丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用的制作方法

丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法，该方法首先称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，经过LiBr或LiCl提取，透析纯化得到非降解的质量百分浓度为0.1～4％的丝胶蛋白水溶液；然后将丝胶蛋白水溶液浓缩至1.5～10.0％，向浓缩后的丝胶蛋白水溶液中加入交联剂（每1mL丝胶蛋白水溶液加入2～500μL的交联剂），充分混匀后置于4～45℃下5秒～36小时，得到水凝胶。该水凝胶具有生物活性和多功能性，可作为搭载生长因子，药物以及细胞载体，可应用于多种软组织损伤的修复和疾病的治疗，包括但不限于皮肤损伤，肌肉损伤，血管损伤，神经损伤，心肌损伤等。
【专利说明】丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医用复合材料领域，具体地指一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用。该水凝胶具有生物活性和多功能性，可作为生长因子，药物以及细胞的载体，可应用于多种软组织损伤的修复和疾病的治疗，包括但不限于皮肤损伤，肌肉损伤，血管损伤，神经损伤，心肌损伤等。
【背景技术】
[0002]水凝胶是一种能够在水中溶胀、保持大量水分的三维网状聚合物。水凝胶作为一类重要的生物材料具有可膨胀和保持大量水分的特性，已被广泛地应用于生物医药和组织工程领域。其中一类水凝胶由天然生物材料(如胶原、海藻酸盐和壳聚糖等)制备，这类水凝胶因为拥有与机体高度相似的理化特性和优越的生物学性能而备受青睐。近年来利用天然生物材料研发新型水凝胶是组织工程领域的重要课题和热点问题。
[0003]丝胶蛋白(Silk Sericin)是包裹在丝素纤维表层的一种天然大分子粘性蛋白，约占蚕茧含量的20~30% ，由分子量为24~400kDa的多肽组成，其分子由丝氨酸、天门冬氨酸和甘氨酸等18种氨基酸组成。长期以来由于人们对丝胶蛋白认识的不足和研究的局限性，导致丝胶在缫丝工业中被当作废物处理，浪费了大量宝贵的天然资源。近年来人们发现丝胶蛋白具有保湿、抗菌、抗氧化、抗凝血以及促进细胞粘附和增殖等生物特性。不仅如此，丝胶具有亲水性和可降解性，是理想的生物医用材料。已有的报道显示丝胶常用于与其他材料(如弹性蛋白，聚乙烯醇等)共聚或简单交联，混合制作生物支架以获得性能优良的生物材料。而单纯用丝胶蛋白制作的生物材料仍仅限于性质脆弱的二维丝胶蛋白膜，真正意义上的三维纯丝胶蛋白水凝胶依然难以实现。主要原因在于传统丝胶蛋白分离方法(如高温法，碱法)易导致丝胶蛋白降解，而降解的丝胶蛋白分子量较小，物理性质脆弱，水溶性高，难以制作(包括交联)成水凝胶。大大制约了丝胶蛋白在组织工程中的应用。因此研发具有高生物相容性，优良力学性能和高稳定性的纯丝胶蛋白水凝胶，充分发挥丝胶蛋白在组织工程学中的应用，具有重要的社会意义和广阔的应用前景。所以能否成功制备具有三维结构的纯丝胶水凝胶并将其应用于生物医学领域是十分值得研究的重要课题。
[0004]本发明以家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧采用溴化锂提取法成功提取纯丝胶蛋白，并首次利用化学共价键交联的方式，成功地制备了具有荧光特性，可注射的纯丝胶蛋白水凝胶。该丝胶蛋白水凝胶具有良好的生物相容性，细胞粘附性和优异的机械性能。该丝胶蛋白水凝胶自身的荧光特性，可用于体内实时跟踪和成像。
[0005]该三维纯丝胶蛋白水凝胶具有生物活性和多功能性，可作为生长因子，药物以及细胞的载体，可应用于多种软组织损伤的修复和疾病的治疗，包括但不限于皮肤损伤，肌肉损伤，血管损伤，神经损伤，心肌损伤等。

【发明内容】

