本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌、筛选方法及用途。
背景技术：
：传统中药白首乌，被历代医家视为养生防老的珍品。现代研究表明，白首乌具有显著的抗肿瘤功效。然而市场上流通的药材需通过大量采挖天然药用植物的块根而获取，此举受地理、季节和植物生长周期的限制。为保护现有野生药物资源，我们期望能够找到具有再生性，可持续发展，对其研究开发无“来源受限”、“采收过度”等问题的困扰的新药用资源。白首乌内生菌与宿主长期共存，与宿主植物具有相同或相似的活性成分，是一种新颖微生物资源，在医药领域具有潜在的应用前景和研究价值。所以，有必要分离筛选出一种具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌。技术实现要素：本发明的目的是提供所述具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.13176，保藏日期为2016年10月21日，该白首乌内生菌ycta-2-z1具有抗肿瘤活性。本发明还提供了一种具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1的筛选方法，包括以下步骤：步骤1，取新鲜的白首乌根，自来水冲洗30min，吸水纸吸干白首乌根表面的水分，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min，无菌滤纸吸干白首乌根表面的水分，得到干净的根系，备用；步骤2，将干净的根系用75％乙醇浸泡5min，然后无菌水冲洗3次，得到醇处理根系；步骤3，将醇处理根系用3g/100ml的naclo3溶液浸泡3min，无菌水冲洗5次，得到消毒根系；步骤4，将消毒根系切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，放置于pda固体培养基上28℃培养3-7天；步骤5，当组织块边缘有菌丝长出后，用接种针挑取少许菌落边缘的菌丝，划线接入到新的pda固体培养基中，28℃培养，直至得到单一菌落；步骤6，将步骤5中挑取的单一菌落划线接入到新的pda固体培养基中，28℃培养，直至得到单一菌落；步骤7，重复上一步骤5-6次，直至分离得到具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1。本发明还提供了一种具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1对人肝癌细胞smmc-7721的增值有较好的抑制作用，对人肺癌细胞a549、人骨肉瘤细胞143b的增殖有一定抑制作用，在制备抗肿瘤药物中具有良好的应用前景。生物材料保藏信息说明1、具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13176，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为小不整球壳菌(plectosphaerellacucumerina)。附图说明图1为本发明内生菌ycta-2-z1菌落形态图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。本发明以下实施例中，若没有特殊说明，所用试剂皆可在市场上购买得到，若没有特殊说明，所涉及的方法皆为常规方法。本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1，所述具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.13176，保藏日期为2016年10月21日。基于同一种发明构思，本发明还提供了上述具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1的筛选方法，包括以下步骤：步骤1，取新鲜的白首乌根，自来水冲洗30min，吸水纸吸干白首乌根表面的水分，无菌水冲洗3次，每次冲洗2min，无菌滤纸吸干白首乌根表面的水分，得到干净的根系，备用；步骤2，将干净的根系用75％(体积分数)乙醇浸泡5min，无菌水冲洗3次，得到醇处理根系；步骤3，将醇处理根系用3g/100ml的naclo3溶液浸泡3min，无菌水冲洗5次，得到消毒根系；步骤4，将消毒根系切成0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，(切取的组织块最好是存在于植物组织内部并除去暴露在外界环境的最外层组织)，放置于pda固体培养基上28℃培养3-7天；步骤5，当组织块边缘有菌丝长出后，用接种针挑取少许菌落边缘的菌丝，划线接入到新的pda固体培养基中(挑取的菌丝块越小越好)，28℃培养，直至得到单一菌落；步骤6，将步骤5中挑取的单一菌落划线接入到新的pda固体培养基中，28℃培养，直至得到单一菌落；步骤7，重复上一步骤5-6次，直至分离得到具有抗肿瘤活性的白首乌内生菌ycta-2-z1。需要说明的是，上述步骤4-7的任一步骤中，每升pda固体培养基中均加入150mg的青霉素和100mg的庆大霉素。下面结合相关实验数据，说明本发明内生菌ycta-2-z1的菌落形态、基因结构特征以及其抗肿瘤活性。一、菌落形态特征将内生菌ycta-2-z1于pda培养基上培养，观察其形态特征，结果如图1所示，菌落较平坦，直径4-5cm，菌落中心微凸，有絮状紧密白绒及褶皱，菌丝呈白色，边缘菌丝色浅。需要说明的是所述内生菌ycta-2-z1的培养条件如下：斜面培养基：pda培养基(1l)配方：马铃薯洗净去皮，切成1cm×1cm×1cm小丁，称取200g，煮沸半小时，八层纱布过滤取汁，加入20.0g葡萄糖，完全溶解后，加白首乌根的汁液200ml，最后蒸馏水定容至1000ml，再加入15-20g琼脂，115℃灭菌20min，自然ph。其中白首乌根的汁液制备方法如下：用解剖刀将新鲜白首乌根50g，去皮，将内部的组织切成细小碎块，置于研钵中，加入10倍体积的pbs和50-60g石英砂，研磨，静置25-35min，取上清液，即得到白首乌根的汁液，备用。斜面培养方法：28℃培养3-7天。二、基因结构特征1、内生菌基因组dna的提取取约0.05g菌丝样品，加入液氮后研磨致粉碎，加1ml尿素抽提缓冲液混匀后装入2mldorf管，离心(12000rpm,5min)，取上清液，重复离心一次，取上清转移至新dorf管中，加入等体积的酷：氯仿：异戊醇(25:24:1)混合液，用力震荡数次，再次离心(12000rpm,5min)后转移至新管中，加入等体积的异丙醇，-20℃放置20min以使核酸完全沉淀，然后离心(12000rpm,5min)，弃上清，倒置使管壁液体流尽，然后用70％酒精洗，室温放置10min待酒精挥干后溶于20μl双蒸水中，加rnase酶(10μg/μl)2μl使rna降解，37℃水浴30min，所提dna放入-20℃冰箱保存备用。