新型嘧啶类抗肿瘤化合物及其制备方法与用途与流程

文档序号:11210772
新型嘧啶类抗肿瘤化合物及其制备方法与用途与流程

本发明涉及新型嘧啶类抗肿瘤化合物及其制备方法与用途,属于医药技术领域。



背景技术:

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTKs)通过控制细胞的信号传导通路调节细胞的生长、分化、凋亡等一系列生理生化过程。受体型酪氨酸激酶是一类横跨细胞膜相对较大的激酶,其具有配体结合的胞外结构域、跨膜结构域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸残基并且由此影响细胞增殖的胞内结构域。在一般人类癌症中(如肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、淋巴瘤)已发现所述激酶的异常表达。蛋白酪氨酸激酶已成为抗肿瘤药物研究开发的重要靶点之一。

黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一种位于黏着斑,由1028个氨基酸组成的细胞质酪氨酸激酶和骨架蛋白,参与多种受体或非受体酪氨酸激酶信号通路,包括肿瘤蛋白Src、血管内皮生长因子-3(VEGFR-3)、p53、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和胰岛素样表皮生长因子-1(IGF-1)等通路,对细胞的存活、增殖、迁移和侵袭等生物行为都有调节作用。已有研究表明,在许多肿瘤细胞中都有FAK的过表达。因此,FAK已成为研究与开发新型抗肿瘤药物的重要靶标。研究表明,绝大多数胰腺癌病人的肿瘤组织中都存在FAK的过表达,而FAK抑制剂可通过多种途径降低胰腺癌细胞的生存力,抑制其生长,促进其凋亡,但FAK抑制剂对正常细胞仅有极少影响。目前,进入临床前或临床研究的FAK抑制剂几乎均为小分子抑制剂,由于FAK与许多细胞信号蛋白都有作用,因此依据作用机制的不同,作为FAK靶向抗肿瘤药物的FAK小分子抑制剂大致分为两大类:ATP依赖型和ATP非依赖型。ATP依赖型FAK小分子抑制剂能干扰FAK催化区域的活性,可能会影响多个下游信号通路,造成较为广泛的副作用,而非ATP依赖型FAK小分子抑制剂如变构FAK抑制剂则可阻滞特定的蛋白质-蛋白质相互作用(如p53与FAK的相互作用),从而抑制FAK的活性。目前已有多个颇具治疗前景的FAK小分子抑制剂陆续开发进入临床前和临床研究,但尚无此类药物上市。其中具有代表性的FAK小分子抑制剂有:PF-00562271是PF-562271的苯磺酸盐,是一种有效的,ATP竞争性,可逆的FAK抑制剂,IC50为1.5nM,作用于Pyk2比作用于FAK效果低10倍左右,比作用于其他蛋白激酶(除了一些CDKs)选择性高100倍以上。目前正进行Phase 1研究(Serrels A.,et al.Int.J.Cancer,2012,131(2):287-97.)。又如,TAE226(NVP-TAE226)是一种有效的FAK抑制剂,IC50为5.5nM,最有效作用于Pyk2,对InsR,IGF-1R,ALK和c-Met作用效果比其弱10到100倍左右。Tae226在体内外实验中对一系列恶性肿瘤都表现出有效的抗增殖和抑瘤作用,目前尚无有关其临床试验的报道(Schultze A.,et al.Invest New Drugs,2010,28(6):825-33.)。此外,Defactinib(VS-6063,PF-04554878)是一种选择性,且口服有效的FAK抑制剂。目前正进行Phase 2研究。(Kang Y.,et al.J.Natl.Cancer Inst.,2013,105(19):1485-95.)

另外与本发明密切相关的专利如:US2013/0281438 A1、CN102264371 A、CN101830889A、CN103052627 A、CN103059030 A、CN103476776 A、CN103534240 A、CN103534241 A。

鉴于治疗癌症的迫切需要,本领域有必要开发新的效果更加良好的药物。



技术实现要素:

本发明的目的之一在于提供一种吗啡啉乙酰胺基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐,该类化合物具有良好的抗肿瘤活性。

本发明的另一目的在于提供含所述吗啡啉乙酰胺基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明的再一目的在于提供所述吗啡啉乙酰胺基嘧啶类化合物或其药学上可接受的盐,或所述组合物的用途。

一方面,本发明提供一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐,所述通式(I)所示的化合物具有如下结构:

R选自甲基、乙基、环丙基、异丙基或2,2,2-三氟乙基;

R1选自氢、氯、甲基或甲氧基;

R2选自氟、氯。

作为本发明的一种具体实施方式,本发明所述通式(I)所示的化合物具有I-1~I-36所示的结构:

优选地,所述通式(I)所示的化合物为I-1。

如上所示结构化合物为吗啡啉乙酰胺基嘧啶类化合物,抗肿瘤活性筛选显示本发明中的化合物大部分都具有较强的抑制胰腺癌细胞(Aspc-1细胞、Bxpc-3细胞和Panc-1细胞)增殖能力,抑制肺癌细胞(H1975细胞)增殖能力,抑制乳腺癌耐药细胞(Mcf-7/adr)增殖能力;部分化合物显示出比参照药物Tae226(CAS:761437-28-9)预料不到的更加优良的抗FAK激酶活性。作为一类结构新颖的分子,本发明中的化合物具有开发成新型高效FAK抑制剂的潜力,对治疗相关的肿瘤疾病尤其是胰腺癌、肺癌和乳腺癌有较大的应用价值。

前述I-1~I-36所示的结构分别具有如下名称:

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-3)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-6)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-7)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-8)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-9)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-10)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-11)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-12)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-13)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-14)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

(I-15)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

(I-16)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

(I-17)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

(I-18)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-19)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-20)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

(I-21)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

(I-22)N-[3-[[5-氟-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-23)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-24)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-25)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

(I-26)N-[3-[[5-氟-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-27)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-28)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-29)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

(I-30)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

(I-31)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

(I-32)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

(I-33)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

(I-34)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-35)N-[3-[[5-氟-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

