一种天然酪蛋白多孔水凝胶材料及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医用水凝胶材料制备技术领域，具体涉及一种天然酪蛋白多孔水凝胶材料及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]作为一类重要的细胞支架材料，多孔水凝胶在组织工程领域应用广泛、发展潜力巨大。这不仅是因为水凝胶本身具有与生物组织中的细胞外基质相似的结构和亲水性，而且其多孔结构和孔连通性能够为细胞的生长、增殖、迀移以及组织生长所需营养物质与组织代谢物的传递提供有利的条件和环境。如何设计制备出生物相容性好、孔结构易于调控且孔连通性能优良的多孔水凝胶细胞支架材料，是目前生物医学工程领域的研究热点和重要课题。
[0003]迄今为止，用于多孔水凝胶的制备方法主要有发泡法、相分离法和盐析法，但基于这些方法制得的水凝胶的孔结构通常不易调控、且孔间连通性较差。相比之下，近年来出现的高内相乳液模板法，则可望为性能优良的多孔水凝胶支架材料的制备提供一条有效途径。一般而言，高内相乳液的内相体积分数可高达75%、甚至99%，通过交联固定这种乳液的连续相然后除去内相，便可获得高孔隙率的多孔材料;不仅如此，通过调节内相体积分数，还可有效控制所得水凝胶的孔隙率及孔径。然而，目前利用高内相乳液模板法制备多孔水凝胶支架的研究工作，尚存在以下主要问题:一是制备时大多使用丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯等聚合单体作为基本原材料，不仅导致所形成的水凝胶基质难以生物降解，而且易残留导致生物毒性;二是为形成有关高内相乳液模板，普遍添加了大量的有机表面活性剂作为稳定剂，致使所制备的多孔水凝胶材料的生物安全性降低。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术的不足与缺点，本发明的首要目的在于提供一种天然酪蛋白多孔水凝胶材料的制备方法，该方法以利用天然酪蛋白的自乳化能力制备的高内相乳液为模板，在连续相中加入H3C/NHS催化酪蛋白间的氨基和羧基的酰胺化交联反应。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的天然酪蛋白多孔水凝胶材料，该水凝胶材料生物相容性好、具有连通孔、孔结构和孔隙率可控。
[0006]本发明的再一目的在于提供上述天然酪蛋白多孔水凝胶材料的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]—种天然酪蛋白多孔水凝胶材料的制备方法，包含如下步骤:
[0009](I)将酪蛋白水溶液作为水相与油相混合，得到0/W高内相乳液；
[0010](2)将步骤(I)制得的0/W高内相乳液与EDC.HCl和NHS混合水溶液混合，进行酰胺化反应;然后除杂，得到酪蛋白多孔水凝胶；
[0011 ]步骤(I)中所述的酪蛋白水溶液，优选通过如下制备方法制备得到:
[0012]将酪蛋白加入水中，用碱溶液调pH至7.5?9.5，得到酪蛋白水溶液;所述的碱溶液优选为氢氧化钠溶液；
[0013]步骤(I)中所述的酪蛋白水溶液的质量分数优选为8.0%?12.5%;
[0014]步骤(I)中所述的水相和油相的体积比为(1:3)?(1:9);
[0015]步骤(I)中所述的油相为正己烷、甲苯、橄榄油中的任意一种；
[0016]步骤(I)中所述的混合优选搅拌条件下混合；
[0017]所述的搅拌的速度优选为1000rpm;
[0018]步骤(2)中所述的EDC.HCl和NHS混合水溶液中NHS、EDC.HCl与0/W高内相乳液中酪蛋白的质量比优选为9:15:50；
[0019]步骤(2)中所述的EDC.HCl和NHS混合水溶液的体积与步骤(I)中所述的的水相体积比为1:10;
[0020]步骤(2)中所述的酰胺化反应的条件优选为4?25°C反应12?48h;
[0021]步骤(2)中所述的酰胺化反应的条件进一步优选为4°C反应24h;
[0022]步骤(2)中所述的除杂的方式优选为透析或者抽提；
[0023]所述的抽提的条件优选为体积分数为60?80%的乙醇水溶液和水分别抽提12?48h；
[0024]—种天然酪蛋白多孔水凝胶材料，通过上述制备方法制备得到；
[0025]所述的天然酪蛋白多孔水凝胶材料优选具有如下特征:有连通孔、孔径分布为5?120μπι且孔隙率大于75%;
[0026]所述的天然酪蛋白多孔水凝胶材料在组织工程领域中的应用；
[0027]所述的天然酪蛋白多孔水凝胶材料不仅生物相容性好、可降解，而且其孔径及孔隙率易于调控，适合用作生物组织工程细胞支架材料；
