一种阿糖胞苷两亲性小分子前药及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种阿糖胞苷两亲性小分子前药及其制备方法和应用，还涉及阿糖胞苷两亲性小分子前药口服制剂的制备与评价。

背景技术：

白血病是一类起源于造血(或淋巴)干细胞的恶性疾病。阿糖胞苷(cytarabine,ara-c)作为急性粒细胞白血病的主要治疗药物，临床应用已有超过四十年的历史。作为一种嘧啶类抗代谢药，阿糖胞苷可在体内经磷酸激酶活化转变成三磷酸阿糖胞苷(ara-ctp)，插入到肿瘤细胞dna中，同时对dna多聚酶有强大的抑制作用，阻断dna的合成；并抑制核苷酸还原酶阻止胞嘧啶核苷酸还原为脱氧胞嘧啶核苷酸，影响dna的复制导致细胞死亡，由于对细胞s增殖期有特异性抑制作用，与其他抗肿瘤药物联用对实体瘤也有良好的治疗效果。但阿糖胞苷由于分子结构中的五元糖环，导致其分子极性大，透膜性差，体内生物利用度低；同时嘧啶环上的4位nh2极易被胃肠道及肝中的脱氨酶代谢失活，口服吸收少，故临床上无口服制剂。阿糖胞苷静脉注射后迅速转化为无活性的阿糖尿嘧啶，半衰期仅为3-15min，为达到有效治疗浓度，临床上用药时多采取静脉滴注、多次静脉注射或皮下注射等治疗手段，但这样易产生耐药性，且病人顺应性差。

不同研究者利用阿糖胞苷分子结构中的氨基和羟基进行酰化、醚化等化学修饰并合成了一些新的阿糖胞苷衍生物，从而改善其药物活性及化学稳定性，较大地提高了阿糖胞苷的生物利用度。目前阿糖胞苷衍生物的合成研究主要是对阿糖胞苷的胞嘧啶环上的4位氨基和阿拉伯糖上的5’位伯羟基进行酰化修饰，包括n-酰化生成酰胺和o-酰化生成酯，从而导入脂肪族或芳香族酰基基团，获得的阿糖胞苷衍生物可以改善其药物活性及化学稳定性，较大地提高阿糖胞苷的生物利用度。

近年来两亲性小分子前药逐渐成为人们研究热点，根据药物分子结构、水溶性、药物代谢方面所存在的缺陷，将药物与极性不同的小分子材料共价键合形成两亲性的前药分子，改善药物的应用，其优势明显，主要体现在以下几个方面：(1)前药分子具有适宜的脂溶性和膜透过性，有利于在体内转运，提高体内生物利用度；(2)内在的两亲性可使前药分子在水中自组装成纳米聚集结构，实现药物的自递送；(3)药物分子本身参与载体形成，极大提高载药量的同时还可减少惰性材料的使用而产生的毒副作用；(4)化学键连接与聚集结构的形成使药物缓释作用更加明显。

发明人前期也对阿糖胞苷两亲性小分子前药进行了研究，短链前药(正己酸-阿糖胞苷，ha-ara)可形成纳米粒，但是其用于静脉注射给药时缓释效果不明显；长链前药(油酸-阿糖胞苷，oa-ara；月桂酸-阿糖胞苷，la-ara)可形成纳米螺旋或纳米纤维结构，适用于口服给药。但发明人发现目前研究前药口服给药剂型制备过程繁琐，生产成本高。例如oa-ara需要在长时间(60min)探头超声作用下才能形成纳米螺旋结构，并且需要牛血清白蛋白(bsa)作为稳定剂，处方复杂；而la-ara在水中沉淀离心后需要在超声条件下多次水洗再分散成纳米混悬液后才可应用形成口服制剂；此外，oa-ara和la-ara两种前药分子形成的纳米口服混悬液浓度较低(最高达1mg/ml)，不利于临床应用的推广。