(I-36)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

另一方面,本发明提供一种药物组合物,其含有有效剂量的本发明所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐,及药用载体。

本发明所述化合物由于它们在药物中的可能用途,式(I)化合物的盐优选药物可接受的盐。本发明的化合物为碱,其中所需盐形式可以通过本领域已知的合适方法制备,包括用无机酸处理游离碱,所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等;或用有机酸处理游离碱、所述有机酸例如乙酸、三氟乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羟基乙酸、水杨酸、吡喃糖苷酸(pyranosidy1 acid),例如葡糖醛酸或半乳糖醛酸,α-羟基酸,例如柠檬酸或酒石酸,氨基酸,例如天冬氨酸或谷氨酸,芳香酸,例如苯甲酸或肉桂酸,磺酸,例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。药学上可接受的盐的实施例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐(propiolates)、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐(phenylbutrates)、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐、例如二甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐和萘-2-磺酸盐。

本发明的药物组合物通常含有一种本发明化合物。然而,在一些实施方案中,本发明的药物组合物含有超过一种本发明的化合物。另外,本发明的药物组合物还可任选包括一种或多种其它药学活性化合物。

本发明还提供所述新型嘧啶类化合物或其药学上可接受的载体,所述药物组合物通过抑制黏着斑激酶,进而抑制肿瘤增殖的用途。具体地,该用途主要为制备用于治疗胰腺癌、肺癌和乳腺癌的药物中的用途。

本发明提供所示的化合物或其药学上可接受的盐,或本发明所述的药物组合物在制备黏着斑激酶抑制剂中的应用。

本发明提供所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐,或本发明所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。优选地,所述肿瘤选自胰腺癌、肺癌和乳腺癌的一种或多种,进一步优选胰腺癌。更优选地,所述用途主要通过抑制黏着斑激酶实现的。

附图说明

图1为本发明实施例不同处理组对Aspc-1的抑制作用随时间变化情况。

图2.1为本发明实施例不同处理组Aspc-1细胞凋亡情况。

图2.2为本发明实施例不同处理组Aspc-1细胞周期分布。

图3为本发明实施例不同处理组对裸鼠肿瘤体积变化的影响。肿瘤体积表示为平均值±标准差(n=5)。

图4为本发明实施例不同处理组对裸鼠肿瘤重量的影响。与空白组相比*p<0.05,**p<0.01(n=5)。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述解释本发明,但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂,为市场购买的常规试剂。

实施例1目标分子的制备

薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板,薄层色谱法(TLC)使用的硅胺板采用的规格是0.15mm-0.2mm,薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm-0.5mm。

本发明使用的原料主要购自可购买自国药集团化学试剂有限公司,北京偶合科技有限公司、阿拉丁化学试剂有限公司、达瑞化学品等公司。

实施例中无特殊说明,溶液是指水溶液。

实施例中无特殊说明,反应的温度为室温,为20℃-30℃。

本发明采用的技术方案如下:

化合物I-i的合成路线、试剂及条件:(d)NaHCO3,CH3CN,2h,0℃,85%;(e)吗啡啉,K2CO3,KI,CH3CN,4h,80℃,75-80%;(b)Fe-NH4Cl,MeOH-H2O,2h,70℃,72%。

I-h的合成

取I-f(3.29mmol)和4.929mmolNaHCO3于15mL乙腈中,慢慢加入I-g(6.57mmol),0℃反应2h后,反应完毕,抽干溶剂,加入80mL水,析出固体,抽滤,烘干,得固体I-h,未纯化直接下一步反应。

I-i的合成

取I-h(2mmol)和K2CO3(2.4mmol),KI(0.2mmol)于10ml乙腈中,搅拌下慢慢滴加吗啡啉(3mmol),升温至60℃,反应4小时后,反应完毕。反应液减压蒸干,加入水,析出固体,抽滤,烘干,投下一步还原反应。上一步产物(2mmol)和NH4Cl(4mmol)加入MeOH-H2O(1:1)中,搅拌下慢慢加入铁粉(8mmol),升温60℃,反应2小时后,反应完毕,趁热抽滤,加入200mL水,析出固体,抽滤,烘干,得固体I-i,未纯化直接下一步反应。

化合物(I)的合成路线、试剂及条件:(a)SOCl2,1h,60℃;100%;(b)RNH2,NaHCO3,CH3CN,4h,0℃;95%;(c)Fe-NH4Cl,MeOH-H2O,2h,70℃,72%;(d)N,N-二异丙基乙基(DIPEA),异丙醇(IPA),6h,80℃;85%;(e)NaHCO3,CH3CN,2h,0℃,85%;(f)吗啡啉,K2CO3,KI,CH3CN,4h,80C,75-80%;(g)对甲苯磺酸,2-BuOH,100℃,12h,10-20%。

I-b的合成

取I-a(5.98mmol,1.00g)于三颈瓶中,加入DMSO(7.176mmol),升温80℃反应1小时后,反应完毕,反应液减压蒸除溶剂,得液体,直接投下一步;上一步产物(3mmol)慢慢滴加入RNH2(2.94mmol),NaHCO3(7.5mmol)的15ml乙腈溶液中,0℃反应,4小时后反应完成。反应液减压蒸干,倒入80ml水中析出固体,抽滤,烘干,得I-b,未纯化直接下一步反应。

I-c的合成

取Ⅰ-b(2mmol)和NH4Cl(4mmol)加入MeOH-H2O(1:1)中,搅拌下慢慢加入铁粉(8mmol),升温60℃,反应2小时后,反应完成,趁热抽滤,加入200mL水,未析出固体,水相用乙酸乙酯萃取(100mL×3),合并乙酸乙酯层,饱和食盐水洗一次,无水硫酸钠干燥,减压蒸干得白色固体I-c,未纯化直接下一步反应。

I-e的合成

取I-c(2mmol)和DIPEA(3mmol),加入8mL异丙醇,搅拌下慢慢滴加入2,4,5-三氯嘧啶(2mmol)或2,4-二氯-5-氟嘧啶(2mmol),升温至80℃反应6小时后,反应完成。反应液减压蒸干,固体加入到20mL饱和NaHCO3水溶液中,析出固体。抽滤,烘干,得白色固体I-e,未纯化直接下一步反应。

