本发明涉及医药化学领域，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的不对称双取代靛红席夫碱类化合物及其合成方法。
背景技术：
席夫碱化合物因其独特的结构特征，即核心基团含有带孤对电子的N原子，从而具有很好的配对能力，而该基团两边均可与各种类型的基团反应从而得到性质不一的衍生物，这使得其在实际应用上极具特色，尤其在化学、生物学方面应用广泛。不对称双席夫碱，由于其结构的不对称性，使得拥有很多特殊的用途，如可用作载氧载体、催化剂、杀虫剂、抑菌剂、生物模拟过程的模拟分子等，近年来此类化合物的合成和性质研究也成为化学领域中一个十分活跃的课题。
靛红及其衍生物具有独特的电子特性和优越的生物活性，在抗肿瘤、抗病毒、神经保护等方面的活性有重要意义。靛红目前可以作为工业品大量合成，是相对较便宜的原料，其1、2、3位及苯环上可以发生多种类型的化学反应，为其衍生物的合成提供了广阔的空间，因此目前对靛红及其衍生物的合成和活性的研究非常活跃。
含O、S、N的席夫碱及其金属配合物,以其良好的抑菌、抗癌和抗病毒的生物活性一直受到人们的重视。靛红席夫碱类化合物具有较好的抑菌、抗病毒、神经保护活性。因此，笔者利用7-N杂靛红及其衍生物、靛红及其衍生物和水合肼为原料，设计合成了一类结构新颖的不对称双取代靛红席夫碱类化合物。
技术实现要素：
：
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的不对称双取代靛红席夫碱类化合物及其合成方法，由7-N杂靛红及其衍生物、靛红及其衍生物和水合肼为原料，在乙醇作为反应溶剂的条件下进行合成，原料环保，生产成本低，操作安全性高，反应条件温和，反应原料利用充分，适用于工业化生产，解决了现有技术产率低的问题。
一种具有抗肿瘤活性的不对称双取代靛红席夫碱类化合物，其结构式(I)如下所示：
R1、R2、R3、R4可以为氢、硝基、烷氧基、卤素，取代或未取代的苯基，取代或未取代的低级烷基或环烷基、低级烷基-环烷基、环烷基-低级烷基；
优选R1表示下列基团：氢、硝基、卤素，低级烷基或环烷基，取代或未取代的苯基。
优选R2表示下列基团：氢、硝基、卤素，低级烷基或环烷基。
优选R3表示下列基团：氢、硝基、烷氧基、卤素，低级烷基或环烷基，取代或未取代的苯基。
优选R4表示下列基团：氢、烷氧基、硝基、卤素，低级烷基或环烷基，取代或未取代的苯基。
一种具有抗肿瘤活性的不对称双取代靛红席夫碱类化合物的合成方法，由7-N杂靛红及其衍生物、靛红及其衍生物和水合肼为原料，在乙醇作为反应溶剂的条件下进行合成，合成路线如下所示：
具体的制备过程如下：
1)将适量7-N杂靛红或其衍生物用有机溶剂溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到水合肼的有机溶剂中，加热到60℃～100℃，反应4～8小时；
2)薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体；
3)将上述得到的中间体与靛红或其衍生物按摩尔比1:1～1:2置于反应器中，继续加热、搅拌，60℃～100℃下回流反应2～6小时；
4)TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，然后冷却至室温过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱粗品；
5)将不对称双取代靛红西佛碱粗品加入到反应器中，加入有机溶剂进行重结晶，过滤，干燥得到目标产物。
所述的步骤1)中的有机溶剂优选甲醇或乙醇，进一步优选为乙醇。
所述的步骤1)中的7-N杂靛红或其衍生物与水合肼的摩尔比为1:1～1:2.5，进一步优选为1:1.5～1:2。
所述的步骤1)中的反应时间为5～6小时。
所述的步骤1)、步骤3)中的温度为75℃～85℃。
所述的步骤3)中的中间体与靛红或其衍生物按摩尔比为1:1～1:1.5。
所述的步骤3)中的反应时间为3～4小时。
所述的步骤5)的有机溶剂为乙醇。
结构式(I)部分优选实施方案中的化合物结构式如下所示：
本发明的有益效果是：
原料环保，生产成本低，操作安全性高，反应条件温和，反应原料利用充分，适用于工业化生产，解决了现有技术产率低的问题。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步叙述，但本发明不局限于以下实施。
实施例1
化合物(1)
(Z)-3-((Z)-(5-chloro-1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量1.48g(10mmol)7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与1.95g(10mmol)5-氯-1-甲基靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(1)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到淡黄色结晶性粉末(2.65克)，总收率78.3％。
淡黄色结晶粉末，M.P.182.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),8.0(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.91(1H,s,J＝7.5Hz),7.82(1H,d,J＝7.5Hz),7.52(1H,d,J＝7.5Hz),6.88(1H,t,J＝7.5Hz),3.46(3H,s,J＝7.5Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSOd6)δ(ppm):167.2,163.7,161.8,158.8,139.5,138.6,138.2,131.5,130.2,129.5,124.4,119.2,113.6,111.8,30.3；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:339.0524,found:339.0528.