技术实现要素：

结合发明人前期研究和上述问题，本发明选择针对阿糖胞苷两亲性小分子前药以及前药口服制剂进行研究，尤其是两亲性小分子结构特性以及阿糖胞苷两亲性小分子前药作为整体的口服制剂制备特性进行研究，最终形成了本发明。

本发明的目的之一在于合成一种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药(pa-ara)，在增强缓释效果、提高生物利用度的同时，克服前期研究(阿糖胞苷两亲性小分子前药)技术的不足，获得便于简单快速制备出前药口服制剂的前药分子。

为实现该目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种新型阿糖胞苷两亲性小分子前药(pa-ara)，其结构式如下所示：

其次，本发明公开了上述阿糖胞苷两亲性小分子前药(pa-ara)的制备方法，其制备方法为：

阿糖胞苷与棕榈酸催化反应，棕榈酸与阿糖胞苷以酰胺键结合，实现对阿糖胞苷4位氨基的化学修饰。

所述催化反应可以为酶促催化或化学催化。

优选的，所述催化反应为化学催化。

优选的，阿糖胞苷与棕榈酸催化反应过程为：棕榈酸，在加入三乙胺和氯甲酸乙酯条件下，与阿糖胞苷反应，生成上述阿糖胞苷两亲性小分子前药(pa-ara)。

具体的反应步骤包括：(1)一定量的棕榈酸溶于无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中，加入三乙胺和氯甲酸乙酯，惰性气体保护、冰浴条件下反应；

(2)将一定量阿糖胞苷溶于无水dmf中，加入步骤(1)所述反应溶液中，制备获得上述阿糖胞苷两亲性小分子前药(pa-ara)。

所述棕榈酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩尔比为8-12:10-12:10-12:10-15；优选为棕榈酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷摩尔比为10:11:11:12。

优选的实施方案中，在步骤(2)之后还包括阿糖胞苷两亲性小分子前药纯化的步骤(3)。

具体的，纯化的步骤(3)为：减压旋蒸除去反应溶剂无水dmf，真空干燥，得到粗产物；将粗产物溶于乙酸乙酯中，硅胶柱色谱提纯，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱(100:1-30:1)，得到pa-ara纯品为白色固体。

本发明的目的之二在于提供一种阿糖胞苷两亲性小分子前药pa-ara口服制剂及其制备方法。该口服制剂可通过简单快速的方法制备获得，并且稳定性良好，易于保存，同时具备更优异的体内口服效果。

为实现该目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明公开了一种阿糖胞苷两亲性小分子前药pa-ara口服制剂的制备方法，包括：将pa-ara前药溶于甲醇中，搅拌条件下倒入水中，利用前药分子两亲性自发形成pa-ara前药纳米聚集体(混悬液)；将形成的混悬液离心，弃去上清，干燥得到白色块状纳米聚集体口服制剂。

优选的实施方案中，甲醇：水的体积比为1:50-200；更优选的，甲醇：水的体积比为1:100。

优选的实施方案中，本发明口服制剂可形成口服混悬液浓度可达5-10mg/ml。

优选的实施方案中，干燥方式包括但不限于真空干燥。

其次，上述制备方法得到的阿糖胞苷两亲性小分子前药pa-ara口服制剂也是本发明的保护范围。

本发明的目的之三在于提供上述阿糖胞苷两亲性小分子前药pa-ara及其口服制剂的用途。具体的，该目的涉及的技术方案包括：

上述阿糖胞苷两亲性小分子前药pa-ara及其口服制剂在制备抗癌抗肿瘤药物中的用途，阿糖胞苷两亲性小分子前药pa-ara可以用于治疗或缓解某一组织或器官的癌症，癌症包括但不限于白血病、固体瘤、肺癌、结肠癌、肝癌、中枢神经系统肿瘤、卵巢癌、肾癌等。