目标物(I)的合成

取I-i(1.0mmol)与I-e(1.0mmol),溶于10mL 2-BuOH中,加入对甲苯磺酸(1.5mmol),升温100℃反应12小时,反应完毕后旋蒸干溶剂,加MeOH 5mL,再加饱和碳酸氢钠水溶液50mL析出固体,薄层层析分离纯化得目标化合物(I)。

根据以上方法合成了目标分子,所合成目标分子的理化数据如下:

(I-1)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.78(d,J=4.0Hz,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(d,J=8.0Hz,1H),7.45(t,J=8.0Hz,1H),7.38(s,1H),7.29(d,J=8.0Hz,1H),7.13(d,J=8.0Hz,1H),3.68–3.65(m,4H),3.12(s,2H),2.81(d,J=4.0Hz,3H),2.54(d,J=4.0Hz,4H),2.50(s,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.41,167.62,158.15,155.39,155.04,148.91,139.85,137.02,131.91,128.50,122.36,121.89,121.63,121.05,119.56,113.92,105.56,103.77,66.96(2C),62.14,56.30,53.65(2C),26.79;HRMS(ESI),C25H28ClN7O3,[M+H]+理论计算:510.1942,实测:510.2025。

(I-2)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.54(s,1H),9.43(s,1H),8.82–8.74(m,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.45(t,J=8.0Hz,1H),7.38(s,1H),7.28(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.17–7.11(m,1H),3.69–3.63(m,4H),3.12(s,2H),2.81(d,J=4.0Hz,3H),2.55–2.52(m,3H),2.50(dt,J=4.0,2.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.43,167.65,158.17,155.42,155.07,148.93,139.87,137.04,131.94,128.52,122.38,121.91,121.65,121.07,119.58,119.52,111.92,103.79,66.96(2C),62.14,56.30,53.66(2C),26.79;HRMS(ESI),C25H28ClN7O4,[M+H]+理论计算:526.1891,实测:526.1978。

(I-3)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.49(s,1H),9.42(s,1H),9.28(s,1H),8.73(d,J=4.0Hz,2H),8.22(s,1H),7.72(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.57–7.37(m,4H),7.16–7.06(m,1H),3.71–3.55(m,4H),3.12(s,2H),2.93–2.84(m,1H),2.61–2.52(m,4H),2.17(s,3H),0.77–0.66(m,2H),0.61(dd,J=8.0,4.0Hz,2H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.31,168.11,158.20,155.42,155.17,139.61,137.40,132.06,130.72,130.66,128.81,123.86,122.32,121.72,121.62,121.32,118.00,105.32,66.77(2C),62.24,53.77(2C),23.58,18.39,6.20(2C);HRMS(ESI),C27H30ClN7O3,[M+H]+理论计算:536.2099,实测:536.2191。

(I-4)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.53(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.76(d,J=4.0Hz,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.72(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.43(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),7.28(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.12(t,J=8.0Hz,1H),3.77(s,3H),3.71–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.93–2.85(m,1H),2.57–2.51(m,4H),0.73(td,J=8.0,4.0Hz,2H),0.66–0.57(m,2H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.33,167.61,158.14,155.40,155.06,148.90,139.67,137.02,131.95,128.82,122.31,121.87,121.65,121.18,119.56,111.87,105.55,103.73,66.95(2C),62.14,56.30,53.65(2C),23.58,6.19(2C);HRMS(ESI),C27H30ClN7O4,[M+H]+理论计算:552.2048,实测:552.2136。

(I-5)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),9.64(s,1H),9.42(s,1H),8.76(dd,J=12.0,8.0Hz,2H),8.20(s,1H),7.76(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.63–7.44(m,5H),7.23–7.09(m,1H),3.69–3.60(m,4H),3.30(dt,J=12.0,8.0Hz,2H),3.11(s,2H),2.56–2.50(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.72,168.07,158.22,155.43,155.10,139.72,136.35,133.36,131.80,128.55,122.39,121.91,121.58,120.41,120.33(2C),105.29,66.56(2C),62.53,53.69(2C),34.59,14.97(2C);HRMS(ESI),C25H28ClN7O3,[M+H]+理论计算:510.1942,实测:510.2042。

(I-6)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.53(s,1H),9.42(s,1H),9.28(s,1H),8.76(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.21(s,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.57–7.34(m,4H),7.21–7.07(m,1H),3.70–3.61(m,4H),3.30(dt,J=12.0,8.0Hz,2H),3.12(s,2H),2.59–2.52(m,4H),2.17(s,3H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.74,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,118.01,105.31,66.77(2C),62.25,53.77(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C26H30ClN7O3,[M+H]+理论计算:524.2099,实测:524.2190。

(I-7)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.57(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.78(dd,J=20.0,8.0Hz,2H),8.22(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.50–7.05(m,4H),3.78(s,3H),3.71–3.61(m,4H),3.31(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),3.12(s,2H),2.54(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.75,167.62,158.15,155.40,155.04,148.91,139.78,137.03,131.85,128.59,122.36,121.88,121.64,121.44,119.56,111.89,103.75,66.96(2C),62.14,56.30,53.65(2C),34.59,14.97(2C);HRMS(ESI),C26H30ClN7O4,[M+H]+理论计算:540.2048,实测:540.2149。

(I-8)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.56(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.74(dd,J=24.0,8.0Hz,2H),8.26(s,1H),8.01(d,J=8.0Hz,2H),7.77(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.58–7.46(m,2H),7.17(t,J=8.0Hz,1H),3.72–3.64(m,4H),3.30(dt,J=12.0,8.0Hz,2H),3.16(s,2H),2.57(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.69,168.30,157.77,155.47,155.06,139.53,137.91,132.09,128.62,124.05,122.73,122.54,121.74,121.65,119.46,118.88,106.06,66.87(2C),62.01,53.64(2C),34.59,14.96(2C);HRMS(ESI),C25H27Cl2N7O3,[M+H]+理论计算:544.1552,实测:544.1640。

