一种互穿网络结构丝素蛋白水凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种互穿网络丝素蛋白水凝胶及其制备方法，通过辣根过氧化物酶催化N?乙烯基吡咯烷酮单体发生聚合反应，生成聚乙烯吡咯烷酮并与丝素蛋白大分子发生分子链缠结，形成以无规卷曲结构为主的互穿网络（IPN）水凝胶。水凝胶固含量中，丝素蛋白质量百分含量为50～90%，聚乙烯吡咯烷酮为10～50%。互穿网络丝素蛋白水凝胶压缩率为60%时的压缩强度达到2 kPa以上，压缩60%后的回弹率为达到90～100%。本发明提供的丝素蛋白水凝胶具有高强度、弹性和透明度的特性，可作为用于角膜修复的高分子材料。
【专利说明】
一种互穿网络结构丝素蛋白水凝胶及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种水凝胶材料及其制备方法，特别涉及一种具有互穿网络的丝素蛋 白水凝胶及其制备方法，该丝素蛋白水凝胶具有高强度、弹性和透明度的特性，可作为用于 角膜修复的高分子材料。
【背景技术】
[0002] 水凝胶是一种特殊的软湿性材料，具有三维的网状结构，内部呈现出多孔状，以水 为分散体系，有一定强度且性质柔软。水凝胶内部的多孔结构相互贯通，为水分、营养物质 和药物等的运输提供了良好的通道，为细胞的生长和增殖提供了优异环境。生物体中许多 组织具有水凝胶结构，水凝胶材料的透气性、透离子性、蛋白质的沉积状况都会直接影响材 料的生物医学性能，水凝胶的结构与性能是影响其在生物体内应用效果的主要因素。应用 于生物医学领域的水凝胶材料(如角膜接触镜材料、人工晶状体等）要求材料具有较高的 力学强度和弹性。
[0003] 蚕丝是一种优异的天然蛋白质纤维，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18种氨基酸组 成。具有许多独特的物理化学性质，特别是良好的生物相容性，对机体无毒性，无致敏和刺 激作用，另外还具有优良的物理机械性能、降解性能，并且降解产物不会引起炎症反应。因 此，近年来其用作生物医用材料的报道日益增多。丝素蛋白水凝胶是再生丝素蛋白溶液在 一定条件下发生凝胶化制备而成。再生丝素蛋白溶液凝胶化过程主要受丝素溶液的浓度、 温度、pH、金属离子和剪切作用等因素的影响。可以通过改变丝素溶液浓度、pH、添加金属离 子及施加剪切力等促进其凝胶化过程。在一定的剪切速率下，再生丝素蛋白溶液中出现分 子构象由无规卷曲向折叠结构转变，进一步发生凝胶化。但是丝素蛋白水凝胶主要由β_ 折叠组成，比较硬而脆，缺乏弹性回复，压缩后易碎，难以适用于生物医用组织的修复。 [0004]聚乙烯吡咯烷酮是少数具有优良生物相容性的亲水性高分子化合物，在医药卫生 及生物医学工程材料领域应用前景广阔，如人工玻璃体、角膜接触镜等。他是水溶性高分 子，需要另外加入交联剂才能形成水凝胶。而化学交联剂一般都具有生物毒性，将影响到材 料的生物相容性。
[0005] 互穿聚合物网络结构（ΙΡΝ)，是两种或两种以上的聚合物通过分子链相互贯穿缠 结而形成的一类独特的聚合物合金。其最大特点是可以将热力学不相容的聚合物相混而形 成至少在动力学上可以稳定的合金性质的物质，从而实现组分之间的性能互补；同时，ΙΡΝ 的特殊细胞状结构、界面互穿、双相连续等结构形态特征又使得它们在性能或功能上产生 特殊的协同作用。因此ΙΡΝ在功能材料领域的应用具有独特的优点。
[0006] 在本发明作出之前，中国发明专利(CN1158338C)公开了一种化学交联结构的丝素 蛋白水凝胶、海绵状丝素蛋白水凝胶材料的制备方法，采用调整丝素蛋白水溶液的ΡΗ，并混 入环氧化合物作为交联剂，经冷冻，凝固形成凝胶。由于环氧化合物具有一定的毒性，虽然 采用水洗法洗去未反应的环氧交联剂，但凝胶中仍会存在残留的环氧交联剂，从而降低丝 素蛋白水凝胶材料的生物相容性。中国发明专利(CN101502670)公开了一种丝素蛋白水凝 胶的制备方法，采用超声波震荡的方法在短时间内形成水凝胶，但形成的水凝胶弹性回复 率较低。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术存在的不足，提供一种具有较高的强度、弹性和透明度的互 穿网络丝素蛋白水凝胶及其制备方法。
[0008] 为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是提供一种互穿网络丝素蛋白水凝 胶，所述水凝胶固含量中，丝素蛋白质量百分含量为50~90%，聚乙烯吡咯烷酮为10~50%; 互穿网络丝素蛋白水凝胶压缩率为60%时的压缩强度为2 kPa以上，压缩60%后的回弹率为 90~100%。