所述抗肿瘤应用包括了pa-ara及其口服制剂在抗肿瘤化疗的用途以及pa-ara及其口服制剂与其他化疗药物联合在抗肿瘤化疗中的用途。可以联合应用的抗肿瘤药物包括但不限于烷化剂、植物生物碱类、抗菌抗肿瘤磺酰胺类药物、铂类药物、抗代谢类或其他的抗癌药物。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明首次合成ara-c两亲性前药分子pa-ara，前药分子不仅解决了ara-c极性大，膜透过性差，在体内易被代谢失活等缺点，还可在水中自组装形成结构均一的纳米螺旋聚集体。

(2)本发明可以通过简便快速的方法将pa-ara制备成纳米聚集体口服制剂，不仅经济实用，还可批量生产，口服制剂更易于保存与运输，为工业生产提供可能。

(3)pa-ara纳米聚集体口服制剂毒性低，安全性好，服用方便，口服生物利用度良好，生物利用度能达到静脉注射组的57％，为实现阿糖胞苷口服给药提供可能。

附图说明

图1pa-ara前药的核磁图谱

图2pa-ara聚集体形态tem图

图3pa-ara聚集体口服后血药浓度曲线，ara-civ静脉注射阿糖胞苷生理盐水溶液(检测阿糖胞苷)，pa-arapo(ara-c)灌胃给药pa-ara纳米聚集体(检测ara-c)，pa-arapo(pa-ara)灌胃给药pa-ara纳米聚集体(检测pa-ara)

具体实施方式

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1pa-ara前药分子合成

分析天平精密称取一定量的棕榈酸，溶于无水n，n-二甲基甲酰胺(dmf)并置于双颈瓶中，搅拌条件下加入三乙胺和氯甲酸乙酯，氮气保护、冰浴条件下反应20min。称取一定量阿糖胞苷溶于5ml温热的无水dmf中，搅拌条件下缓慢滴入上述反应溶液，其中摩尔量为棕榈酸：三乙胺：氯甲酸乙酯：阿糖胞苷＝10:11:11:12，反应恢复至室温并在氮气保护条件下继续反应72h，利用薄层板监测反应进程。反应结束后，减压旋蒸除去无水dmf，真空干燥过夜，得到粗产物。将粗产物溶于乙酸乙酯中，少许柱层层析硅胶拌样，硅胶柱色谱提纯，二氯甲烷和甲醇梯度洗脱(100:1-30:1)，得到pa-ara纯品为白色固体，产率为64.3％。

实施例2核磁共振氢谱(¹h-nmr)鉴定pa-ara前药化学结构

称取pa-ara前药约5mg，氘代二甲亚砜(dmso-d6)溶解并置于核磁管内，采用400mhz核磁共振氢谱测定其核磁共振氢谱图，以四甲基硅烷为内标物，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1所示，核磁结果可以证实，新合成的分子中阿糖胞苷和棕榈酸的摩尔比值接近1:1，同时酰胺键上h的特征峰的出现，证明酰胺键的合成。通过¹h-nmr谱图可以证实pa-ara前药的成功合成。

实施例3pa-ara前药口服制剂制备

精密称取pa-ara前药分子约20mg，溶于0.1ml甲醇中，搅拌条件下倒入100倍体积的水中，纳米聚集体自发形成，将混悬液离心，弃去上清，真空干燥得到白色块状纳米聚集体口服制剂。

本发明的纳米聚集体口服制剂经测算和实验，其形成口服混悬液浓度可达10mg/ml，高于发明人前期研究的oa-ara和la-ara两种前药分子形成的纳米口服制剂混悬液浓度。

