一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法。白蜡、硅树脂、盐水袋、硅凝胶等皮肤填充材料均存在对组织产生慢性炎症、肿块以及损伤组织的缺陷，生物相容性差，无法满足修复要求。本发明向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，搅拌反应，加入透明质酸溶液，搅拌反应，加入交联剂溶液，搅拌反应；恒温水浴加热制得水凝胶；类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白。本发明的水凝胶，采用自组装和物理/化学交联两种方法制成，具有稳定性良好、生物学效价高、可避免外科手术的创伤和减少病人的疼痛的优点，从而真正实现皮肤填充的优势。
【专利说明】一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种水凝胶，具体涉及一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]水凝胶是一种高分子网络体系，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。人体面部美容整形主要有修正皱纹、改善面部轮廓、填平凹陷瘢痕或唇部、修复受伤的组织等，适合人体组织结构，其要求水凝胶不吸收、不脱落、不碎裂，在弥散的环境下能很好地保持水分，有较好的粘度、弹性和柔软度。当水凝胶被移植到生物体后，由于组织损伤程度不同，很难满足修复的效果；当水凝胶注射到生物体后，如果水凝胶是环境敏感型的，比如温度敏感型，在室温下呈溶胶状，当温度达到人体温度后，水凝胶能形成凝胶，能维持形态且具有良好的生物相容性。因此，可注射式水凝胶作为组织填充材料，其研究、发展和应用具有不可估量的市场前景。制备水凝胶常用的方法有化学交联和物理交联两种。自组装技术在生物材料领域逐渐成为研究的热点，可以通过生物分子之间的特异性生物作用力，疏水之间的相互作用，氢键相互作用以及静电相互作用由简单到复杂，无序到有序的自发过程。因此，采用类人胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸为原料，应用自组装和化学/物理交联技术来制备水凝胶，成功应用于组织修复材料。
[0003]水凝胶的发展历经了以下三个发展阶段:第一代产品以白蜡注射、脂肪移植、硅树月旨、塑料海绵等；第二代产品以凝胶植进体为主，如盐水袋、硅凝胶、假体等。以上两类产品均存在对组织产生慢性炎症、肿块以及损伤组织的缺陷，而且凝胶与组织没有良好的生物相容性，因此不能充分满足 机体的要求。第三代产品可注射水凝胶作为一种优良的填充材料也得到了一定程度的发展，虽然克服了组织损伤的缺点，但其亦不能做到完全满足修复的要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用作皮肤填充材料的水凝胶及其制备方法，结合自组装和物理/化学交联两种方法制备更具生物相容性、安全性更高的皮肤填充材料。
[0005]本发明所采用的技术方案是:
一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法，其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:称取类人胶原蛋白溶于双蒸水中，然后向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，令类人胶原蛋白与壳聚糖的质量比为(I~6):5，反应温度控制为-4~0°C，在搅拌条件下反应0.5~Ih ;
步骤二:加入透明质酸溶液，透明质酸与壳聚糖的质量比为(0.1~0.4):1，反应温度控制为20~30°C，在搅拌条件下反应0.2~0.5h ;
步骤三:加入交联剂溶液，交联剂与壳聚糖的质量比是(6~8):1，反应温度控制为-4~O °C，在搅拌条件下反应0.5~Ih;
步骤四:将反应液放于37°C恒温水浴锅中lh，制得水凝胶。
[0006]步骤一中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白。
[0007]步骤一中，壳聚糖为脱乙酰度为90%以上的壳聚糖，质量体积分数为40mg/mL。
[0008]步骤二中，透明质酸为医用级别的透明质酸，分子量为lOOOOOODa，透明质酸溶液的质量分数为2%。
[0009]步骤三中，交联剂为甘油磷酸纳、α-甘油磷酸钠或α，β-甘油磷酸纳，交联剂溶液的质量分数为40%。
[0010]所述的一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法制备的水凝胶。
[0011]本发明具有以下优点:
本发明所涉及的一种用作皮肤填充材料的水凝胶，是将壳聚糖、透明质酸和类人胶原蛋白结合起来制成的皮肤填充材料，以基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸为原料，采用自组装和物理/化学交联两种方法制成，具有稳定性良好、生物学效价高、可避免外科手术的创伤和减少病人的疼痛的优点，从而真正实现皮肤填充的优势，而且水凝胶随温度变化实现溶胶-凝胶的转变过程，最终达到增强皮肤弹性和美容的目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为水凝胶的红外光谱图。
[0013]图中，横轴为波数(cnT1)，纵轴为透过率(％)，1号线为β_甘油磷酸纳曲线，2号线为透明质酸曲线，3号线为水凝胶曲线，4号线为类人胶原蛋白曲线，5号线为壳聚糖曲线。
[0014]图2为水凝胶的X射线光电子能谱图。
[0015]图中，横轴为结合能(eV)，纵轴为计数(s)，l号线为甘油磷酸纳曲线，2号线为水凝胶曲线，3号线为透明质酸曲线，4号线为壳聚糖曲线，5号线为类人胶原蛋白曲线。
[0016]图3为水凝胶的样品图。
[0017]图中，A、B、C为自组装纤维的照片图，D为水凝胶的溶胶图，E为水凝胶的呈胶图，F为水凝胶的照片图。
[0018]图4为自组装纤维和水凝胶的扫描电镜图。
[0019]图中，I号为水凝胶的扫描电镜图(放大250倍)，2号为水凝胶的扫描电镜图(放大100倍)，3号为混合纤维的扫描电镜图(放大250倍)，4号为混合纤维的扫描电镜图(放大100 倍)。
[0020]图5为水凝胶注射于小鼠皮下图。
[0021]图中，A为注射于小鼠皮下一周后的图，B为注射于小鼠皮下2周后的图，C为注射于小鼠皮下6周后的图，D为注射于小鼠皮下10分钟后的图，E为注射于小鼠皮下10分钟后取出的水凝胶的图，F为水凝胶从离心管中取出的图，G为水凝胶在离心管中成胶的图。
[0022]图6为水凝胶注射于小鼠皮下后的透射电镜图。
[0023]图中，A (第一周)、B (第二周)、C (第六周)为对照组(注射生理盐水)的透射电镜图，实施例1 (D、G、J、M)，实施例2 (E、H、K、N)，实施例3 (F、1、L、0)为水凝胶的透射电镜图。注射于小鼠皮下后分别在第1、2、6、12周取样，D、E、F为第一周，G、H、I为第二周，J、K、L为第三周，Μ、Ν、0为第四周。图中I代表胶原纤维，2代表巨噬细胞，3代表中性粒细胞，4代表成纤维细胞，5代表纤维细胞，6代表脂滴，7代表细胞体，8代表炎症细胞。
[0024]图7为水凝胶注射于小鼠皮下后的免疫组化图。
[0025]图中，A (第一周)、B (第二周)、C (第六周)、D (第十二周)为对照组(没有加⑶68单克隆抗体染色)的免疫组化图，实施例1 (E、F、G、H)、实施例2 (1、J、Q、L)、实施例3 (M、Ν、0、Ρ)为水凝胶(加CD68单克隆抗体染色)的免疫组化图。注射于小鼠皮下后分别在第1、
2、6、12周取样，E、1、M为第一周，F、J、N为第二周，G、Q、0为第六周，H、L、P为第十二周。T代表组织，G代表水凝胶，g-t代表组织与水凝胶界面，FC代表脂肪细胞，PC代表色素细胞。
[0026]图8为水凝胶注射于小鼠皮下后的H&E染色图。
[0027]图中，实施例1 (A、E、1、J)、实施例2 (B、F、G、K)、实施例3 (C、D、H、L)为水凝胶的H&E染色图。注射于小鼠皮下后分别在第1、2、6、12周取样，A、B、C为第一周，E、F、D为第二周，1、G、H为第六周，J、K、L为第十二周。
[0028]图9为本发明反应原理过程图。
【具体实施方式】
[0029]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0030]本发明所涉及的一种用作皮肤填充材料的水凝胶，以基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸为原料，采用自组装技术形成自组装纤维，然后通过交联剂进行化学交联，再在-4°C搅拌下进行物理交联，反应结束后，将反应液放入37°C下静态放置10-30分钟， 制备得到水凝胶。
[0031]原料中的类人胶原蛋白采用的是由基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白，与来自动物源提取的胶原蛋白相比，其具有水溶性好、低排异反应、无病毒隐患，结构与人体自身胶原蛋白极其接近的显著优点。另外，动物源胶原蛋白也可作为原料制造水凝胶。壳聚糖本身具有良好的生物相容性和可降解性，可应用于组织工程领域。透明质酸可直接通过交联剂制备水凝胶用于注射填充，其具有良好的生物相容性，但是其降解比较快。
[0032]并且，类人胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸本身具有良好的生物相容性和可降解性，其本身没有温度敏感的性质，通过自组装技术和化学/物理交联制备得到的水凝胶具有温度敏感性，在室温下呈溶胶状，即可以注射到要填充部位，当水凝胶在人体温度环境下自发形成凝胶，其稳定性高，不吸收，不脱落，不碎裂，有较好的粘度，弹性和柔软度，且有良好的生物相容性，适合用于组织填充。
[0033]具体制备方法如下:
步骤一:称取类人胶原蛋白溶于双蒸水中，然后向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，令类人胶原蛋白与壳聚糖的质量比为(I~6):5，反应温度控制为-4~0°C，在搅拌条件下反应0.5~lh。
[0034]其中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白；壳聚糖为脱乙酰度为90%以上的壳聚糖，质量体积分数为40mg/mL。
[0035]步骤二:加入透明质酸溶液，透明质酸与壳聚糖的质量比为(0.1~0.4):1，反应温度控制为20~30°C，在搅拌条件下反应0.2~0.5h。
[0036]其中，透明质酸为医用级别的透明质酸，分子量为lOOOOOODa，透明质酸溶液的质量分数为2%。
[0037]上述类人胶原蛋白、壳聚糖和透明质酸三种聚合物混合后，其水体系在溶液中能够自发的通过自组装形成混合纤维，其驱动力是多聚阳离子和多聚阴离子通过静电吸附相互作用、氢键相互作用以及疏水相互作用，各共聚物的水体系单独不具有热敏凝胶化的性质，同时本身在1_50°C范围内只能溶解于水中。
[0038]步骤三:加入交联剂溶液，交联剂与壳聚糖的质量比是(6~8):1，反应温度控制为-4~O °C，在搅拌条件下反应0.5~Ih。
[0039]其中，交联剂为甘油磷酸纳、α-甘油磷酸钠或α，甘油磷酸纳，交联剂溶液的质量分数为40%。
[0040]加入交联剂进行化学交联，在-4~O°C条件下搅拌进行物理交联(冰冻-解冻过程实现)，即采用物理/化学结合交联的方法进行联合反应。反应后的水体系具有温度相应性，即在体温下可自发形成水凝胶。
[0041]步骤四:将反应液放于37°C恒温水浴锅中lh，制得水凝胶。
[0042]实施例1:
步骤一:称取类人胶原蛋白溶于双蒸水中，然后向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，令类人胶原蛋白与壳聚糖的质量比为1:5， 反应温度控制为-4°C，在搅拌条件下反应
0.5h0
[0043]其中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白；壳聚糖为脱乙酰度为90%以上的壳聚糖，质量体积分数为40mg/mL。
[0044]步骤二:加入透明质酸溶液，透明质酸与壳聚糖的质量比为0.1:1，反应温度控制为20°C，在搅拌条件下反应0.2h。
[0045]其中，透明质酸为医用级别的透明质酸，分子量为lOOOOOODa，透明质酸溶液的质
量分数为2%。
[0046]步骤三:加入交联剂溶液，交联剂与壳聚糖的质量比是6:1，反应温度控制为_40°C，在搅拌条件下反应0.5h。
[0047]其中，交联剂为β -甘油磷酸纳，交联剂溶液的质量分数为40%。
[0048]步骤四:将反应液放于37°C恒温水浴锅中lh，制得水凝胶。
[0049]实施例2:
步骤一:称取类人胶原蛋白溶于双蒸水中，然后向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，令类人胶原蛋白与壳聚糖的质量比为3:5，反应温度控制为-2°C，在搅拌条件下反应
0.5h0
[0050]其中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白；壳聚糖为脱乙酰度为90%以上的壳聚糖，质量体积分数为40mg/mL。
[0051]步骤二:加入透明质酸溶液，透明质酸与壳聚糖的质量比为0.2:1，反应温度控制为25 °C，在搅拌条件下反应0.3h。
[0052]其中，透明质酸为医用级别的透明质酸，分子量为lOOOOOODa，透明质酸溶液的质
量分数为2%。
[0053]步骤三:加入交联剂溶液，交联剂与壳聚糖的质量比是7:1，反应温度控制为-2 °C，在搅拌条件下反应0.5h。[0054]其中，交联剂为α -甘油磷酸钠，交联剂溶液的质量分数为40%。
[0055]步骤四:将反应液放于37°C恒温水浴锅中lh，制得水凝胶。
[0056]实施例三:
步骤一:称取类人胶原蛋白溶于双蒸水中，然后向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，令类人胶原蛋白与壳聚糖的质量比为6:5，反应温度控制为0°C，在搅拌条件下反应lh。
[0057]其中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白；壳聚糖为脱乙酰度为90%以上的壳聚糖，质量体积分数为40mg/mL。
[0058]步骤二:加入透明质酸溶液，透明质酸与壳聚糖的质量比为0.4:1，反应温度控制为30°C，在搅拌条件下反应0.5h。
[0059]其中，透明质酸为医用级别的透明质酸，分子量为lOOOOOODa，透明质酸溶液的质
量分数为2%。
[0060]步骤三:加入交联剂溶液，交联剂与壳聚糖的质量比是8:1，反应温度控制为0°C，在搅拌条件下反应lh。
[0061]其中，交联剂为α，β -甘油磷酸纳，交联剂溶液的质量分数为40%。
[0062]步骤四:将反应液放于37°C恒温水浴锅中lh，制得水凝胶。