(I-9)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.37(s,1H),9.64(s,1H),9.42(s,1H),8.62(dd,J=24.0,8.0Hz,2H),8.20(s,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.59–7.45(m,5H),7.15(t,J=8.0Hz,1H),4.12(dq,J=12.0,8.0Hz,1H),3.67–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.55–2.51(m,4H),1.17(d,J=8.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.07(2C),158.22,155.45,155.10,139.51,136.36,133.34,131.68,128.76,122.40,122.15,121.97,120.33(2C),105.23,66.56(2C),62.53,53.69(3C),41.59,22.55(3C);HRMS(ESI),C26H30ClN7O3,[M+H]+理论计算:524.2099,实测:524.2189。

(I-10)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.39(s,1H),9.42(s,1H),9.28(s,1H),8.62(dd,J=16.0,8.0Hz,2H),8.21(s,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.60–7.37(m,4H),7.20–7.10(m,1H),4.12(dq,J=12.0,8.0Hz,1H),3.72–3.61(m,4H),3.12(s,2H),2.63–2.53(m,4H),2.17(s,3H),1.18(d,J=4.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.09(2C),158.19,155.41,155.13,139.50,137.40,131.83,130.70,130.63,128.79,123.85,122.37,122.13,121.74,121.58,117.96,105.25,66.76(2C),62.24,53.76(2C),41.58,22.55(2C),18.39;HRMS(ESI),C27H32ClN7O3,[M+H]+理论计算:538.2255,实测:538.2348。

(I-11)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.44(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.64(dd,J=16.0,8.0Hz,2H),8.22(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.48–7.11(m,4H),4.19–4.03(m,1H),3.78(s,3H),3.70–3.58(m,4H),3.11(s,2H),2.58–2.52(m,4H),1.18(d,J=4.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.11,167.62,158.16,155.41,155.05,148.91,139.59,137.04,131.75,128.81,122.36,121.97,121.87,121.67,119.56,111.86,105.49,103.73,66.96(2C),62.14,56.31,53.66(2C),41.59,22.55(2C);HRMS(ESI),C27H32ClN7O4,[M+H]+理论计算:554.2204,实测:554.2285。

(I-12)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.60(dd,J=24.0,8.0Hz,2H),8.26(s,1H),8.01(d,J=8.0Hz,2H),7.76(d,J=8.0Hz,1H),7.51(dd,J=12.0,4.0Hz,2H),7.17(m,1H),4.12(dd,J=12.0,8.0Hz,1H),3.73–3.64(m,4H),3.16(s,2H),2.57(s,4H),1.18(d,J=4.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.30,168.04,157.77,155.49,155.06,139.31,137.91,131.98,128.83,128.61,124.05,122.73,122.56,122.31,121.71,119.43,118.85,106.01,66.87(2C),62.01,53.64(2C),41.59,22.54(2C);HRMS(ESI),C26H29Cl2N7O3,[M+H]+理论计算:558.1709,实测:558.1799。

(I-13)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.74(dd,J=32.0,4.0Hz,2H),8.27(s,1H),8.01(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),7.16(s,1H),3.69–3.65(m,4H),3.16(s,2H),2.82(s,3H),2.57(d,J=4.0Hz,4H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.37,168.33,157.78,155.48,155.07,139.63,137.92,132.18,128.65,128.54,124.07,122.75,122.55,121.63,121.34,119.49,118.91,106.11,66.88(2C),62.02,53.65(2C),26.79;HRMS(ESI),C24H25Cl2N7O3,[M+H]+理论计算:530.1396,实测:530.1476。

(I-14)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.61(s,1H),9.43(s,1H),9.26(s,1H),8.77(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.67(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.53–7.32(m,4H),7.19–7.05(m,1H),3.67–3.61(m,4H),3.30(s,2H),3.12(s,2H),2.41–2.37(m,4H),2.27(s,3H);13CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.82,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,113.01,105.31,66.17(2C),62.25,52.77(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C26H27ClF3N7O3,[M+H]+理论计算:578.1816,实测:578.1889。

(I-15)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.57(s,1H),9.41(s,1H),9.23(s,1H),8.72(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.22(s,1H),7.65(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.51–7.33(m,4H),7.19–7.05(m,1H),3.67–3.61(m,4H),3.30(s,2H),3.12(s,2H),2.41–2.37(m,4H),2.27(s,3H);13CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ171.62,169.11,159.20,156.47,155.15,139.73,137.41,131.96,130.72,130.65,128.56,123.83,122.35,121.71,121.64,121.58,113.01,105.31,66.19(2C),62.25,52.75(2C),34.59,18.39,14.96;HRMS(ESI),C26H27ClF3N7O4,[M+H]+理论计算:594.1765,实测:594.1823。

(I-16)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.62(s,1H),9.42(s,1H),9.23(s,1H),8.77(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.64(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.53–7.32(m,4H),7.19–7.05(m,1H),3.67–3.61(m,4H),3.30(s,2H),3.12(s,2H),2.41–2.37(m,4H),2.27(s,3H);13CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.82,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,113.01,105.31,66.15(2C),62.25,52.75(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C25H24Cl2F3N7O3,[M+H]+理论计算:598.1270,实测:598.1289。

(I-17)N-[3-[[5-氯-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.53(s,1H),9.52(s,1H),9.42(s,1H),8.76(d,J=4.0Hz,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.72(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.43(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),7.28(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.12(t,J=8.0Hz,1H),3.71–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.93–2.85(m,1H),2.57–2.51(m,4H),0.73(td,J=8.0,4.0Hz,2H),0.66–0.57(m,2H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.33,167.61,158.14,155.40,148.90,139.67,137.02,131.95,128.82,122.31,121.87,121.65,121.18,119.56,111.87,105.55,103.73,66.95(2C),62.14,56.30,53.65(2C),23.58,6.19(2C);HRMS(ESI),C26H27Cl2N7O3,[M+H]+理论计算:556.1552,实测:556.1578。