2、its序列的pcr扩增及测序对所述内生菌ycta-2-z1菌株进行its序列的pcr扩增及测序，序列如下：：atacctgttgcttcggcggcgcccgcgagggtgcccgccggtctcatcagaatctctgttttcgaacccgacgatacttctgagtgttcttagcgaactgtcaaaacttttaacaacggatctcttggctccagcatcgatgaagaacgcagcgaaacgcgatatgtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacatggcgccttccagtatcctgggaggcatgcctgtccgagcgtcgtttcaaccctcgagcccccgtggcccggcgttggggatctgccacggcaggcccctaaaaccagtggcggacccgaaggccctctcctttgcgcagtagcatcagcctcgcattgggatccctcggcgtcctgcctctaaaccccccacaagtccgctccggcggcaccaaggttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaa测得的its全序列已向美国国家生物技术信息中心(ncbi)的genbank基因序列数据库提交，登陆号为kx901797。将测得的序列于ncbi中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi进行同源性搜索比对，并使用blastn2.2.31系统在genbank中进行同源性搜索，发现序列相似度最高的为plectosphaerellacucumerinaycta2z1菌株，序列相似度为100％，表明该菌株属于小不整球壳菌属。三、内生菌ycta-2-z1的抗肿瘤活性实验：1、细胞株材料人肺癌a549细胞株，人肝癌smmc-7721，人骨肉瘤143b细胞，均购自中国科学院上海细胞生物学研究所。2、实验方法2.1、菌株培养挑取斜面内生菌ycta-2-z1种子，接种于pda液体培养基中，用250ml锥形瓶培养，每升pda液体培养基中均加入150mg的青霉素和100mg的庆大霉素，培养液ph＝7.5，在28℃恒温摇床(140rpm/s)培养3d，得到细胞发酵液。发酵液用正丁醇萃取，用旋转蒸发仪于55℃蒸干萃取物，用时将萃取物分别用dmem培养基(购自南京凯基，kgm31600-500)和1640培养基(南京凯基，kgt525250)配制成浓度分别为200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、80μg/ml、75μg/ml、60μg/ml、50μg/ml、40μg/ml、25μg/ml、20μg/ml、10μg/ml的内生菌发酵液萃取物，备用，该利用旋转蒸发仪于55℃蒸干得到的萃取物可以用于制备抗肿瘤药物。2.2、细胞培养按常规方法制备对数期生长的人肺癌a549细胞，对数期生长的人肝癌smmc-7721细胞和对数期生长的人骨肉瘤143b细胞。2.3、细胞增殖抑制率的测定取对数生长期的人肺癌a549细胞、人肝癌smmc-7721细胞和人骨肉瘤143b细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的dmem培养基调整细胞密度2×104个/ml，接种至96孔培养板中，每孔200μl细胞悬液，继续培养24h后，吸弃培养液，选取其中一孔加入含0.1％dmso的dmem培养液作为人肺癌a549细胞和人骨肉瘤143b细胞的溶剂对照，选取另一孔加入含0.1％dmso的1640培养液作为人肝癌smmc-7721细胞的溶剂对照，其他孔分别加入不同浓度的内生菌发酵液萃取物，每个浓度设6个复孔，并设空白调零孔。分别继续培养24h、48h和72h后，每孔加入20μlmtt(5g·l-1)，继续培养4h(如果研究24h时间的影响，则培养24h后加入mtt；如果研究48h时间的影响，则培养48h后加入mtt；如果研究72h时间的影响，则培养72h后加入mtt)，吸弃上清，每孔加入150μldmso，振荡10min，溶解结晶，用酶标免疫检测仪测定570nm波长处的吸光度(a)，630nm为参考波长。实验重复3次，取平均值。以溶剂处理为对照组，由吸光度计算生长抑制率，细胞生长抑制率(％)＝(a对照-a用药)/a对照×100％。半数抑制浓度(ic50)是用probitanalysismethod计算的，通常为了得到ic50的值，我们需要做一系列的待测样品浓度，得到这些浓度下的细胞生长抑制率，并通过spss软件求出半数抑制浓度(ic50)。其中，计算对人肺癌a549细胞的抑制24h的ic50时，利用200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的内生菌发酵液萃取物检测对细胞的生长抑制率；计算对人肺癌a549细胞抑制48h或者72h的ic50、以及计算对人肝癌smmc-7721细胞、人骨肉瘤143b细胞抑制24h、48h或者72h的ic50时，均利用200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml的内生菌发酵液萃取物检测对细胞的生长抑制率。3、实验结果3.1、对三种细胞株增殖的影响将不同浓度的ycta-2-z1内生菌发酵液萃取物分别作用于人肝癌smmc-7721细胞、人肺癌a549细胞、人骨肉瘤143b细胞24h，48h和72h后，用mtt法检测细胞的存活情况，ic50见下表。表1内生菌ycta-2-z1抑制三种细胞增殖的ic50(μgml-1,n＝3)24h48h72h人肝癌smmc-7721细胞28.82±6.5216.78±2.7112.30±4.46人肺癌a549细胞94.54±8.1278.01±6.3162.42±9.05人骨肉瘤143b细胞59.60±7.7843.52±5.6733.24±4.85实验结论结果表明，ic50越小说明抑制作用越明显，由表1可知，ycta-2-z1对人肝癌细胞smmc-7721的增值有较好的抑制作用，对人肺癌细胞a549、人骨肉瘤细胞143b的增殖有一定抑制作用，并且抑制率具有一定浓度、时间依赖性。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12