[0009] 本发明技术方案还包括一种互穿网络丝素蛋白水凝胶的制备方法，以丝素蛋白水 溶液为原料，步骤如下： 1、 分别配置浓度为20~100g/L的N-乙烯基吡咯烷酮水溶液，浓度为0.5~5g/L的过氧 化氢水溶液，浓度为0.1~0.5g/L的辣根过氧化氢酶水溶液； 2、 将步骤1得到的三种水溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，所得到的混合溶液，总含固 率为10 g/L~50g/L，其中，丝素蛋白与N-乙烯吡咯烷酮的质量比为9:1~5:5,过氧化氢的 加入量为O.lmM~10mM，辣根过氧化物酶的加入量为2~20 units/mL;经平衡处理2~36小 时，待反应完全后，得到一种互穿网络丝素蛋白水凝胶。
[0010] 本发明的一个优选方案是:步骤2中过氧化氢的加入量为0.5mM~2mM。
[0011] 由于丝素蛋白与聚乙烯吡咯烷酮是两种并不相容的高分子，因此，简单的混合无 法形成水不溶性材料。本发明采用以辣根过氧化物酶催化N-乙烯基吡咯烷酮单体发生聚合 反应的方法，生成聚乙烯吡咯烷酮并与丝素蛋白大分子发生分子链缠结；由于N-乙烯基吡 咯烷酮(NVP)含有不饱和官能团一C=C一，引发剂H 2〇2在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用 下生成自由基，进而引发单体发生聚合反应，生成的聚乙烯吡咯烷酮与丝素蛋白大分子发 生分子链缠结，在一定条件下形成以丝素蛋白无规卷曲结构为主的互穿网络（IPN)水凝胶， 充分发挥了丝素蛋白与聚乙烯吡咯烷酮的优良性能。
[0012] 与现有丝素蛋白水凝胶相比，本发明的优势在于： 1、通过酶引发反应制备了丝素蛋白/聚乙烯吡咯烷酮半互穿网络水凝胶，将丝素蛋白 与聚乙烯吡咯烷酮两种生物相容性优异的高分子材料结合在一起，为生物医学领域提供了 新的选择。
[0013] 2、丝素蛋白/聚乙烯吡咯烷酮半互穿网络水凝胶结构稳定，凝胶时间短，且通过对 质量配比、引发剂、温度、酶含量的控制可实现对凝胶时间的控制。
[0014] 3、丝素蛋白/聚乙烯吡咯烷酮半互穿网络水凝胶具有优良的透光性，可用于人工 玻璃体、角膜接触镜等材料领域。
[0015] 4、丝素蛋白/聚乙烯吡咯烷酮半互穿网络水凝胶具有优良的压缩强度、压缩百分 比和几乎100%的压缩回弹率，具有极其优异的机械性能。
【附图说明】
[0016] 图1是本发明实施例提供的丝素蛋白互穿网络水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶的电镜 对比图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和具体的实施例，对本发明技术方案作进一步阐述。
[0018] 实施例一 本实施例制备一种丝素蛋白互穿网络水凝胶，具体步骤如下： 1、丝素溶液的制备： 用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的碳酸氢钠碳酸钠水溶 液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸氢钠3克），用电磁炉加 热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出丝并用去离子水清洗 干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘干得到纯丝素纤维。 将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液中，在恒温磁力搅拌 器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置于去离子水中透析3 ~4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶液的质量分数并放 置于4 °C冰箱中备用。
[0019] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备： 将丝素蛋白溶液与N-乙烯基吡咯烷酮进行引发反应。固定水凝胶的含固量为10 g/L， 丝素蛋白溶液终浓度为9 g/L，N-乙烯基吡咯烷酮终浓度对应为1 g/L，引发剂(H2〇2)终浓度 为1 mM，催化剂(HRP)终浓度为10 units/mL，混匀后导入模具形成水凝胶。将形成的水凝胶 放在37 °C恒温培养箱中平衡24 h，促使其反应完全，获得丝素蛋白互穿网络水凝胶。
[0020] 本实施例以纯丝素蛋白水凝胶为对比例:将纯丝素蛋白溶液放置使其凝胶化，作 为对照组，考察其性能。冷冻干燥后切片，电镜观察其孔结构。
[0021] 参见附图1，它是本实施例提供的丝素蛋白互穿网络水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶 的电镜对比图；图中，A图为丝素蛋白互穿网络水凝胶（SF:NVP为9:1)的截面图，B图为纯丝 素蛋白水凝胶的截面图。从图中可以看出，IPN水凝胶的内部孔径致密，孔隙率高，提高了凝 胶材料的储水能力和机械性能；IPN水凝胶的内部孔径可达80 μπι，远大于纯丝素水凝胶的 孔径，为水分和营养物质的运载以及细胞生长提供了适宜的环境。