(I-18)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.78(d,J=4.0Hz,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(d,J=8.0Hz,1H),7.45(t,J=8.0Hz,1H),7.38(s,1H),7.29(d,J=8.0Hz,1H),7.13(d,J=8.0Hz,1H),3.68–3.65(m,4H),3.12(s,2H),2.81(d,J=4.0Hz,3H),2.54(d,J=4.0Hz,4H),2.50(s,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.41,167.62,158.15,155.39,155.04,148.91,139.85,137.02,131.91,128.50,122.36,121.89,121.63,121.05,119.56,113.92,105.56,103.77,66.96(2C),62.14,56.30,53.65(2C),26.79;HRMS(ESI),C25H28FN7O3,[M+H]+理论计算:493.5333,实测:493.5427。

(I-19)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.54(s,1H),9.43(s,1H),8.82–8.74(m,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.45(t,J=8.0Hz,1H),7.38(s,1H),7.28(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.17–7.11(m,1H),3.69–3.63(m,4H),3.12(s,2H),2.81(d,J=4.0Hz,3H),2.55–2.52(m,3H),2.50(dt,J=4.0,2.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.43,167.65,158.17,155.42,155.07,148.93,139.87,137.04,131.94,128.52,122.38,121.91,121.65,121.07,119.58,119.52,111.92,103.79,66.96(2C),62.14,56.30,53.66(2C),26.79;HRMS(ESI),C25H28FN7O4,[M+H]+理论计算:509.5327,实测:509.5433。

(I-20)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.49(s,1H),9.42(s,1H),9.28(s,1H),8.73(d,J=4.0Hz,2H),8.22(s,1H),7.72(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.57–7.37(m,4H),7.16–7.06(m,1H),3.71–3.55(m,4H),3.12(s,2H),2.93–2.84(m,1H),2.61–2.52(m,4H),2.17(s,3H),0.77–0.66(m,2H),0.61(dd,J=8.0,4.0Hz,2H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.31,168.11,158.20,155.42,155.17,139.61,137.40,132.06,130.72,130.66,128.81,123.86,122.32,121.72,121.62,121.32,118.00,105.32,66.77(2C),62.24,53.77(2C),23.58,18.39,6.20(2C);HRMS(ESI),C27H30FN7O3,[M+H]+理论计算:519.5706,实测:579.5811。

(I-21)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.53(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.76(d,J=4.0Hz,2H),8.23(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.72(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.43(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),7.28(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.12(t,J=8.0Hz,1H),3.77(s,3H),3.71–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.93–2.85(m,1H),2.57–2.51(m,4H),0.73(td,J=8.0,4.0Hz,2H),0.66–0.57(m,2H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.33,167.61,158.14,155.40,155.06,148.90,139.67,137.02,131.95,128.82,122.31,121.87,121.65,121.18,119.56,111.87,105.55,103.73,66.95(2C),62.14,56.30,53.65(2C),23.58,6.19(2C);HRMS(ESI),C27H30FN7O4,[M+H]+理论计算:535.5700,实测:535.5716。

(I-22)N-[3-[[5-氟-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),9.64(s,1H),9.42(s,1H),8.76(dd,J=12.0,8.0Hz,2H),8.20(s,1H),7.76(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.63–7.44(m,5H),7.23–7.09(m,1H),3.69–3.60(m,4H),3.30(dt,J=12.0,8.0Hz,2H),3.11(s,2H),2.56–2.50(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.72,168.07,158.22,155.43,155.10,139.72,136.35,133.36,131.80,128.55,122.39,121.91,121.58,120.41,120.33(2C),105.29,66.56(2C),62.53,53.69(2C),34.59,14.97(2C);HRMS(ESI),C25H28FN7O3,[M+H]+理论计算:493.5333,实测:493.5418。

(I-23)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.53(s,1H),9.42(s,1H),9.28(s,1H),8.76(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.21(s,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.57–7.34(m,4H),7.21–7.07(m,1H),3.70–3.61(m,4H),3.30(dt,J=12.0,8.0Hz,2H),3.12(s,2H),2.59–2.52(m,4H),2.17(s,3H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.74,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,118.01,105.31,66.77(2C),62.25,53.77(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C26H30FN7O3,[M+H]+理论计算:507.5599,实测:507.4012。

(I-24)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.57(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.78(dd,J=20.0,8.0Hz,2H),8.22(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.50–7.05(m,4H),3.78(s,3H),3.71–3.61(m,4H),3.31(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),3.12(s,2H),2.54(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.75,167.62,158.15,155.40,155.04,148.91,139.78,137.03,131.85,128.59,122.36,121.88,121.64,121.44,119.56,111.89,103.75,66.96(2C),62.14,56.30,53.65(2C),34.59,14.97(2C);HRMS(ESI),C26H30FN7O4,[M+H]+理论计算:523.5593,实测:523.6541。

(I-25)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.56(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.74(dd,J=24.0,8.0Hz,2H),8.26(s,1H),8.01(d,J=8.0Hz,2H),7.77(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.58–7.46(m,2H),7.17(t,J=8.0Hz,1H),3.72–3.64(m,4H),3.30(dt,J=12.0,8.0Hz,2H),3.16(s,2H),2.57(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.69,168.30,157.77,155.47,155.06,139.53,137.91,132.09,128.62,124.05,122.73,122.54,121.74,121.65,119.46,118.88,106.06,66.87(2C),62.01,53.64(2C),34.59,14.96(2C);HRMS(ESI),C25H27ClFN7O3,[M+H]+理论计算:527.9784,实测:527.9803。

(I-26)N-[3-[[5-氟-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.37(s,1H),9.64(s,1H),9.42(s,1H),8.62(dd,J=24.0,8.0Hz,2H),8.20(s,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.59–7.45(m,5H),7.15(t,J=8.0Hz,1H),4.12(dq,J=12.0,8.0Hz,1H),3.67–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.55–2.51(m,4H),1.17(d,J=8.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.07(2C),158.22,155.45,155.10,139.51,136.36,133.34,131.68,128.76,122.40,122.15,121.97,120.33(2C),105.23,66.56(2C),62.53,53.69(3C),41.59,22.55(3C);HRMS(ESI),C26H30FN7O3,[M+H]+理论计算:507.5599,实测:507.6028。