[0028]本发明的原理:本发明以来源丰富、可再生且具优良生物安全性和可生物降解性的天然酪蛋白为基本原材料，同时在不外加有机表面活性剂情况下，利用天然酪蛋白的自乳化能力原位形成高内相乳液模板，再利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)催化酪蛋白的羧基和氨基发生酰胺化反应而使连续相内的酪蛋白交联形成三维网络结构，制备得到一种生物相容性好、具有连通孔且孔结构易调控的多孔水凝胶细胞支架材料。
[0029]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0030](I)本发明采用的主要原料为来源丰富、可再生且具优良生物安全性和可生物降解性的天然酪蛋白。
[0031](2)本发明在不外加有机表面活性剂情况下，利用天然酪蛋白的自乳化能力原位形成高内相乳液模板。
[0032](3)本发明制备的多孔水凝胶可通过油水相体积比控制孔径及孔隙率，并具有连通孔结构。
[0033](4)本发明对设备要求低，适用性广。
【附图说明】
[0034]图1是实施例1制得的高内相乳液的的宏观状态和微观形貌图。
[0035]图2是实施例1制得的酪蛋白多孔水凝胶材料的光学显微镜形貌图。
[0036]图3是实施例1制得的酪蛋白多孔水凝胶材料的宏观状态和扫描电镜图。
[0037]图4是实施例1制得的酪蛋白多孔水凝胶材料用作鼻咽上皮细胞NP69培养支架，细胞培养Sh后及24h后的细胞活/死细胞染色结果分析图；其中，A: Sh; B: 24h。
[0038]图5是实施例1制得的多孔水凝胶的细胞相容性评价分析图。
[0039]图6是实施例2制得的高内相乳液的宏观状态和微观形貌图。
[0040]图7是实施例2制得的酪蛋白多孔水凝胶材料的光学显微镜形貌图。
[0041 ]图8是实施例2制得的酪蛋白多孔水凝胶材料的宏观状态和扫描电镜图。
[0042]图9是实施例2制得的酪蛋白多孔水凝胶材料用作鼻咽上皮细胞NP69培养支架，细胞培养8小时后及24小时后的细胞活/死细胞染色结果分析图；其中，A:8h;B:24h。
[0043]图10是实施例2制得的多孔水凝胶的细胞相容性评价分析图。
[0044]图11是实施例3制得的高内相乳液的宏观状态和微观形貌图。
[0045]图12是实施例3制得的酪蛋白多孔水凝胶材料的光学显微镜形貌图。
[0046]图13是实施例3制得的酪蛋白多孔水凝胶材料的宏观状态和扫描电镜图。
[0047]图14是实施例3制得的酪蛋白多孔水凝胶材料用作鼻咽上皮细胞NP69培养支架，细胞培养8小时后及24小时后的细胞活/死细胞染色结果分析图；其中，A:8h;B:24h。
[0048]图15是实施例3制得的多孔水凝胶的细胞相容性评价分析图。
【具体实施方式】
[0049]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0050]实施例1
[0051 ] (1)0.1g酪蛋白加入水中，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，配制1wt%的酪蛋白水溶液；
[0052](2)将ImL步骤(I)制得的酪蛋白水溶液(水相)与4mL正己烷(油相)混合，在
IOOOOrpm条件下搅拌，得到0/W高内相乳液；
[0053](3)将步骤(2)制得的0/W高内相乳液与0.lmL含0.03g EDC.HCl和0.018g NHS的水溶液混合并搅拌混匀，置于4°C下反应24h，用体积分数为65%的乙醇水溶液和水分别抽提24h，得到天然酪蛋白多孔水凝胶材料；
[0054]图1A为步骤(2)制得的酪蛋白稳定的高内相乳液的宏观状态图，如图所示，为乳白色粘稠乳液;在光学显微镜下观察乳液的微观形貌，结果如图1B所示:液滴间呈密堆积，具有典型的尚内相乳液特点；
[0055]利用光学显微镜观察步骤(3)制得的天然酪蛋白多孔水凝胶材料的形貌，结果如图2所示:水凝胶具有圆形的拓扑结构，是高内相乳液模板的作用；
[0056]图3A为步骤(3)制得的天然酪蛋白多孔水凝胶材料的宏观状态图；用液氮对步骤(3)制得的水凝胶材料进行冷冻处理，真空冻干机干燥，用扫描电镜(SEM)S-4800(日本JEOL公司)观察天然酪蛋白多孔水凝胶材料的孔形貌，并测定其孔径，结果如图3B所示:水凝胶具有连通孔结构，孔径范围在5?120μπι;使用乙醇置换法测得孔隙率为82.5%；
[0057]细胞增殖观察:用KSF培养液培养ΝΡ69鼻咽上皮细胞(购自上海信裕生物技术有限公司)24小时至对数生长期，将天然酪蛋白多孔水凝胶材料置于24孔板，用聚四氟乙烯环固定;在其中接种对数生长期细胞，每孔I X 14个细胞;37°C培养8小时和24小时后，吸弃上清液，用PBS清洗2次；向板内(含ImLPBS液)加入1yL质量分数为0.01 %的AO/EB