[0022] 用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对该 水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0023] 实施例二 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3~4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素 溶液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0024] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备:将丝素蛋白溶液与N-乙烯基吡咯烷酮进行引 发反应。固定水凝胶的含固量为10 g/L，丝素蛋白溶液终浓度为8 g/L，N-乙烯基吡咯烷酮 终浓度对应为2 g/L，引发剂(H2〇2)终浓度为1.1 mM，催化剂(HRP)终浓度为10 units/mL。
[0025] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在37 °C恒温培养箱中形成平衡15 h。
[0026] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0027] 实施例三 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3-4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶 液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0028] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备:将丝素蛋白溶液与N-乙烯基吡咯烷酮进行引 发反应。固定水凝胶的含固量为10 g/L，丝素蛋白溶液终浓度为7 g/L，N-乙烯基吡咯烷酮 终浓度对应为3 g/L，引发剂(H2〇2)终浓度为1.2 mM，催化剂(HRP)终浓度为10 units/mL。
[0029] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在37 °C恒温培养箱中形成平衡10 h。
[0030] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0031] 实施例四 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3-4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶 液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0032] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备:将丝素蛋白溶液与N-乙烯基吡咯烷酮进行引 发反应。固定水凝胶的含固量为10 g/L，丝素蛋白溶液终浓度为6 g/L，N-乙烯基吡咯烷酮 终浓度对应为4g/L，引发剂(H2〇2)终浓度为0.9 mM，催化剂(HRP)终浓度为10 units/mL。
[0033] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在37 °C恒温培养箱中形成平衡30 h。
[0034] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0035] 实施例五 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3-4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶 液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0036] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备:将丝素蛋白溶液与N-乙烯基吡咯烷酮进行引 发反应。固定水凝胶的含固量为10 g/L，丝素蛋白溶液终浓度为5 g/L，N-乙烯基吡咯烷酮 终浓度对应为5 g/L，引发剂(H2〇2)终浓度为0.8 mM，催化剂(HRP)终浓度为10 units/mL。
[0037] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在37 °C恒温培养箱中形成平衡20 h。
