一种卤代修饰胞苷素的制备方法
【专利摘要】一种卤代修饰胞苷素，为侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素，其制备方法包括：以不吸水链霉菌为出发菌，在培养基中发酵培养，分离和纯化后再经化学修饰得到。该修饰胞苷素具有更高的生物抗性和结构稳定性，该制备工艺化学选择性好，工艺条件温和，生产过程环境友好。
【专利说明】一种卤代修饰胞苷素的制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明属于微生物农药【技术领域】，涉及一种卤代修饰胞苷素的制备方法。
【背景技术】:
[0002]农用抗生素(agricultural antibiotics),简称农抗,是指由微生物发酵产生、具有农药功能、用于农业上防治病虫草鼠等有害生物的次生代谢产物。与一般化学合成农药相比，农用抗生素具有以下特点:①结构复杂活性高、用量小、选择性好；③易被生物或自然因素所分解，不在环境中积累或残留；④生产原料为淀粉、糖类等农产品，属于再生性能源采用发酵工程生产，同一套设备只要改变菌种即可生产不同的抗生素，生产菌大多是土壤中的放线菌，也有真菌和细菌。
[0003]核苷类抗生素为一类重要的抗生素，它们是一大类对核苷和核苷酸结构修饰的化合物，以核苷为其共同的母核，有抗细菌、抗真菌、抗锥虫、抗肿瘤、锄草、杀虫、增强免疫力等较广范围的生物活性。不同的核苷类抗生素的差异在于母核以外的侧链基团。农业上应用的核苷类抗生素主要有杀稻痕菌素S (Blasticidin S)和多氧霉素(Polyoxins)。修饰胞苷素为侧链为-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。
[0004]迄今为止，已经从各种生物(包括细菌、真菌、各类植物)中分离出3800多种卤化物，约95%的卤化物为氯化和溴化物，氟化和碘化物很少，少数化合物既含氯也含碘。许多卤化物，如氯霉素(chloramphenicol)、7_氯四环素(7-chlotetracycline)、万古霉素(vancomycin)等都是重要的抗生素。虽然卤素原子的类型、数量以及位置对化合物生物活性的影响没有特定的规律， 但是某些卤化物与相应的非卤化物相比，卤化可以增强其生物活性。如，2-氯硝吡咯菌素的抗真菌活性只有硝吡咯菌素(含有两个氯原子)的10% ;与其含氯衍生物相比，不含氯的蝴蝶霉素没有抗菌活性。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的是提供一种卤代修饰胞苷素的制备方法。
[0006]本发明通过下述方法实现的:一种卤代修饰胞苷素的制备方法，1、一种卤代修饰胞苷素的制备方法，
[0007](I)以不吸水链霉菌为出发菌,在培养基中发酵培养，
[0008](2)分离、纯化发酵液，
[0009](3)发酵产物经分离纯化后通过FeCl3配位催化卤代反应进行化学修饰得到侧链为-C4H8ClO9的氮取代胞苷素；
[0010]菌株:以吸水链霉菌海南变种SlOl菌株经自然分离后获得的S510菌株为出发菌株。
[0011]培养基:玉米粉15~25g、豆饼粉20~35g、葡萄糖15~25g、淀粉8~12g、氯化铵I~5g、碳酸钙I~5g，硫酸镁0.1~0.5，硫酸亚铁0.1~0.5，氯化钠0.1~0.5g，磷酸氢二钠0.1~0.5g,加自来水至1000mL。经121 °C高压湿热灭菌20min。[0012]发酵培养:摇床震荡培养，转速为150~250转/分钟，发酵温度:25~35°C，罐压
0.01~0.15MPa，通气量1:0.5~I，发酵时间50~100h。
[0013]发酵产物分离和纯化:发酵液萃取，用Sephadex G_25柱层析，水洗脱，洗脱液经HPLC检测后(C0SM0SILC18Econopak柱，流动相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外检测波长220nm)，将其中保留时间约为5.5min的主要组分含量在75~85%和60~75%的部分分别合并，再经真空冷冻干燥后即可得到初次分离物。含量在60~75%的初提物再经一次常压柱层析，即可将纯度提高到80~85%，合并两次所得的含量在75%以上的样品，用HPLC半制备柱进彳丁制备,最后可得到纯度为90.12%的精品。将精品溶液冷干后，所得微黄色粉末即为侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。
[0014]化学修饰:发酵产物分离纯化后和KCl反应，以正丁醇为溶剂，FeCl3为催化剂，通过配位催化卤代反应来制备带侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。
