一种高分子蒙脱石载菌凝胶球的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高分子水凝胶球的制备方法，属于生物化工和环保功能材料领域。
【背景技术】
[0002]固定化细胞的应用极其广泛，目前该技术己经普遍应用于工业、医疗诊断、化学分析、环境保护、能源开发与相关理论研究等多个领域。一个理想的固定化微生物材料要基本具备以下条件:(I)密集微生物，维持反应器中的生物量浓度；(2)载体具有较高的机械强度，传质阻力小；(3)载体可再生，并可重复使用；(4)载体价格低廉，固定化方法费用低；
(5)载体与微生物的固定结合强度高，能耐水力波动的冲击；(6)载体对微生物无毒，能抗微生物分解。
[0003]常用的固定化材料包括无机载体、有机高分子载体、复合载体等多种类型。无机载体具有机械强度大、对微生物无毒性、不易被微生物分解、耐酸碱、成本低、寿命长等特性。蒙脱石属于天然无机载体，为蒙皂石族单斜晶系，TOT型，其单位晶胞是由两层S1-O四面体夹一层Al-O八面体构成，晶格置换、破键、八面体片层解离等因素都会导致蒙脱石具有电负性，使蒙脱石易于吸附带正电荷的有机阳离子。此外，蒙脱石还具有较大的比表面积、优良的吸附特性、良好的纳米空间结构，这使它在作为固定化细胞载体等方面的应用具有更多的优越性。但是无机载体固定化细胞时，主要靠吸附作用和电荷效应(范德化力、氢键及静电作用)，细胞结合不牢固，容易脱落。
[0004]有机高分子载体中的天然高分子凝胶载体一般具有生物相容性好、制备工艺简单、传质性能好等优点。常见的天然高分子凝胶有琼脂、角叉莱胶、海藻酸钙、甲壳素等。在这几种天然载体中，琼脂强度最差，角叉莱胶价格较贵，甲壳素不溶于普通试剂。相比之下，海藻酸钙具有价格低廉、制备容易、传质性能好等优点，应用最为广泛。但海藻酸钠强度较低，在厌氧条件下易被微生物分解，寿命较短。由于有机和无机载体材料各有其优缺点，而两类材料在许多方面互补。因此，可将这两类材料结合在一起，组成复合载体材料，以改进材料的性能。
[0005]包埋法是将微生物限定在凝胶的微小格子或微胶囊等有限空间内，同时能让基质渗入和产物扩散出来。包埋法对微生物活性影响小、颗粒强度高，是目前研究最多的固定化方法。交联法是通过微生物与具有两个或两个以上的官能基团的试剂反应，使微生物菌体相互连接成网状结构，而达到固定微生物的目的。在包埋过程中让天然有机高分子发生交联，会使高分子凝胶更加稳定、坚固。虽然，固定化微生物细胞的凝胶基质可以防止细胞的泄漏，但同时也是底物和氧分子扩散的屏障。扩散阻碍会引起表观反应速率的下降。有时，甚至会由于质量传递限制而改变包埋固定在凝胶颗粒中细胞的代谢行为。因此，在固定化细胞动力学研究过程中应考虑凝胶内物质的扩散行为。同时，颗粒的完整性受其机械强度、相互碰撞、摩擦和剪切力的影响，这些因素都会导致颗粒破裂。因此，包埋颗粒的机械强度和耐久性也是固定化微生物操作是否成功的关键。
【发明内容】
[0006]包埋载体应具备对微生物无毒，制备容易，传质性能好，价格便宜等特点，海藻酸钠作为载体具有操作方便，包埋微生物的活性高。明胶是一种常用的蛋白质胶凝剂，溶解性好而且价格低廉，可以很好的改善海藻酸钠的成型效果。利用海藻酸钠与明胶联合固定化制备的胶粒与单一的应用海藻酸钠相比可以提供更大的固定化空间，有利于物质的扩散。蒙脱石结构特征决定其层间域具有优良的离子交换性能和分子吸附特征。将海藻酸钠、明胶与蒙脱石一起制备凝胶小球，可以解决蒙脱石在水中具有的分散悬浮性强、固液分离速度慢、絮凝物脱水效果差、不易分离等缺点。
[0007]称取适量海藻酸钠置于沸水中搅拌使其充分溶解，冷却至室温，配制浓度为5.0%的海藻酸钠母液；称取适量明胶置于沸水中搅拌使其充分溶解，冷却至室温，配制浓度为30.0%的明胶母液；取适量配制好的明胶母液、海藻酸钠母液，加入适量蒙脱石及蒸馏水混合均匀，使海藻酸钠浓度为1_4%，明胶浓度为0.5-3%，蒙脱石浓度为0.02-0.lg/mL，混合溶液体积为5-20mL。通过注射器(针头型号22-27G)的针头将上述混合液以5cm高度注入30mL含有浓度为0.4-0.7%的戊二醛及浓度为3_6%的氯化钙混合溶液中，立即形成光滑的微球体。将此固定化小球在上述溶液中静置3-10h，倒掉混合溶液，用适量蒸馏水洗涤小球两次，备用。
[0008]向上述制得的小球中加入30mL蒸馏水后，再加入500 μ L浓度为0.2%的次甲基蓝溶液，30 0C, 130rpm屏幕振荡40min后取出溶液,用可见分光光度计测定其在620nm波长下的吸光度。吸光度值越小，说明其传质性能越好。蒙脱石的用量选定为:0.02、0.04、0.06、0.08,0.lg/mL (此时明胶浓度固定为3%，海藻酸钠浓度固定物1%)，OD620从0.684下降到
0.071。使用Folin酚法测定上清液中的蛋白质含量，蒙脱石浓度为0.lg/mL时，上清液中蛋白质含量最低。明胶浓度选定为:3%、5%、7%、9%、11%(此时蒙脱石浓度固定为0.08 g/mL，海藻酸钠浓度固定物1%)，0D62。从1.215下降到0.061 ;使用Folin酚法测定上清液中的蛋白质含量，明胶浓度为3%时，上清液中蛋白质含量最低。当海藻酸钠浓度选定为:1.0%、1.5%、
2.0%、2.5%、3.0%(此时明胶浓度固定为3%，蒙脱石浓度固定物0.08 g/mL)，OD620从0.196下降到0.096。使用Folin酚法测定上清液中的蛋白质含量，海藻酸钠浓度为3%时，上清液中蛋白质含量最低。
[0009]取上述不同条件下制备的固定化小球置于30mL蒸馏水中，用磁力搅拌器以30°C、最大转速进行搅拌振荡，2h后测量溶液在660nm处的吸光值，吸光值越小，说明机械强度越大。经过测定其0D66。约为0.006-0.025，小球破碎率0-5%。
【具体实施方式】
[0010]具体实施例一
从冰箱中取出大肠杆菌JM109，取其中20 μ L接入到10mL的LB培养基中，37 °C、140rpm摇床培养48h。取上述LB培养基80毫升,于离心机4000r/min,离心15min,用生理盐水洗涤菌体两次。将上述离心分离得到的菌团的一部分加入到1mL含海藻酸钠、明胶、蒙脱石的液体中，使海藻酸钠终浓度为4%，明胶终浓度为3%