[0038] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0039] 实施例六 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3-4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶 液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0040] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备：固定质量配比为（SF:NVP)8:2,含固率20 g/ L，HRP浓度为 10 units/mL，H2〇2的浓度为0.5mM。
[0041] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在35 °C恒温培养箱中形成平衡8 h。
[0042] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0043] 实施例七 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3-4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶 液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0044] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备：固定质量配比为（SF: NVP)8: 2，含固率25g/L， HRP浓度为 10 units/mL，H2〇2的浓度为0.5mM。
[0045] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在37 °C恒温培养箱中形成平衡18 h。
[0046] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0047]实施例八 1、丝素溶液的制备：用精密天平称取80 g家蚕茧壳，配置质量分数为0.01MpH=9.5的 碳酸氢钠碳酸钠水溶液4000毫升，（在不锈钢中加入4000毫升去离子水，碳酸钠1克，碳酸 氢钠3克），用电磁炉加热到沸腾后加入茧壳，调节电磁炉功率为最低，继续微沸30min，取出 丝并用去离子水清洗干净。重复以上试验三次以脱去丝胶，然后取出置于60 °C的烘箱中烘 干得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维按浴比20:150溶解于浓度为9.3 mol/L的溴化锂溶液 中，在恒温磁力搅拌器中以60±2 °C溶解约1 h，冷却后取出装入透析袋中密封，低温下置 于去离子水中透析3-4 d，用脱脂棉过滤得到纯丝素溶液，通过烘干称重计算得到纯丝素溶 液的质量分数并放置于4 °C冰箱中备用。
[0048] 2、丝素蛋白互穿网络水凝胶的制备：固定质量配比为（SF:NVP)8:2,含固率30 g/ L，HRP浓度为 10 units/mL，H2〇2的浓度为0.5mM。
[0049] 3、将形成的水凝胶与纯丝素蛋白水凝胶放在37 °C恒温培养箱中形成平衡22 h。
[0050] 4、用打孔模具将水凝胶制成尺寸为9 mm(直径）X9 mm(高）的圆柱型凝胶样品，对 该水凝胶使用TMS-PR0质构仪进行压缩力学性能测试，测试结果参见表1。
[0051] 参见表1，它是本发明各实施例制备的样品与纯丝素蛋白水凝胶力学性能测试结 果比较。
[0052]表1:水凝胶的力学性能比较
【主权项】
1. 一种互穿网络丝素蛋白水凝胶，其特征在于:所述水凝胶固含量中，丝素蛋白质量百 分含量为50~90%，聚乙烯吡咯烷酮为10~50%;互穿网络丝素蛋白水凝胶压缩率为60%时的 压缩强度为2 kPa以上，压缩60%后的回弹率为90~100%。2. -种互穿网络丝素蛋白水凝胶的制备方法，以丝素蛋白水溶液为原料，其特征在于 包括以下步骤： (1) 分别配置浓度为20~100g/L的N-乙烯基吡咯烷酮水溶液，浓度为0.5~5g/L的过 氧化氢水溶液，浓度为0.1~0.5g/L的辣根过氧化氢酶水溶液； (2) 将步骤（1)得到的三种水溶液与丝素蛋白水溶液混合均匀，所得到的混合溶液，总 含固率为10 g/L~50g/L，其中，丝素蛋白与N-乙烯吡咯烷酮的质量比为9:1~5:5,过氧化 氢的加入量为O.lmM~10mM，辣根过氧化物酶的加入量为2~20 units/mL;经平衡处理2~ 36小时，待反应完全后，得到一种互穿网络丝素蛋白水凝胶。3. 根据权利要求2所述的一种互穿网络丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于:步骤 (2)中，过氧化氢的加入量为0.5mM~2mM。
【文档编号】A61L27/52GK106009709SQ201610470678
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月25日
【发明人】卢神州, 吴峰, 朱天, 付华
【申请人】南通纺织丝绸产业技术研究院