一种用于组织填充的惰性多孔水凝胶的制备方法与流程

本发明涉及一种组织工程用填充水凝胶材料的制备方法，具体涉及基于球蛋白的新型多孔水凝胶材料的制备方法。

背景技术：

近年来，面部填充和组织填充材料的发展非常迅速，其中可分为惰性材料和非惰性材料，惰性材料由于毒性大、生物相容性差，限制了其应用范围，而非惰性材料植入皮下后往往易降解，这就使得患者需经多次填充才能达到修复的效果，不但给患者带来了疼痛，也给患者造成了不必要的经济负担。对皮肤填充剂和组织修复材料而言，降解性能是其中一项重要指标。本发明为了克服传统凝胶易降解的缺点，急需制备出了一种可用于组织填充的惰性生物多孔水凝胶，其不但可以作为永久填充材料，而且具有良好的生物相容性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以球蛋白作为主要原料的惰性组织工程用填充凝胶材料的制备方法，该方法制备工艺简单，凝胶材料的生物相容性良好，有望用于永久性整容整形及缺损性组织修复。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于组织填充的惰性多孔水凝胶的制备方法：在水溶性球形蛋白溶液中加入质量比为1:3-3:1的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷水溶液以及无机盐水溶液混合均匀，调节溶液ph值为2-5.5，置于水浴环境中进行交联反应得含盐水凝胶，然后对交联后凝胶进行两次高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤，除去无机盐和残留的单体交联剂，并进行真空冷冻干燥和co-60灭菌处理，即获得可用于组织填充的惰性多孔水凝胶。

上述的水溶性球形蛋白选自牛血清白蛋白（bsa）和人血清白蛋白（hsa），其浓度为50-400mg/ml。

所述的无机盐选自氯化钠、磷酸钠、磷酸氢钠、硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾、硫酸钾、氯化钾，其浓度为10-350mg/ml，加入体积与水溶性球形蛋白溶液体积的比为1:2~1:20。

所述交联剂β-二亚胺锌配合物溶液和1,2,7,8-二环氧辛烷溶液的质量百分比浓度均为0.1-5.0%，优选0.5-2.0%，体积均为蛋白溶液体积的1-20%，优选5-10%。

反应液酸碱度用盐酸和氢氧化钠溶液调控其ph值为2-5.5；交联反应的温度可为40-80℃，保持时间0.5-5h，优选1-3h。

上述两次高压蒸汽处理和蒸馏水浸泡洗涤中，第一次将样品在110-121℃下保持时间5-30min，优选保持时间10-20min，然后超纯水浸泡洗涤2-5天；第二次将样品在110-121℃保持1-3h，优选保持时间1.5-2.5h，然后超纯水浸泡洗涤1-3天，控制交联剂的残留总量低于2μg/g。

上述交联剂β-二亚胺锌配合物依据文献（catalyticreactionsinvolvingc1feedstocks:newhigh-activityzn(ii)-basedcatalystsforthealternatingcopolymerizationofcarbondioxideandepoxides,j.am.chem.soc.1998,120,11018-11019.）的方法合成获得，其分子式如图1所示。

本发明惰性多孔水凝胶的形成机理：蛋白质分子含有丰富的羧基和氨基，为分子间交联提供了两种好的功能基团。β-二亚胺锌配合物分子内螯合锌的空轨道可与蛋白分子中的氨基形成配位键，实现蛋白质分子的分子间交联。β-二亚胺锌配合物对环氧烷基具有不对称开环催化功能，可加速1,2,7,8-二环氧辛烷的分子两端环氧烷基开环并与蛋白分子中的羧基形成共价键，实现蛋白质分子的分子间交联。故通过β-二亚胺锌配合物对1,2,7,8-二环氧辛烷的开环催化，及两种交联剂对蛋白质的分子间不同基团间的双交联作用，有效实现和强化了水溶性蛋白分子间的交联。无机盐的加入，有效地破坏了蛋白质的分子外水化膜，促进了交联剂与蛋白质分子之间的交联反应，此外适量无机盐还兼扮演了成孔剂作用，进一步优化了水凝胶的成孔效果。

本发明具有以下优点：

第一，采用无毒性的球蛋白作为原料，制备出了一种长效性的可用于组织填充的惰性多孔水凝胶；

第二，制备工艺上采用双功效交联剂不仅实现了多功能基团的共交联，交联剂间还有相互促进功效；无机盐的使用进一步强化了分子交联反应，并促进多孔的形成；

第三，本发明采用高温热变性法（110-121℃）和真空冷冻干燥法，保障了凝胶材料的性能和形状，且满足临床上不同的需要；

第四，生物相容性好，与细胞有较好的粘附性，利于细胞的代谢增殖与分化。

附图说明

图1为β-二亚胺锌配合物的分子结构图；

图2为实施例1中采用不同的模具制备的不同形状的凝胶图；

图3为实施例1所制备的多孔水凝胶的sem图；

图4为实施例1所制备的凝胶样品的应变-应力曲线图；

图5为实施例1所制备的凝胶浸提液对细胞的毒性结果图；

图6为实施例1所制备的凝胶与细胞共培养sem图；

图7为实施例1所制备的凝胶植入皮下实验图及从皮下取出后的sem分析图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1水凝胶的制备