实施例4pa-ara纳米聚集体形态观察

取少量干燥后的纳米聚集体于1.5mlep管中，加200μl蒸馏水混悬。吸取20μl纳米聚集体混悬液滴于碳膜铜网上，滤纸吸去多余液体，红外灯照射下干燥后置于透射电镜下观察pa-ara纳米聚集体形态。电镜照片如图2，结果显示pa-ara可在水中聚集成长度约为1μm的纳米螺旋聚集体结构，形态均匀，分散性良好，聚集体尺度适用于口服。相较于前期的oa-ara纳米螺旋聚集体，pa-ara螺旋聚集体制备过程中不需要探头超声及稳定剂的辅助，制备过程更为简单快捷。

实施例5pa-ara纳米聚集体口服体内药动学研究

取健康wistar大鼠12只，体重约为(200±5)g，随机分为3组，每组4只。给药前禁食12h，自由饮水。其中a组尾静脉注射阿糖胞苷生理盐水溶液(10mg/kg)，b组灌胃给药阿糖胞苷生理盐水溶液(10mg/kg)，c组灌胃给药pa-ara纳米聚集体(含阿糖胞苷10mg/kg)。三组实验动物分别于给药后0.25h，0.5h，1h，1.5h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，36h，48h，60h，72h于颈静脉窦取血0.5ml。将血样置于肝素钠(10％wt)润洗后的离心管中，4000r·min^-1离心15min，吸取上层血浆，于-20℃保存待测。

采用液质联用(hplc-ms/ms,agilent1260lc)测定血样中阿糖胞苷和pa-ara的浓度。

血浆样品的处理办法：向200μl血浆样品中加入200μl内标溶液(阿昔洛韦，800ng/ml)，再加入400μl乙腈进行沉淀蛋白，涡旋1min，11000rpm离心5min，取上清5μl进行lc/ms/ms分析。

大鼠血浆中ara-c和pa-ara分析方法的建立：

1.色谱条件

色谱柱：thermoc18(150×4.6mm)，5μm粒径；预柱：c18保护柱(4×3.0mm)。流动相a(水，0.2％甲酸)；流动相b(甲醇)。

流动相梯度洗脱条件：0-2min(30％b)，2-4min(30％b→90％b)，4-10min(90％b)，10-12min(85％b)。流速：0.6ml/min，进样量5μl，柱温：25℃。

2.质谱条件

离子源：电喷雾离子源(esi)；喷雾电压(is)：5500v；温度(tem)：650℃；扫描方式：多反应监测(mrm)，正离子扫描；雾化气(gas1):60psi；辅助气：(gas2)：60psi；喷撞气(cad)：6psi；气帘气(cur)：15psi。定量分析离子对：ara-c：m/z244→112，阿昔洛韦(内标)：m/z226→152，pa-ara：m/z481→349。

大鼠体内药代动力学实验结果如图3和表1所示，结果表明，pa-ara聚集体口服制剂进入体内后，可有效转化成阿糖胞苷原料药，且与静脉注射组相同给药剂量时，药物缓释效果更加明显，血浆半衰期延长，生物利用度能达到静脉注射组的57％。

一般情况下，口服制剂毒性小，安全性好，给药剂量可适当提高；而静脉注射组由于给药剂量过大，导致实验动物在给药8h后全部死亡，体现其高剂量下药物毒性大，安全性差等缺点。由此，我们得出结论，pa-ara聚集体口服制剂可在体内缓慢释放阿糖胞苷原料药，延长药物消除半衰期，口服生物利用度良好，且毒性小，安全性更好。

表1pa-ara聚集体口服后药动参数

本发明首次合成ara-c两亲性前药分子pa-ara，前药分子不仅解决了ara-c极性大，膜透过性差，在体内易被代谢失活等缺点，还可在水中自组装形成结构均一的纳米螺旋聚集体。通过简便快速的方法将pa-ara制备成纳米聚集体固体口服制剂，不仅经济实用，还可批量生产，固体制剂更易于保存与运输，为工业生产提供可能。pa-ara聚集体口服制剂毒性低，安全性好，服用方便，口服生物利用度良好，为实现ara-c口服给药提供可能。