(I-27)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.39(s,1H),9.42(s,1H),9.28(s,1H),8.62(dd,J=16.0,8.0Hz,2H),8.21(s,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.60–7.37(m,4H),7.20–7.10(m,1H),4.12(dq,J=12.0,8.0Hz,1H),3.72–3.61(m,4H),3.12(s,2H),2.63–2.53(m,4H),2.17(s,3H),1.18(d,J=4.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.09(2C),158.19,155.41,155.13,139.50,137.40,131.83,130.70,130.63,128.79,123.85,122.37,122.13,121.74,121.58,117.96,105.25,66.76(2C),62.24,53.76(2C),41.58,22.55(2C),18.39;HRMS(ESI),C27H32FN7O3,[M+H]+理论计算:521.5865,实测:521.6232。

(I-28)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.44(s,1H),9.54(s,1H),9.42(s,1H),8.64(dd,J=16.0,8.0Hz,2H),8.22(s,1H),8.03(d,J=8.0Hz,1H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.48–7.11(m,4H),4.19–4.03(m,1H),3.78(s,3H),3.70–3.58(m,4H),3.11(s,2H),2.58–2.52(m,4H),1.18(d,J=4.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.11,167.62,158.16,155.41,155.05,148.91,139.59,137.04,131.75,128.81,122.36,121.97,121.87,121.67,119.56,111.86,105.49,103.73,66.96(2C),62.14,56.31,53.66(2C),41.59,22.55(2C);HRMS(ESI),C27H32FN7O4,[M+H]+理论计算:537.5859,实测:537.6035。

(I-29)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-异丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.60(dd,J=24.0,8.0Hz,2H),8.26(s,1H),8.01(d,J=8.0Hz,2H),7.76(d,J=8.0Hz,1H),7.51(dd,J=12.0,4.0Hz,2H),7.17(m,1H),4.12(dd,J=12.0,8.0Hz,1H),3.73–3.64(m,4H),3.16(s,2H),2.57(s,4H),1.18(d,J=4.0Hz,6H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.30,168.04,157.77,155.49,155.06,139.31,137.91,131.98,128.83,128.61,124.05,122.73,122.56,122.31,121.71,119.43,118.85,106.01,66.87(2C),62.01,53.64(2C),41.59,22.54(2C);HRMS(ESI),C26H29ClFN7O3,[M+H]+理论计算:542.0500,实测:542.0507。

(I-30)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-环丙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.74(dd,J=32.0,4.0Hz,2H),8.27(s,1H),8.01(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),7.16(s,1H),3.69–3.65(m,4H),3.16(s,2H),2.82(s,3H),2.57(d,J=4.0Hz,4H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.37,168.33,157.78,155.48,155.07,139.63,137.92,132.18,128.65,128.54,124.07,122.75,122.55,121.63,121.34,119.49,118.91,106.11,66.88(2C),62.02,53.65(2C),26.79;HRMS(ESI),C24H25ClFN7O3,[M+H]+理论计算:513.9518,实测:513.8745。

(I-31)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.61(s,1H),9.43(s,1H),9.26(s,1H),8.77(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.67(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.53–7.32(m,4H),7.19–7.05(m,1H),3.67–3.61(m,4H),3.30(s,2H),3.12(s,2H),2.41–2.37(m,4H),2.27(s,3H);13CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.82,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,113.01,105.31,66.17(2C),62.25,52.77(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C26H27F4N7O3,[M+H]+理论计算:561.5313,实测:561.5423。

(I-32)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)甲氧基]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.61(s,1H),9.43(s,1H),9.26(s,1H),8.77(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.67(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.53–7.32(m,4H),7.19–7.05(m,1H),3.67–3.61(m,4H),3.30(s,2H),3.12(s,2H),2.41–2.37(m,4H),2.27(s,3H);13CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.82,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,113.01,105.31,66.17(2C),62.25,52.77(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C26H27F4N7O4,[M+H]+理论计算:577.5307,实测:577.6234。

(I-33)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-三氟乙酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.61(s,1H),9.43(s,1H),9.26(s,1H),8.77(dd,J=32.0,8.0Hz,2H),8.25(s,1H),7.67(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.53–7.32(m,4H),7.19–7.05(m,1H),3.67–3.61(m,4H),3.30(s,2H),3.12(s,2H),2.41–2.37(m,4H),2.27(s,3H);13CNMR(400MHz,DMSO-d6)δ170.82,168.11,158.20,155.41,155.15,139.72,137.41,131.96,130.71,130.67,128.58,123.86,122.37,121.70,121.64,121.58,113.01,105.31,66.17(2C),62.25,52.77(2C),34.59,18.39,14.97;HRMS(ESI),C25H24ClF4N7O3,[M+H]+理论计算:581.9498,实测:582.0236。

(I-34)N-[3-[[5-氟-2-[4-[3-((1-吗啡啉)乙酰胺基)氯]苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.65(s,1H),9.72(s,1H),9.65(s,1H),8.74(dd,J=32.0,4.0Hz,2H),8.27(s,1H),8.01(dd,J=8.0,4.0Hz,2H),7.76(dd,J=8.0,2.0Hz,1H),7.51(d,J=8.0Hz,2H),7.16(s,1H),3.69–3.65(m,4H),3.16(s,2H),2.82(s,3H),2.57(d,J=4.0Hz,4H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.37,168.33,157.78,155.48,155.07,139.63,137.92,132.18,128.65,128.54,124.07,122.75,122.55,121.63,121.34,119.49,118.91,106.11,66.88(2C),62.02,53.65(2C),26.79;HRMS(ESI),C24H25ClFN7O3,[M+H]+理论计算:513.9518,实测:513.9478。