步骤一：将一定量bsa溶于10ml蒸馏水得到浓度为100mg/ml的溶液，加入浓度均为1%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各2ml，再加入10mg/ml的nacl溶液2ml，混合均匀，并用稀盐酸调节溶液ph为4；

步骤二：将步骤一中的混合溶液分装于模具中，在50℃环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于121℃保持20min获得凝胶初品；

步骤三：将步骤二中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留单体交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持2h后，再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，除去残留交联剂，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

步骤四：将步骤三中的湿凝胶进行真空冷冻干燥处理，并以≥25kgy的照射剂量进行co-60辐照灭菌，即得可用于组织填充的惰性多孔水凝胶。

本实例制备的凝胶填充材料可以根据不同的需要制备成不同的形状，只需要相应的模具即可，如图2为采用不同的模具制备的不同形状的凝胶图。图3为实施例1所制备的多孔水凝胶的sem图，可见水凝胶的微观形貌为多孔结构，孔壁为球形颗粒相互粘连而成，孔径一般在几十纳米到几个微米不等，孔结构较为均匀且致密贯通。图4为本实例中制备的凝胶样品的机械性能测试结果，在压缩应变为50%的条件下，压缩应力可达3-6mpa,而普通水凝胶同等条件下一般仅为几十到几百kpa，这说明本发明制备的样品具有良好的弹性性能，适合用于缺损组织填充。

实施例2水凝胶的制备

步骤一：将一定量bsa溶于10ml蒸馏水得到浓度为200mg/ml的溶液，加入浓度均为2%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各2ml，再加入50mg/ml的kcl溶液4ml，混合均匀，并用稀盐酸调节溶液ph为2.8；

步骤二：将步骤一中的混合溶液分装于模具中，在60℃环境下保持2h后转入高压蒸汽灭菌锅内于110℃保持20min获得凝胶初品；

步骤三：将步骤二中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留单体交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持2h后，再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，除去残留交联剂，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

步骤四：将步骤三中的湿凝胶进行真空冷冻干燥处理，并以≥25kgy的照射剂量进行co-60辐照灭菌，即得可用于组织填充的惰性多孔水凝胶。

该实施例中所得的多孔水溶胶与实施例1中所得多孔水溶胶理化性能相似。

实施例3水凝胶的制备

步骤一：将一定量hsa溶于10ml蒸馏水得到浓度为400mg/ml的溶液，加入浓度均为2%的交联剂β-二亚胺锌配合物和1,2,7,8-二环氧辛烷各4ml，再加入100mg/ml的nacl溶液2ml，混合均匀，并用稀盐酸调节溶液ph为5；

步骤二：将步骤一中的混合溶液分装于模具中，在70℃环境下保持1h后转入高压蒸汽灭菌锅内于121℃保持10min获得凝胶初品；

步骤三：将步骤二中的初品凝胶用蒸馏水浸泡洗涤5天，每6h换一次洗涤水，除去盐分和残留单体交联剂；将洗涤后的初品凝胶转移至高压蒸汽灭菌锅中继续121℃保持1.5h后，再次用蒸馏水浸泡洗涤2天，除去残留交联剂，控制交联剂的残留总量低于2μg/g，获得多孔湿凝胶样品；

步骤四：将步骤三中的湿凝胶进行真空冷冻干燥处理，并以≥25kgy的照射剂量进行co-60辐照灭菌，即得可用于组织填充的惰性多孔水凝胶。

该实施例中所得的多孔水溶胶与实施例1中所得的多孔水溶胶理化性能相似。

实施例4水凝胶生物的细胞毒性检测

步骤一：实施例1惰性多孔水凝胶经钴60辐射灭菌后，向样品中加入15mlα-mem完全培养液，37℃恒温箱中浸提72h，制得0.1g/ml的材料浸提液；

步骤二：取96孔板，设置空白对照组及试验组，每组设6孔做水平对照，于每孔中加入100µl浓度为1×10⁶/ml的mc3t3-e1细胞悬浮液，置于二氧化碳培养箱中培养，24h后，吸弃原培养液，空白对照组加入新鲜培养液，实验组加入步骤一所得的材料浸提液，每孔100μl，置于二氧化碳培养箱继续培养72h。期间更换一次培养液，72h后，显微镜下观察细胞形态；