[0015]本发明的修饰胞苷素具有更高的生物抗性和结构稳定性，该制备工艺化学选择性好，工艺条件温和，生产过程环境友好。所得侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素效价为2800 μ g/L，侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素效价为6418 μ g/L。基于上述优点，本发明的带侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素将在生物农药领域中发挥重要的作用，应用前景广阔。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。
[0017]实施例1 [0018]菌株:以吸水链霉菌海南变种SlOl菌株经自然分离后获得的S510菌株为出发菌株。
[0019]培养基:玉米粉20g、豆饼粉25g、葡萄糖18g、淀粉10g、氯化铵3g、碳酸钙3g，硫酸镁0.3，硫酸亚铁0.3，氯化钠0.3g，磷酸氢二钠0.3g，加自来水至1000mL。经121 °C高压湿热灭菌20min。
[0020]发酵培养:摇床震荡培养，转速为220转/分钟，发酵温度:28°C，罐压0.12MPa，通气量1:0.5，发酵时间72h。
[0021]发酵产物分离和纯化:发酵液萃取，用S^hadex G_25柱层析，水洗脱，洗脱液经HPLC检测后(C0SM0SILC18Econopak柱，流动相0.03%三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外检测波长220nm)，将其中保留时间约为5.5min的主要组分含量在75~85%和60~75%的部分分别合并，再经真空冷冻干燥后即可得到初次分离物。含量在60~75%的初提物再经一次常压柱层析，即可将纯度提高到80-85%，合并两次所得的含量在75%以上的样品，用HPLC半制备柱进行制备，最后可得到纯度为90.12%的精品。将精品溶液冷干后，所得微黄色粉末即为侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。
[0022]化学修饰:发酵产物分离纯化后和KCl反应，以正丁醇为溶剂，FeCl3为催化剂，通过配位催化卤代反应来制备带侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。反应条件为:侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素:KCl:FeCl3(摩尔比)=20:40:3，溶剂正丁醇的用量为每摩尔侧链-C4H9O9的氮取 代胞苷素40ml，反应温度为120°C，收率为91%。
[0023]实施例2[0024]菌株:以吸水链霉菌海南变种SlOl菌株经自然分离后获得的S510菌株为出发菌株。
[0025]发酵培养基:玉米粉25g、豆饼粉35g、葡萄糖15g、淀粉12g、氯化铵5g、碳酸钙5g，硫酸镁0.1，硫酸亚铁0.1，氯化钠0.lg，磷酸氢二钠0.5g，加自来水至1000mL。经121°C高压湿热灭菌20min。
[0026]发酵培养:摇床震荡培养，转速为250转/分钟，发酵温度:25°C，罐压0.15MPa，通气量1:0.5，发酵时间64h。
[0027]发酵产物分离和纯化:发酵液萃取，用S^hadex G_25柱层析，水洗脱，洗脱液经HPLC检测后(C0SM0SILC18Econopak柱，流动相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外检测波长220nm)，将其中保留时间约为5.5min的主要组分含量在75~85%和60~75%的部分分别合并，再经真空冷冻干燥后即可得到初次分离物。含量在60~75%的初提物再经一次常压柱层析，即可将纯度提高到80-85%，合并两次所得的含量在75%以上的样品，用HPLC半制备柱进行制备，最后可得到纯度为90.12%的精品。将精品溶液冷干后，所得微黄色粉末即为侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素效价2567 μ g/L。