``[0063]对以上实施例的产物进行红外光谱分析、X射线光电子能谱、扫描电镜分析、样品观察、透射电镜分析、免疫组化分析和H&E染色分析，其分析结果如下:
1、水凝胶填充材料的红外光谱分析如图1所示，与纯的类人胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸的C=O吸收峰(1644 cm-1,1644 cm-1,1646 cnT1)相比，水凝胶的C=O (1619CHT1)吸收峰发生蓝移，且在1413 cnT1处有新的吸收峰，是酰胺键(-RC0NHR’ )的C-N伸缩振动的吸收峰。在水凝胶光谱图中，1619 cnT1和2625 cnT1处吸收峰是新生成的铵盐(-RNH2+)的吸收峰。
[0064]2、水凝胶填充材料的X射线光电子能谱分析如图2所示，在N谱中，399.31eV处有新的N结合能生成。在C谱中，在287.85eV处C结合能与纯壳聚糖相比减小，与纯透明质酸相比增加；在286.2eV处C结合能与纯壳聚糖和透明质酸相比均减小。从而证明有新的酰胺键(-RC0NHR’ )和铵盐(-RNH2+)生成。
[0065]3、水凝胶填充材料的样品如图3所示，自组装纤维呈有规则的排布。水凝胶在室温条件下呈溶胶，在体温条件下形成凝胶，而且呈类似于果冻状的乳白色凝胶。
[0066]4、水凝胶填充材料的扫描电镜分析如图4所示，自组装纤维呈有规则的排布。水凝胶呈三维网络状的多孔结构，排布比较规整。
[0067]5、水凝胶填充材料注射于小鼠皮下分析如图5所示，在第一周水凝胶存在于小鼠皮下；第二周水凝胶存在于小鼠皮下，略微有些降解；第六周水凝胶残留小部分，大部分已经降解完。水凝胶填充材料注射于小鼠皮下10分钟取出后与从试管中取出后相比，都成乳白色的类似于果冻状的水凝胶。
[0068]6、水凝胶填充材料注射于小鼠皮下后的透射电镜分析如图6所示，实施例一、二和三制备出的水凝胶有胶原纤维和细胞体，与空白对照组(A、B、C)的分析结果一样，组织相容性良好。
[0069]7、水凝胶填充材料的注射于小鼠皮下后的免疫组化分析如图7所示，实施例一、二和三制备出的水凝胶，炎症反应最小。
[0070]8、水凝胶填充材料的注射于小鼠皮下后的H&E染色分析如图8所示，实施例一、二和三制备出的水凝胶，可降解且速率比较慢。
[0071]本发明制得的水凝胶填充材料用于成年雌性ICR小鼠的动物实验表明:用自组装和物理/化学交联法制备出的水凝胶，具有较好的生物相容性和组织相容性，且降解慢，适合用于组织填充。
[0072]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效``的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【权利要求】
1.一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法，其特征在于: 由以下步骤实现: 步骤一:称取类人胶原蛋白溶于双蒸水中，然后向类人胶原蛋白溶液中加入壳聚糖溶液，令类人胶原蛋白与壳聚糖的质量比为(I~6):5，反应温度控制为-4~0°C，在搅拌条件下反应0.5~Ih ; 步骤二:加入透明质酸溶液，透明质酸与壳聚糖的质量比为(0.1~0.4):1，反应温度控制为20~30°C，在搅拌条件下反应0.2~0.5h ; 步骤三:加入交联剂溶液，交联剂与壳聚糖的质量比是(6~8):1，反应温度控制为-4~O °C，在搅拌条件下反应0.5~Ih; 步骤四:将反应液放于37°C恒温水浴锅中lh，制得水凝胶。
2.根据权利要求1所述的一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法，其特征在于: 步骤一中，类人胶原蛋白为基因工程菌BL21高密度发酵生产的类人胶原蛋白。
3.根据权利要求2所述的一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法，其特征在于: 步骤一中，壳聚糖为脱乙酰度为90%以上的壳聚糖，质量体积分数为40mg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法，其特征在于: 步骤二中，透明质酸为医用级别的透明质酸，分子量为lOOOOOODa，透明质酸溶液的质量分数为2%。
5.根据权利要求4所述的一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法，其特征在于: 步骤三中，交联剂为甘油磷酸纳、α-甘油磷酸钠或α，甘油磷酸纳，交联剂溶液的质量分数为40%。
6.如权利要求5所述的一种用作皮肤填充材料的水凝胶的制备方法制备的水凝胶。
【文档编号】C08L89/00GK103755981SQ201410015731
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月14日 优先权日:2014年1月14日
【发明者】李贤 , 范代娣, 马晓轩 申请人:西北大学