[0006]本发明所要解决的技术问题就是提供一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法及其应用。本发明以家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所，该类品种资源保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心)作为原材料，经过提取纯化得到丝胶蛋白水溶液，使用化学交联剂(醛类、京尼平)交联，制备具有细胞相容性和细胞粘附性，高交联率，凝胶快速，机械性能好，性质稳定且具有荧光特性的水凝胶。该材料是一种新型生物材料，可作为生长因子，药物以及细胞的载体，能够应用于多种软组织损伤的修复和疾病的治疗，包括但不限于皮肤损伤，肌肉损伤，血管损伤，神经损伤，心肌损伤等。
[0007]为解决上述技术问题，本发明提供的一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0008]I)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，经过LiBr或LiCl水溶液提取，透析纯化得到非降解性的质量百分浓度为0.1~4%的丝胶蛋白水溶液；
[0009]2)将步骤I)中得到的丝胶蛋白水溶液浓缩成为质量百分浓度为1.5~10.0%的溶液，向浓缩后的丝胶蛋白水溶液中加入交联剂(每ImL丝胶蛋白水溶液加入2~IOOyL的交联剂)，充分混匀后置于4~45°C下反应5秒~36小时，得到水凝胶。
[0010]进一步地，所述交联剂为戊二醛、丙二醛或京尼平中的任意一种。
[0011]再进一步地，所述交联剂的质量百分浓度为0.1~25%。
[0012]再进一步地，所述步骤I)中，丝胶蛋白水溶液的制备方法，包括以下步骤:
[0013]I)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪成碎片，用水清洗，去除水份，备用；
[0014]2)将步骤I)的蚕茧碎片浸泡于浓度为6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液中(每克蚕茧碎片加入20~100mL6~8mol/L的Lifc或LiCl水溶液)，置于25~50°C，5~24小时；
[0015]3)然后将步骤2)中得到的溶液离心，分离去除不溶性物质，得到澄清溶液；
[0016]4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积lmol/L、pH8.0~11.0的Tris-HCl缓冲液，并在超纯水中透析，得到丝胶蛋白水溶液；
[0017]5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，浓缩得到质量百分浓度为1.5~10%的丝胶液丝胶蛋白水溶液，置于冰箱保存备用；
[0018]作为优选方案，丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0019]I)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪成Icm2碎片，清洗3次，去除水份，备用；
[0020]2)将步骤I)的蚕茧碎片浸泡于浓度为6mol/L的LiBr水溶液中(每克蚕茧碎片加入40mL的LiBr水溶液)充分浸泡后，置于35°C水浴24小时，溶解丝胶蛋白；
[0021]3)然后将步骤2)中的溶液在3500rpm离心，分离去除不溶性物质，得到澄清的溶液；
[0022]4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积lmol/L，pH9.0的Tris-HCl缓冲液，并将其进行透析，得到丝胶蛋白水溶液，
[0023]5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，浓缩得到质量百分浓度为1.5~10%的丝胶蛋白水溶液，置于4°C保存备用；
[0024]6)将上述得到的丝胶蛋白水溶液中加入戊二醛(按每ImL丝胶蛋白水溶液加入2~100 μ L质量百分浓度为25%的戊二醛)，充分混匀后置于37°C 5分钟，得到水凝胶。[0025]本发明还提供了一种丝胶蛋白水凝胶在生物医用材料中的应用。该丝胶蛋白水凝胶可用于以下方面:
[0026]I)该丝胶蛋白水凝胶应用于多种损伤修复及疾病的治疗，包括但不限于血管、表皮、肌肉、皮肤和神经组织损伤的修复；
[0027]2)该丝胶蛋白水凝胶结合工具细胞包装相应的治疗因子应用于组织修复；
[0028]3)该丝胶蛋白水凝胶可作为生长因子、药物以及细胞的载体。
[0029]本发明还提供了一种丝胶蛋白冻干支架的制备方法，包括以下步骤:
[0030]I)将上述得到的丝胶蛋白水凝胶置于零度以下冷冻；
[0031]2)将冷冻的丝胶蛋白水凝胶真空冷冻干燥，得到丝胶蛋白冻干支架。
[0032]本发明还提供了一种丝胶蛋白冻干支架在生物医用材料中的应用。
[0033]本发明还提供了一种丝胶蛋白水凝胶在荧光标记探针材料中的应用。
[0034]本发明还提供了一种丝胶蛋白水凝胶以任何形态或形式存在并应用于生物医用材料。
[0035]本发明的有益效果在于:
[0036]I)保持了丝胶蛋白良好的天然特性(传统的丝胶蛋白取自野生型蚕茧，采用传统提取方法如，高温高压法或碱法获得的丝胶蛋白降解严重，成胶性差，而采用溴化锂溶液提取法又无法将丝胶与丝素分离)，克服了传统提取方法无法得到非降解的高生物特性丝胶蛋白的难题。
[0037]2)本发明采用的方法丝胶蛋白的提取效率在90%以上。
[0038]3)本发明首次使用非降解的丝胶蛋白水溶液与醛类或京尼平等交联剂制作水凝胶，制备方法简便易行。
[0039]4)本发明首次制备了三维的具有良好机械性能的纯丝胶蛋白支架，同时也是首次制备了可注射型的纯丝胶蛋白水凝胶(目前世界上仍无可注射纯丝胶蛋白三维水凝胶，通常使用丝胶蛋白与其他材料简单混合制备复合生物材料，如明胶、聚乙烯醇、壳聚糖等)。
[0040]5)本发明制备的丝胶蛋白水凝胶具有独特的性质。本发明提取的完整的丝胶多肽保持了丝胶蛋白良好的天然特性，该丝胶蛋白水溶液在交联剂(醛类、京尼平等)的作用下易交联成胶。本发明研制的丝胶蛋白水凝胶不仅具有传统水凝胶的特点(多孔性，可降解性等)，而且具有诸多自身的优良特性:(I)具有良好的生物相容性，可以搭载多种细胞并支持细胞粘附和增殖；(II)具有可注射性及原位成胶特性，可通过注射的方式将该材料移植到体内，该方法对机体的创伤明显小于手术；(ΠΙ)具有自荧光特性，可以在体内被实时跟踪；(IV)具有良好的机械性能(丝胶水凝胶具有比广泛用于组织工程的海藻酸盐水凝胶更优异的机械性能);(V)降解产物具有很强的近中性PH的缓冲能力，在用该材料作为药物或生长因子载体时有利于避免药物或生长因子等因环境PH影响而变性失活；(VI)降解速度具有PH响应性；(W)具有良好的药物缓释能力，是良好的药物载体等。
[0041]6)本发明所获得的丝胶蛋白水凝胶交联率和成胶时间均可控(可根据需要实现原位成胶)，通过改变交联剂的用量、种类或丝胶蛋白水溶液的浓度等条件调控水凝胶的交联率与成胶速度。
[0042]7)本发明获得的丝胶蛋白水凝胶用途广，可制作成为各种形状的凝胶，并可经冻干获得不同形状和孔径的多孔生物支架。[0043]8)该丝胶蛋白水凝胶有良好的生物相容性和细胞粘附性，可支持多种细胞的存活和增殖；对药物具有良好的控释作用；丝胶蛋白水凝胶及其经过冻干得到的三维多孔丝胶蛋白生物支架，可作为细胞外基质支持细胞生长和促进营养物质交换。相关实验结果表明该丝胶蛋白水凝胶可应用于包括但不限于血管、表皮、肌肉、皮肤、神经等组织损伤的修复和疾病的治疗。
【专利附图】

【附图说明】
[0044]图1为丝胶蛋白水凝胶在不同温度情况冷冻并低温真空干燥得到的冻干支架和丝胶蛋白神经导管；
[0045]图2为丝胶蛋白浓度与成胶时间(在室温)关系图；
[0046]图3为37°C下丝胶蛋白水凝胶的交联率曲线图
[0047]图4为丝胶蛋白水凝胶和海藻酸盐水凝胶的弹性模量柱状图，
[0048]其中，A:压缩强度，B:压缩模量；
[0049]图5为丝胶蛋白水凝胶在不同pH环境下的吸水膨胀率(37°C)曲线图；
[0050]图6为丝胶蛋白水凝胶在PBS中的降解(37 °C )曲线图
[0051]图7为丝胶蛋白水凝胶降解产物对降解液pH值的影响