实施例2
化合物(2)
(Z)-3-((Z)-(1-ethyl-5-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量1.48g(10mmol)7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与1.89g(10mmol)5-甲基-1-乙基靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(2)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到灰白色结晶性粉末(2.21克)，总收率66.4％。
灰白色结晶粉末，M.P.174.4℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),8.23(1H,s,J＝7.5Hz),8.02(1H,s),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.76(1H,d,J＝7.5Hz),7.18(1H,d,J＝7.5Hz),6.91(1H,t,J＝7.5Hz),4.30(2H,q,J＝8.0Hz),2.36(3H,s),1.33(3H,t,J＝8.0Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):167.2,163.4,161.8,158.7,144.6,138.7,138.2,134.7,129.8,120.8,117.7,116.3,113.6,111.8,42.4,21.5,13.9；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:333.1227,found:333.1230.
实施例3
化合物(3)
(Z)-3-((Z)-(1-isopropyl-5-methoxy-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量1.62(10mmol)1-甲基-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与2.19g(10mmol)1-异丙基-5-甲氧基靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(3)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到白色结晶性粉末(2.37克)，总收率62.8％。
白色结晶粉末，M.P.176.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.76(1H,d,J＝7.5Hz),7.50(1H,s,J＝7.5Hz),7.04(1H,d,J＝7.5Hz),6.88(1H,s,J＝7.5Hz),3.95(1H,m,J＝6.8Hz),3.84(3H,s,J＝6.8Hz),3.42(3H,s,J＝6.8Hz),1.21(6H,s,J＝6.8Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.7,163.1,161.8,156.5,153.3,139.8,138.7,138.2,128.2,118.9,113.6,111.8,101.6,58.5,55.9,31.4,20.8；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:377.1489,found:377.1493.
实施例4
化合物(4)(Z)-5-chloro-1-ethyl-3-((Z)-(1-isopropyl-5-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量2.10g(10mmol)1-乙基-5-氯-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与2.03g(10mmol)5-甲基-1-异丙基靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(4)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到灰色结晶性粉末(2.40克)，总收率58.7％。
浅黄结晶粉末，M.P.196.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.34(1H,s,J＝1.5Hz),8.30(1H,d,J＝1.5Hz),8.23(1H,s,J＝7.5Hz),7.76(1H,d,J＝7.5Hz),7.18(1H,d,J＝7.5Hz),4.30(2H,q,J＝6.8Hz),3.96(1H,m,J＝6.8Hz),2.36(3H,s,J＝6.8Hz),1.39(3H,t,J＝6.8Hz),1.22(6H,d,J＝6.8Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.4,160.3,153.1,144.6,138.5,138.2,134.3,129.7,123.8,120.8,117.7,116.2,112.5,58.6,48.9,21.5,20.7,13.8；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:409.1308,found:409.1312.
