:步骤(3)中所述的表达载体为分泌型 表达载体、表达菌株为毕赤酵母所有宿主菌。7. 根据权利要求6所述的生产方法，其特征在于:步骤(3)中所述的表达载体为pPICZa A、表达菌株为X33菌株。8. 根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于:步骤(6)中所述的不同肿瘤细胞系具 体为人肺癌细胞系Hl 299、人胃癌细胞系A549、人骨肉瘤细胞U20S、人胃癌细胞MGC803。9. 根据权利要求8所述的生产方法，其特征在于:步骤(6)具体为将纯化的重组蛋白加 入到培养的人肺癌细胞系H1299、人胃癌细胞系A549、人骨肉瘤细胞U20S、人胃癌细胞 MGC803细胞系中，于37 °C，5 %二氧化碳培养箱中，用含10 %胎牛血清的DMEM为培养基培养 至细胞密度为90%，胰酶消化后用含10%胎牛血清的DMEM将细胞浓度调节至约为106/ml， 24孔培养板中，分别加入上述细胞，每孔加入2ml，37 °C，5 %二氧化碳培养箱中将细胞培养 12小时，将纯化的重组蛋白以终尝试为lng/ml加入到上述长有不同细胞的24孔培养板中， 37°C，5%二氧化碳培养箱中将细胞培养36小时，显微镜下拍照，结果表明：该重组蛋白对骨 肉瘤细胞U20S、胃癌细胞MGC803等细胞具有选择性抗肿瘤细胞活性而对人肺癌细胞系 Hl 299、人胃癌细胞系A549未见生物活性。10.选择性抗肿瘤细胞活性的茯苓PCP蛋白在肿瘤治疗及肿瘤治疗药物方面的应用。
【文档编号】A61K38/16GK105884873SQ201610428124
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】李洪波, 吴东海
【申请人】怀化学院