[0052]图8为丝胶蛋白水凝胶在不同的pH值(3.0、7.4、11.0)条件下的水饱和度；
[0053]图9为丝胶蛋白差示扫描量热法分析图谱
[0054]其中，(I )丝胶蛋白，(II)戊二醛交联的丝胶蛋白水凝胶，(III)戊二醛和浓盐酸处理的丝胶蛋白，(IV)乙醇处理的丝胶蛋白
[0055]图10为丝胶蛋白水凝胶和丝胶蛋白的红外光谱图
[0056]其中，(a)乙醇处理的丝胶，(b)戊二醛和浓盐酸处理的丝胶蛋白，(C)戊二醛交联的丝胶水凝胶，(d)丝胶蛋白
[0057]图11为荧光显微镜下观察到的丝胶导管和冻干水凝胶图(A-H为导管，1-L为丝胶水凝胶冻干支架，标尺为200 μ m)
[0058]图12为小动物成像系统对小鼠体内注射的丝胶水凝胶进行示踪
[0059]图13为丝胶蛋白水凝胶辣根过氧化物酶(HRP)释放曲线图
[0060]图14为人脐静脉内皮细胞丝胶蛋白水凝胶组与对照组细胞粘附性与细胞活力检测；
[0061]其中，A为细胞对丝胶蛋白水凝胶的粘附性检测图(所用细胞系为ECV304)，B为细胞活力检测图(所用细胞系为EA.hy926)
[0062]图15为人脐静脉内皮细胞(ECV304)丝胶蛋白水凝胶组与人静脉内皮细胞对照组图
[0063]其中，A为普通电子显微镜图，B为共聚焦电子显微镜图
[0064]图16为人皮肤表皮 细胞(HaCaT)丝胶蛋白水凝胶组与人皮肤表皮细胞对照组图
[0065]图17为小鼠肌细胞(C2C12)丝胶蛋白水凝胶组与小鼠肌细胞对照组图
[0066]图18为人胚胎肾细胞(HEK293)丝胶蛋白水凝胶组与人胚胎肾细胞对照组图
[0067]图19为人胚胎皮肤成纤维细胞(CCC-ESF-1)丝胶蛋白水凝胶组与人胚胎皮肤成纤维细胞对照组图[0068]图20为小鼠小胶质细胞(BV2)丝胶蛋白水凝胶组与小鼠小胶质细胞对照组图
[0069]图21为小鼠胰岛内皮细胞(MSl)丝胶蛋白水凝胶组与小鼠胰岛内皮细胞对照组图；
[0070]图22为大鼠雪旺氏细胞(RSC926)丝胶蛋白水凝胶组与大鼠雪旺氏细胞对照组图
[0071]图23为大鼠心肌细胞(H9C2)丝胶蛋白水凝胶组与大鼠心肌细胞对照组图
【具体实施方式】
[0072]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
[0073]实施例1
[0074]丝胶蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
[0075]一、蚕茧的选择:
[0076]选用家 蚕丝素缺失变品种蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所，该类品种资源保存于中国农业科学院蚕业研究所国家蚕资源保存中心)为原材料，主要的化学成分为:丝胶蛋白
[0077]二、丝胶的提取与分离
[0078]I)称取家蚕突变品种蚕茧(购于中国农业科学院蚕业研究所提供)Ig并剪成Icm2的碎片，后置于洁净的烧杯中，用超纯水清洗3次，3500rpm离心5分钟去除水份；
[0079]2)向步骤I)中得到的蚕茧碎片中加入30~60mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液，将该烧杯放入恒温水浴锅内35°C水浴24小时，溶解丝胶蛋白；
[0080]3)将步骤2)得到溶液转入离心管内3500rpm离心5分钟，去除不溶性物质，得到澄清的溶液；
[0081]4)向步骤3)得到的澄清溶液中加入四分之一体积的Tris-HCl缓冲液(lmol/L，ρΗ9.0)；
[0082]5)将步骤4)中的溶液转入到预处理好的透析袋(MWC03500)中，然后将透析袋两端用夹子夹紧，放置于含有超纯水的烧杯中；将该烧杯置于搅拌器上慢速搅拌透析，每隔3小时换一次水，共透析48小时；
[0083]6)将5)中透析后的丝胶蛋白水溶液转到离心管中，4000rpm离心5分钟，去除沉淀；
[0084]7)将丝胶蛋白水溶液再装入到透析袋中并将透析袋两端用夹子夹紧，再将透析袋置于质量百分浓度为20%的PEG6000溶液中浓缩；将丝胶蛋白水溶液浓缩到需要的浓度为止(质量百分浓度为2.0%以上)；