实施例5
化合物(5)
(Z)-3-((Z)-(5-chloro-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1-ethyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量1.76g(10mmol)1-乙基-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与1.81g(10mmol)5-氯靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(5)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到黄棕色结晶性粉末(2.43克)，总收率68.9％。
黄棕色结晶粉末，M.P.203.9℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),8.1(1H,d),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.91(1H,s,J＝7.5Hz),7.82(1H,t,J＝7.5Hz),7.52(1H,d,J＝7.5Hz),6.87(1H,t,J＝7.5Hz),4.30(2H,q,J＝8.0Hz),1.39(3H,t,J＝8.0Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):169.2,163.4,161.7,153.3,139.5,138.6,138.1,131.4,130.2,129.6,125.4,119.3,113.5,111.8,48.9,13.8；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:377.1489,found:377.1493.
实施例6
化合物(6)
(Z)-3-((Z)-(1-benzyl-5-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-5-chloro-1-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量1.96g(10mmol)1-甲基-5-氯-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与2.51g(10mmol)5-甲基-1-苯乙基靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(6)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到黄色结晶性粉末(2.63克)，总收率59.4％。
黄色结晶粉末，M.P.226.8℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.34(1H,s,J＝1.5Hz),8.30(1H,s,J＝1.5Hz),8.23(1H,s,J＝7.5Hz),7.42-7.12(6H,m,J＝7.5Hz),4.96(2H,s),3.42(3H,s),2.36(3H,s)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.7,160.4,153.0,144.6,138.5,138.2,136.3,134.2,129.8,128.7,127.1,126.8,123.7,120.8,117.7,116.3,112.5,47.4,31.4,21.5；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:443.1151,found:443.1155.
实施例7
化合物(7)(Z)-1-benzyl-5-bromo-3-((Z)-(5-chloro-1-cyclohexyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3H)-one的制备。
将适量3.16g(10mmol)5-溴-1-苯乙基-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与2.63g(10mmol)1-环己基-5-氯靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(7)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到黄色结晶性粉末(4.31克)，总收率74.9％。
黄色粉末，M.P.206.1℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.53(1H,s,J＝1.5Hz),8.09(1H,s,J＝1.5Hz),7.91(1H,s,J＝1.5Hz),7.82(1H,d,J＝1.5Hz),7.51(1H,d,J＝1.5Hz),7.42-7.22(5H,m,J＝7.5Hz),4.79(2H,s),3.56(1H,q),1.82-1.12(10H,m,J＝7.1Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.6,163.1,160.8,155.4,145.6,141.5,138.2,136.3,131.5,130.2,129.6,128.7,127.0,126.8,124.5,119.3,112.9,104.7,64.5,49.6,31.4,25.8,25.3；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:575.0725,found:575.0729.
实施例8
化合物(8)
(Z)-3-((Z)-(5-fluoro-1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1-methyl-1H-pyrrolo[2,3-b]pyr idin-2(3H)-one的制备。
将适量1.62g(10mmol)1-甲基-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与1.79g(10mmol)1-甲基-5-氟靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(8)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到红褐色结晶性粉末(2.42克)，总收率71.8％。
红褐色结晶粉末，M.P.218.4℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.85,7.79(2H,m,J＝7.5Hz),7.36(1H,t,J＝7.5Hz),6.88(1H,t,J＝1.5Hz),3.46(3H,s),3.42(3H,s)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.6,161.8,158.7,153.3,138.6,138.2,136.9,125.2,119.5,118.2,113.5,111.7,111.0,31.3,31.2；HRMS(ESI)for(M+H)+:calcd:337.0974,found:337.0979.