(I-35)N-[3-[[5-氟-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.54(s,1H),9.64(s,1H),9.43(s,1H),8.75(dd,J=12.0,8.0Hz,2H),8.19(s,1H),7.76(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.61–7.44(m,5H),7.23–7.09(m,1H),3.69–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.56–2.50(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ169.72,168.07,159.22,155.43,154.10,139.72,137.35,133.36,131.80,128.55,122.39,121.91,120.41,120.31(2C),105.29,66.57(2C),62.53,53.70(2C),34.59,14.97(2C);HRMS(ESI),C24H26FN7O3,[M+H]+理论计算:479.5067,实测:479.5235。

(I-36)N-[3-[[5-氯-2-[4-((1-吗啡啉)乙酰胺基)苯胺]-4-嘧啶]氨基]苯基]-2-甲酰胺

1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.52(s,1H),9.64(s,1H),9.42(s,1H),8.76(dd,J=12.0,8.0Hz,2H),8.20(s,1H),7.76(dd,J=8.0,4.0Hz,1H),7.63–7.44(m,5H),7.23–7.09(m,1H),3.69–3.60(m,4H),3.11(s,2H),2.56–2.50(m,4H),1.14(t,J=8.0Hz,3H);13C NMR(400MHz,DMSO-d6)δ168.72,168.07,158.22,155.43,155.10,139.72,136.35,133.36,131.80,128.55,122.39,121.91,120.41,120.33(2C),105.29,66.56(2C),62.53,53.69(2C),34.59,14.97(2C);HRMS(ESI),C24H26ClN7O3,[M+H]+理论计算:495.9613,实测:495.9728。

目标分子成盐的方法

无机酸盐的制备方法:取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中,冰浴下,慢慢滴加无机酸(1mmol)的5mL无水甲醇溶液,滴加完毕,于此温度下搅拌30分钟,然后常温蒸除甲醇,即得目标分子的无机酸盐。

有机酸盐的制备方法:取目标分子(1mmol)溶于10mL无水甲醇中,冰浴下,慢慢滴加有机酸(1mmol)的5mL干燥乙醚,滴加完毕,于此温度下搅拌30分钟,然后常温蒸除溶剂,即得目标分子的有机酸盐。

两个目标分子混合物的制备

取等摩尔量(1mmol)的上述两个目标分子于无水甲醇中(5mL),室温搅拌10分钟,常温蒸除溶剂,即得目标分子的混合物。

实施例2目标分子生物活性评价

1、体外对受体酪氨酸激酶抑制活性测试方法

(1)制备激酶检测缓冲液

①在室温融解激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer),观察是否有沉淀。

②如果出现沉淀,就在37℃孵育(Kinase Detection Buffer)15分钟并经常摇动,溶解沉淀。或者,小心吸走上清,去除沉淀。

(2)制备激酶检测试剂

①使用前在室温平衡激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffe)和激酶检测底物(Kinase Detection Substrate)。

②将激酶检测缓冲液(Kinase Detection Buffer)全部倒进装有激酶检测底物(Kinase Detection Substrate)的棕色瓶中,使冻干粉底物溶解,这样就制成了激酶检测试剂。

③轻轻震荡、涡旋或颠倒混匀,成为均质溶液,底物应在1分钟内溶解。

④激酶检测试剂配好后应立即使用,或分装存于-20℃,我们认为配好的试剂经过几次冻融后循环信号活性都没有损失。

(3)制作ATP转化成ADP的标准曲线

①用1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer)稀释试剂盒提供的Ultra Pure ATP和ADP,制成900μL 50μM ATP和500μL 50μM ADP。

②将上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示在384孔板A1-A12中混合,模拟每个转化百分比的ATP和ADP的浓度,混合好。

表1.制备50μM系列ATP+ADP标准品

③每孔加入5μL的ADP-GloTM试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。

④每孔加入10μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)将ADP转化成ATP,并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。

⑤在室温孵育30-60分钟,用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥绘制ATP转化成ADP的标准曲线。

(4)确定激酶抑制物的IC50

①按照promega试剂盒说明书配制1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer),2.5×50ng/μL激酶和2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在无酶对照孔中加入3μL 1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer),2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在阴性对照孔中加入1μL 1×激酶反应缓冲液(kinase reaction buffer),2μL 2.5×50ng/μL激酶,2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。在测试孔中加入1μL 5×待测药物,2μL 2.5×50ng/μL激酶,2μL 2.5×0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好平板,孵育60分钟。

④每孔加入5μL的ADP-GloTM试剂来终止激酶反应。在室温孵育40分钟。

⑤每孔加入10μL激酶检测试剂(Kinase Detection Reagent)将ADP转化成ATP,并引进萤光素酶和萤光素来检测ATP。在室温孵育30-60分钟,用多功能酶标仪测量萤光并记录萤光值。

⑥结果分析,结果如表2所示。

2、抑制BTK高表达细胞生长实验(CCK-8检测法)

(1)细胞类型及选择:Aspc-1细胞、Bxpc-3细胞和Panc-1细胞(人胰腺癌细胞,FAK激酶高表达);H1975(人非小细胞肺癌细胞,FAK激酶高表达);Mcf-7/adr(人乳腺癌细胞耐药株,FAK激酶高表达)。

(2)细胞接种:收集对数生长期细胞,调整细胞悬液浓度,以每孔4×103个细胞,每孔体积100μL接种到96孔板,每组设3个复孔(边缘孔用无菌PBS填充);

(3)细胞培养:细胞接种后,对照组用10%FBS RPMI-1640培养,实验组分别用10μL不同浓度梯度的Tae226(1.25-40μmol/L)、各不同药物(1.25-40μmol/L)干预,37℃,5%CO2培养箱中继续培养(按实验要求分别培养不同时间);

(4)呈色:两组细胞分别于培养48h后加入10μL CCK-8溶液(5mg/ml),4h后终止培养,于摇床上低速振荡10min,使结晶充分溶解;

(5)比色:在酶联免疫检测仪上测定各孔光度值(OD值),选择450nm波长,以无细胞的即RPMl-1640培养液空白孔调零,测各孔的吸光度值。实验重复三次;