[0028]化学修饰:发酵产物分离纯化后和KCl反应，以正丁醇为溶剂，FeCl3为催化剂，通过配位催化卤代反应来制备带侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。反应条件为:侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素:KCl:FeCl3(摩尔比)=20:40:3，溶剂正丁醇的用量为每摩尔侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素40ml，反应温度为105°C，收率为85.7%。
[0029]实施例3
[0030]菌株:以吸水链霉菌海南变种SlOl菌株经自然分离后获得的S510菌株为出发菌株。
[0031]发酵培养基:玉米粉15g、豆饼粉35g、葡萄糖15g、淀粉Sg、氯化铵lg、碳酸钙lg，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.5，氯化钠0.5g，磷酸氢二钠0.lg，加自来水至1000mL。经121 °C高压湿热灭菌20min。
[0032]发酵培养:摇床震荡培养，转速为250转/分钟，发酵温度:35°C，罐压0.01MPa,通气量1:0.5，发酵时间84h。
[0033]发酵产物分离和纯化:发酵液萃取，用S印hadex G_25柱层析，水洗脱，洗脱液经HPLC检测后(C0SM0SILC18Econopak柱，流动相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外检测波长220nm)，将其中保留时间约为5.5min的主要组分含量在75~85%和60~75%的部分分别合并，再经真空冷冻干燥后即可得到初次分离物。含量在60~75%的初提物再经一次常压柱层析，即可将纯度提高到80-85%，合并两次所得的含量在75%以上的样品，用HPLC半制备柱进行制备，最后可得到纯度为90.12%的精品。将精品溶液冷干后，所得微黄色粉末即为侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。
[0034]化学修饰:发酵产物分离纯化后和KCl反应，以正丁醇为溶剂，FeCl3为催化剂，通过配位催化卤代反应来制备带侧链-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效价测定:管碟法。反应条件为:侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素:KCl:FeCl3(摩尔比)=20:40:3，溶剂正丁醇的用量为每摩尔侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素40ml，反应温度为105°C，收率为82.2%。
【权利要求】
1.一种卤代修饰胞苷素的制备方法，其制备方法包括: (1)以不吸水链霉菌为出发菌，在培养基中发酵培养， (2)分离、纯化发酵液， (3)发酵产物经分离纯化后通过FeCl3配位催化卤代反应进行化学修饰得到侧链为-C4H8ClO9的氮取代胞苷素； 所述的菌株:以吸水链霉菌海南变种SlOl菌株经自然分离后获得的S510菌株为出发菌株； 所述的培养基为:玉米粉15~25g、豆饼粉20~35g、葡萄糖15~25g、淀粉8~12g、氯化铵I~5g、碳酸钙I~5g,硫酸镁0.1~0.5g,硫酸亚铁0.1~0.5g,氯化钠0.1~.0.5g,磷酸氢二钠0.1~0.5g，加自来水至1000mL ； 所述的发酵培养的条件为:摇床震荡培养发酵，发酵温度:25~35°C,罐压0.01~.0.15MPa，通气量1:0.5 ~ I，发酵时间50~IOOh ； 所述的发酵产物分离和纯化为:发酵液萃取，用Sephadex G_25柱层析，水洗脱，洗脱液经HPLC检测后(C0SM0SILC18Econopak柱，流动相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min，紫外检测波长220nm)，将其中保留时间约为5.5min的主要组分含量在75~85%和60~75%的部分分别合并，再经真空冷冻干燥后即可得到初次分离物。含量在60~75%的初提物再经一次常压柱 层析，即可将纯度提高到80~85%，合并两次所得的含量在75%以上的样品，用HPLC半制备柱进行制备，最后可得到纯度为90.12%的精品。将精品溶液冷干后，所得微黄色粉末即为侧链-C4H9O9的氮取代胞苷素；效价测定:管碟法； 所述的化学修饰是以KCl为原料，以正丁醇为溶剂。
【文档编号】C12R1/465GK103805655SQ201210442158
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2012年11月7日
【发明者】胡晓, 王理想, 王友志, 郭麦平, 胡丹红, 胡曼曼 申请人:徐州瑞赛科技实业有限公司