实施例9
化合物(9)
(Z)-1-ethyl-3-((Z)-(5-methoxy-1-methyl-2-oxoindolin-3-ylidene)hydrazono)-1H-pyrrolo[2,3-b]py ridin-2(3H)-one的制备。
将适量1.76g(10mmol)1-乙基-7-N杂靛红用50mL乙醇溶解，置于锥形瓶中，磁力搅拌下缓慢滴加到50mL含有0.75g(15mmol)水合肼的乙醇溶液中，加热到80℃，反应6小时。薄层层析方法跟踪反应至完全，将反应体系的混合液趁热抽滤，用乙醇洗涤，滤液静置析晶得到中间体。所得中间体与1.91g(10mmol)1-甲基-5-甲氧基靛红置于反应器中，加入50mL乙醇，继续加热、搅拌，80℃下回流反应4小时。TCL跟踪至反应完全，停止加热，撤去冷凝装置。将反应体系的固液混合物减压浓缩，冷却至室温后过滤，滤饼用温水洗涤，得到不对称双取代靛红西佛碱(9)粗品。将该粗品加入到反应器中，加入25mL乙醇进行重结晶，过滤，干燥得到白色结晶性粉末(2.87克)，总收率79.2％。
白色结晶粉末，M.P.197.5℃。1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm):8.33(1H,d,J＝7.5Hz),7.96(1H,d,J＝7.5Hz),7.77(1H,d,J＝7.5Hz),7.50(1H,s,J＝7.5Hz),7.06(1H,d,J＝1.5Hz),6.88(1H,t),4.30(2H,q,J＝),3.85(3H,s,J＝1.5Hz),3.46(3H,s,J＝8.0Hz),1.39(3H,t,J＝8.0Hz)；13C-NMR(75MHz,DMSO-d6)δ(ppm):163.7,163.4,161.7,156.5,153.3,138.7,138.2,133.6,128.2,118.8,113.7,111.8,101.6,55.9,48.9,30.3,13.9；HRMS(ESI)for(M+Na)+:calcd:363.1332,found:363.1336.
实施例10
本发明化合物的抗肿瘤活性测试
对本发明的化合物进行了肿瘤细胞增殖抑制试验，试验方法采用常规的MTT法。
细胞株选用：人肝癌细胞(HepG2)，人肺癌细胞(A-549)，人胃癌细胞(SGC-7901)。培养液为DMEM+15％NBS+双抗。
样品液的配制：用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成的100μmol/L的溶液或者均匀的混悬液，然后用DMSO的PBS(-)稀释，最终浓度分别为0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L。
将上市的抗肿瘤药物阿糖胞苷(Ara-C)以同样的条件配成对照品溶液。
细胞培养：贴壁生长肿瘤细胞细胞培养于含10％灭活新生牛血清和青霉素、链霉素(各100万U/L)的1640培养液中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。细胞贴壁生长，每2～3天传代1次，传代时首先倒出培养液，PBS洗2次，胰酶消化后，加入新鲜的培养液吹打均匀，调整细胞至适当浓度移入新的培养瓶中，添加培养液至适量。取对数生长期细胞用于实验。
MTT法检测细胞活性及IC50的测定：
实验原理：活细胞线粒体中脱氢酶能将黄色的MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜(MTT formazan)，并沉积在细胞中，生成的量与活细胞数目成正比，而死细胞没有这种功能。DMSO能溶解蓝紫色结晶物，颜色深浅与所含的量成正比，因此用酶标仪测定的光吸收值可反映细胞存活率。
实验方法：取对数生长期细胞，消化、计数，以2×104/mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μl。培养24小时后，将待测化合物以0.1，1，10，20，40，60，80，100μmol/L浓度处理细胞。实验组每个浓度设5个复孔，以含0.4％DMSO的培养液作对照。药物作用48小时后，去上清，每孔加入100μl MTT(2-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-3，5-二苯基-2H-四唑氢溴酸盐)(1mg/mL)，继续培养4小时，弃上清，每孔加入100μl DMSO，振荡混匀，用酶标仪在570nm处测定吸光度值，采用IC50计算软件求出半数抑制浓度(IC50)。
试验结果详见表1，其中，样品是指相应实施例中制备的不对称双取代靛红席夫碱类化合物，样品编号对应制备实施例中所得到的化合物的具体编号。
表1化合物对不同肿瘤细胞的半数抑制浓度IC50(单位：μmol/L)
化合物5在所测试的3种细胞株中均表现出了良好的抗肿瘤活性，化合物1和8次之，在不同的细胞株中也表现出了良好的抗肿瘤活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肿瘤活性，特别是部分不对称双取代靛红席夫碱类化合物的活性在特定细胞株中抗肿瘤活性优于或等同于阿糖胞苷，可用于抗肿瘤药物的研究。