步骤三：对步骤二中的孔板的每孔加入cck-8溶液20μl，在37℃下二氧化碳培养箱中孵育4h，之后取出，使用酶标仪于450nm处测定吸光值。

图5为实施例1所制备的凝胶浸提液对细胞的毒性实验图。从5图可以看出，当细胞用浸提液培养24h时，对照组细胞活性可达到90%而实验组细胞活性约为80%（对照组和实验组毒性等级均为1级（分级标准参考表1细胞相对增殖率与细胞毒性评分标准）），但当培养48h和72h后，实验组和对照组的细胞活性均可达到100%（毒性等级1级），这说明本发明制备的凝胶细胞相容性良好，细胞活性在24h时之所以较低，可能是因为细胞对凝胶的浸提液有一个适应的过程，一旦适应了之后，细胞就可实验快速的生长增殖。

实施例5水凝胶与细胞共培养

步骤一：将实施例1惰性多孔水凝胶，用刀片切成底面直径为10mm，高约为3mm的小圆片，之后将其放入48孔板中，封口，进行钴60辐射灭菌；

步骤二：将步骤一中灭菌后的样品材料带入生物安全柜，于每孔内加入1mlα-mem完全培养液，放入co2培养箱内静置24h，使培养液浸透整个支架材料，吸弃培养液；

步骤三：吸取备好的浓度为1×10⁶/ml，体积为50µl的mc3t3-e1细胞悬浮液轻轻的加在步骤二中预浸泡的48孔板中样品材料的表面，之后将孔板置于二氧化碳培养箱中培养，待4h后，每个样品补加1ml的mem培养液，此后每天换液，待样品与细胞共培养一定时间后，取出做实验分析。

图6为凝胶材料上种植细胞24h、36h和48h后细胞的生长情况图。经过24h后细胞已经贴附生长在材料表面，36h和48h后细胞在材料表面快速生长增殖，48h已经完全覆盖在材料表面。这说明本发明制备的凝胶材料有良好的细胞相容性，适合细胞在凝胶材料上生长增殖代谢。

实施例6水凝胶的皮下植入实验

步骤一：将实施例1惰性多孔水凝胶，用刀片切成底面直径为10mm，高约为2mm的小圆片，密封，进行钴60辐射灭菌；

步骤二：使用速眠新麻醉剂对新西兰兔耳静脉注射，使其麻醉，之后将其固定于手术台上，无菌纱布覆盖兔子背部裸露皮肤外其他部位，经安尔碘消毒后，观察兔子背部的毛细血管(注意避开毛细血管进行切口)，在合适位置轻轻的用手夹起兔子皮肤，然后使用手术刀片轻轻的划开一个长约10mm的小口，用镊子夹起准备好的样品支架材料，轻轻放入皮下，尽可能使植入的材料离切口处的距离大于5mm，之后用皮针缝合伤口，安尔碘再次消毒。之后，每天观察兔子的运动进食等情况，观察兔子的背部是否有红肿、化脓等现象；

步骤三：对步骤二中实验兔饲养了2、8、20和40周后，通过注射过量麻醉剂的方法分别处死，取其背部材料及周围皮肤，检测材料的炎症反应和降解情况。

图7为凝胶材料上植入兔子皮下2周、8周、20周和40周的材料及材料周围组织图，其中分别展示了样品植入兔子皮下2周和40周，取出样品后所拍摄的扫描电镜图。当凝胶植入兔子皮下2周后，发现材料周围已经有新血管生成，皮下植入的材料经过40周后基本无明显的降解现象，且未发现明显的炎症或排异现象。这表明凝胶作为填充材料植入皮下后与体内组织有良好的生物相容性，且很难被降解，不会与组织产生免疫排斥反应。通过材料植入后的sem图（图7中）与植入前的sem图比较可知，凝胶材料植入皮下40周内部结构也未发生变化，进一步说明本发明制备的凝胶可作为体内的永久填充材料。

实施例7不同交联方式制备多孔水凝胶的对比实验

步骤一：重复实施实例1实验过程，仅将反应中的两种交联剂改为一种交联剂β-二亚胺锌配合物，所制备的水凝胶质地柔软，通过力学性质检测发现其弹性模量约595pa，不再具备实施实例1中水凝胶所具备的良好的力学性能，其吸水溶胀性能和可复原性能大大减弱，降解时间大幅缩短；

步骤二：重复实施实例1实验过程，仅将反应中的两种交联剂改为一种交联剂1,2,7,8-二环氧辛烷，获得的水凝胶抗压强度较小，其弹性模量约为698kpa，降解时间较短。

上述实验表明，仅改变复合交联剂为其中的任意一种，所得到的水凝胶不再具有原来的优异机械力学特性和耐降解能力，说明实施实例1中的交联实验方案具有好的创新性。