(6)记录结果:细胞生长抑制率=(对照组吸光度值一实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100%,细胞增殖率=(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100;

(7)绘制细胞生长曲线:以时间为横坐标,抑制率/增殖率为纵坐标绘制细胞生长曲线。在GraphPad软件中的GraphPad Prism作图软件中针对抑制剂浓度做图,以便由log[抑制剂]相对于反应,可变斜率模型估算出IC50

测试结果如表2所示,表2显示所获得的化合物在抑制FAK激酶和抗肿瘤细胞增殖中的活性效果。

表2.化合物抑制激酶活性与抗细胞增殖活性

a:IC50:半数有效抑制浓度.b:Aspc-1,Bxpc-3,Panc-1为典型胰腺癌细胞,FAK激酶高度表达;H1975为人肺腺癌细胞;Mcf-7/adr为人乳腺癌细胞(耐阿霉素)。

同时,本实验发现化合物I-1的Aspc-1,Panc-1细胞活性与时间和浓度有着很大的关系,如图1所示,随着浓度的增大,细胞存活率减小,尤其72h后的Aspc-1,Panc-1细胞在药物浓度达8μmol/L时,几乎不能存活,明显高于48h,由此可证明本药物属于浓度和时间依赖性药物。且其抑制效果明显优于参照药物Tae226。

3、细胞凋亡和细胞周期(流式细胞术)

(1)实验材料和试剂

Aspc-1细胞,RAPIDMEM基础培养基(Hyclone公司,cat:SH30022.01B),FBS胎牛血清(GIBCO公司,cat:16400-044),双抗(北京夏斯生物科技有限公司,prospec cat:SV30010),低速离心机(上海贝恩生物科技有限公司,cat:TDZ4B-WS),CO2培养箱(上海博讯,cat:BC-J160S),超净工作台(上海博讯型号SW-CJ-2FD),倒置荧光电子显微镜(Leica DMI3000B)。

(2)实验方法

①扩大培养Aspc-1细胞;

②药物处理:用不同浓度药物处理细胞48小时。

③药物处理后细胞用不含EDTA的胰酶消化收集,PBS洗涤细胞两次,收集细胞1~5×105细胞;

④加入500uL的AnnexinV Binding Buffer悬浮细胞;

⑤加入5uL AnnexinV-FITC混匀后,加入5uLPropidium Iodide(周期检测只加5ul Propidium Iodide),混匀;

⑥避光、室温反应10min;

⑦用流式细胞仪检测(Ex=488nm;Em=530nm)细胞凋亡和周期的情况。

测试结果如下图2.1及图2.2所示,下图2.1及图2.2显示所获得的化合物I-1在不同浓度下引起Aspc-1细胞凋亡的结果。

4、体内动物实验(裸鼠实验)

(1)实验材料和试剂

Aspc-1细胞,RAPIDMEM基础培养基(Hyclone公司,cat:SH30022.01B),FBS胎牛血清(GIBCO公司,cat:16400-044),双抗(北京夏斯生物科技有限公司,prospec cat:SV30010),低速离心机(上海贝恩生物科技有限公司,cat:TDZ4B-WS),CO2培养箱(上海博讯,cat:BC-J160S),超净工作台(上海博讯型号SW-CJ-2FD)1ml注射器,灌胃针,STOCK-Foxn1nu/Nju裸小鼠(南京大学模式动物研究所,合格证号:SCXK:2015-0001)

(2)实验方法

①细胞培养:扩大培养对数生长期的Aspc-1细胞,胰酶消化后1000rpm/min离心收集细胞,用冷的PBS洗两次,最后用PBS制成3×107个/ml的细胞悬液;

②接种:5-6周龄的STOCK-Foxn1nu/Nju裸小鼠从南京大学模式动物研究所获得(合格证号:SCXK:2015-0001),动物实验严格按照中华人民共和国对于实验动物使用和保养得规定进行。Aspc-1细胞悬液悬浮在0.1ml PBS中,皮下注射到小鼠腋下区域;

③分组:接种后第五天,成瘤率98%,小鼠被随机分为3组(n=5)空白组、两个I-1处理组。I-1处理组用30、60mg/kg两个剂量处理;

④给药:当肿瘤体积达到300mm3左右时,连续灌胃给药11天,一天一次,每两天测量一次肿瘤体积,并用下式计算:V=A×B2/2,其中A和B分别表示最大和最小直径。肿瘤抑制率用下式计算;(空白组的肿瘤体积-治疗组的肿瘤体积)/空白组的肿瘤体积×100%。

⑤实验结束后,处死小鼠,解剖实体瘤,并进行称重测量。

实验结果如图3,图4所示:

以上生物活性结果表明,本发明中I-1的体内外作用效果显著,主要表现在以下几个方面:(1)I-1对FAK激酶有强烈抑制作用,IC50仅仅为1.03nM,明显优于参比化合物Tae226(6.79nM)。(2)抗细胞增殖活性结果揭示,对Aspc-1、Bxpc-3和Panc-1细胞的IC50分别为0.909μM、0.761μM和1.218μM,明显优于参比化合物Tae226(6.73μM、12.33μM、>20.00μM),对H1975和Mcf-7/adr的IC50分别为0.333μM和0.892μM,均优于参比化合物Tae226。(3)流式分析结果显示I-1能使Aspc-1细胞的凋亡率明显增加(90.4%)并将细胞周期阻滞在G0/G1期,呈剂量依赖性。(4)裸鼠皮下移植瘤实验验证I-1的体内抗肿瘤活性,结果表明I-1能抑制Aspc-1细胞在体内的生长,给予30、60mg/kg/day剂量的肿瘤抑制率(TGI)分别为,44.38%和28.58%。证明I-1能抑制肿瘤细胞生长,且呈现剂量依赖性。预示此类分子有极大可能开发成新型高效FAK抑制剂的潜力,对治疗相关的肿瘤疾病尤其是胰腺癌有较大的应用价值。

以上所述仅是本发明的优先实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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