[0085]8)蛋白浓度检测采用BSA法和丝胶蛋白水溶液干燥法；
[0086]9)蛋白质分子量检测(参照SDS-PAGE)。取10~15 μ L用于分子量检测，其余置于4°C冰箱保存备用。
[0087]三、水凝胶的制备
[0088]1.将浓缩后的丝胶蛋白水溶液用超纯水调整到2.0% (丝蛋白水溶液浓度为质量百分浓度);
[0089]2.每ImL丝胶蛋白水溶液中加入22 μ L质量百分浓度为25%的戊二醛；[0090]3.充分混匀后置于37°C下5分种，得到水凝胶。
[0091]四、实验分析
[0092]1、丝胶蛋白的成胶时间和交联率分析
[0093]该丝胶蛋白水凝胶由丝胶蛋白水溶液与质量百分浓度为25%的戊二醛在室温下按体积比(100: 2.2)制备，观察并记录其成胶时间与测试交联程度。
[0094]如图2所示:随着丝胶蛋白浓度的下降，所需的交联时间越长，说明可利用丝胶蛋白浓度调节成胶时间
[0095]如图3所示:丝胶蛋白水溶液经戊二醛交联，可在0.5小时后基本完全交联，此后交联率保持在比较稳定的状态
[0096]2.丝胶水凝胶具多孔的结构
[0097]将丝胶蛋白水凝胶在三种不同的温度(分别为-201:、-801:、-196°0下冻干，并在扫描电子显微镜下观察。如图1所示:丝胶蛋白水凝胶经-196°C、-80°C、-2(TC冷冻温度处理后再冻干获得的丝胶蛋白三维多孔生物支架孔径分别约为20 μ m, 300 μ m,和700 μ m。当冷冻温度降低时，三维多孔生物支架的孔径相应变小。此外，三维多孔生物支架存在大量微孔，可作为细胞外基质很好地支持细胞生长和促进营养物质交换。
[0098]3、丝胶蛋白水凝胶和海藻酸盐水凝胶的力学性能对比分析
[0099]制作一定规格的 圆柱型水凝胶±夹，利用微型万能测试机(Instron5848MicroTester, Instron, USA))在常温下测试丝胶蛋白水凝胶的力学性能。
[0100]如图4A和图4B所示:丝胶蛋白水凝胶(质量百分浓度为2%)相对于广泛应用于组织工程研究的材料海藻酸盐水凝胶(质量百分浓度分别为2%和4%，水凝胶中含有等质量的高分子量和低分子量的海藻酸盐)有着更优异的机械性能。海藻酸盐水凝胶的配方为，ImL海藻酸盐水溶液加入40 μ L Ca2SO4 (0.21g/mL)悬浊液混匀。
[0101]4、丝胶蛋白水凝胶在不同pH环境下的降解速率
[0102]对于测试pH环境对降解的影响，将丝胶蛋白水凝胶浸泡于不同pH值(pH3.0、pH5.0、pH7.4、pHll.0)的PBS溶液中，每日更换一次PBS溶液，在不同时间点，取出、干燥、称重,结果见图5。
[0103]如图5所示:丝胶蛋白水凝胶在前5天内降解速率较快，5天后丝胶蛋白水凝胶的降解速率变缓慢。水凝胶降解具有pH响应性，其中在pHll.0的碱性条件下降解速率最快，15天即可完全降解；在pH3.0的酸性条件下降解速率最慢，53天降解率仅为30%左右。
[0104]在测试丝胶水凝胶降解产物对环境pH的影响时，不更换凝胶外部缓冲溶液，并在相应时间点测量该缓冲液的PH值，结果见图6。
[0105]如图6所示:丝胶蛋白水凝胶降解产物能够使外部缓冲溶液pH值趋于中性的特性。
[0106]5、pH值对丝胶蛋白水凝胶的膨胀率的影响
[0107]将丝胶蛋白水凝胶冻干、称重、浸泡于三种不用pH值(pH3.0、pH7.4、pHll.0)的PBS溶液中，在不同时间点，取出按以下公式测定其吸水膨胀率。(其中Ws为膨胀状态下的重量，Wd为干重)
【权利要求】
1.一种丝胶蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，经过LiBr或LiCl水溶液提取，透析纯化得到非降解的质量百分浓度为0.1~4%的丝胶蛋白水溶液； 2)将步骤I)中得到的丝胶蛋白水溶液浓缩至1.5~10%，向浓缩后的水溶液中加入交联剂，充分混匀后置于4~45°C、5秒~36小时，得到水凝胶，其中，每毫升丝胶蛋白水溶液加入2~500 μ L交联剂。
2.根据权利要求1所述的丝胶蛋白水凝胶制备方法，其特征在于:所述交联剂为戊二醛、丙二醛或京尼平中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的丝胶蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于:所述交联剂的质量百分浓度为I~25%。
4.根据权利要求1或2所述的丝胶蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于:所述步骤I)中，丝胶蛋白水溶液的制备方法，包括以下步骤: 1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪碎，用水清洗，去除水份，备用； 2)将步骤I)的蚕茧碎片浸泡于LiBr或LiCl水溶液中，25~50°C，溶解丝胶蛋白，其中，每克蚕茧碎片加入20~100mL6~8mol/L的LiBr或LiCl水溶液； 3)然后将步骤2)中的 溶液离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液； 4)向步骤3)已离心的溶液中加入四分之一体积lmol/L、pH8.0~11.0的Tris-HCl缓冲液，并将其透析，得到丝胶蛋白水溶液； 5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，浓缩得到质量百分浓度为1.5~10%的丝胶蛋白水溶液，置于冰箱保存备用。
5.根据权利要求1或2所述的丝胶蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于:丝胶蛋白水凝胶的制备方法包括以下步骤: 1)称取家蚕丝素缺失型突变品种蚕茧，并将其剪成Icm2碎片，清洗3次，去除水份，备用； 2)将步骤I)的蚕茧碎片浸于6mol/L的LiBr水溶液中，于35°C，溶解丝胶蛋白24小时，每克蚕茧碎片加入40mL的浓度为6mol/L的LiBr水溶液； 3)然后将步骤2)中的溶液以3500rpm离心，去除不溶性物质，得到澄清溶液； 4)向步骤3)的澄清溶液中加入四分之一体积lmol/L，pH9.0的Tris-HCl缓冲液，并将其进行透析，得到丝胶蛋白水溶液； 5)将步骤4)得到丝胶蛋白水溶液离心去除沉淀，再将丝胶液透析得到质量百分浓度为0.1~4%的丝胶蛋白水溶液，再浓缩至质量百分浓度为1.5~10.0%，置于4°C冰箱保存备用； 6)将上述得到的丝胶蛋白水溶液加入戊二醛，将二者混匀，置于37°C，5分钟，得到水凝胶，其中，每ImL丝胶蛋白水溶液加入2~100 μ L质量百分浓度为20~25%戊二醛。
6.一种权利要求按I~5中任一项所述制备得到的丝胶蛋白水凝胶在生物医用材料中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:该丝胶蛋白水凝胶用于以下方面: I)该丝胶蛋白水凝胶应用于多种损伤修复及疾病的治疗，包括但不限于皮肤损伤，肌肉损伤，血管损伤，神经损伤，心肌损伤等；2)该丝胶蛋白水凝胶结合工具细胞包装相应的治疗因子应用于组织修复； 3)该丝胶蛋白水凝胶作为生长因子、药物以及细胞的载体或支架。
8.—种丝胶蛋白冻干支架的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将上述得到的丝胶蛋白水凝胶置于零度以下冷冻； 2)将冷冻的丝胶蛋白水凝胶 真空低温干燥，得到丝胶蛋白冻干支架。
9.一种权利要求8制备得到丝胶蛋白冻干支架在生物医用材料中的应用。
10.一种权利要求1~5中任意一项制备得到的丝胶蛋白水凝胶在荧光标记探针材料中的应用。
11.一种权利要求1~5中任意一项所述方法制备得到的丝胶蛋白水凝胶以任何形态或形式存在并应用于生物医用材料。
【文档编号】C08J3/24GK103951831SQ201410071402
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】王琳, 张业顺, 黄雷, 刘佳, 王征, 李永奎, 杨文 , 乞超 申请人:华中科技大学同济医学院附属协和医院